CN103045755B

CN103045755B - 一种检测埃博拉病毒的荧光定量pcr检测方法及其引物和试剂盒

Info

Publication number: CN103045755B
Application number: CN201110312915.2A
Authority: CN
Inventors: 马志永; 史子学; 魏建超; 邵东华; 王少辉; 李蓓蓓; 刘阳; 王宗尧
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2031-10-14
Also published as: CN103045755A

Abstract

本发明公开了一种检测埃博拉病毒(EBOV)的荧光定量PCR检测方法及其引物和试剂盒。本发明是一种通用型检测方法，只要待检样品中有Z、S、B、C、R五种亚型EBOV中的任何一种或者多种同时存在，就能检测出来阳性。本发明利用PCR技术的核酸高效扩增、SYBR？Green？I荧光染料和计算机辅助荧光检测技术敏感性的优点，克服了常规PCR检测的不足，极大的提高了检测的敏感性、特异性和操作的便利性。同时，本发明中采用的阳性对照是NP基因体外转录的一段RNA分子，相对于以灭活病毒液作为阳性对照的检测，增加了安全性。体外转录的RNA分子还可以大量制备，阳性对照来源稳定、可靠。

Description

一种检测埃博拉病毒的荧光定量PCR检测方法及其引物和试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种埃博拉病毒SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法。

背景技术

埃博拉出血热(Ebolahemorrhagicfever，EHF)是由埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)引起的，主要以人和非人类灵长类动物为易感动物的急性出血性传染病。该病1976年首次发生于埃博拉河流域的刚果民主共和国(前扎伊尔)，因感染者全身呈出血症状，故命名为埃博拉出血热。据推测最初人类感染EBOV主要是因为人类接触感染了病毒的动物宿主或者间接宿主的身体。在这之后人与人之间通过直接接触已经感染了病毒的人的身体进行传播。在经历一段2-21天的潜伏期之后，感染病毒的病人就会出现一些发热的症状。EHF的主要特征是迅速发热，寒冷，头痛和肌肉疼痛，之后会产生咽喉肿痛，恶心，呕吐，腹泻以及腹痛。大约一半的病人会出现出血症状，例如从鼻孔出血，出现血尿或者是胃肠出血和阴道出血。EHF目前为止主要呈现地方性流行，绝大部分集中于非洲。非洲以外地区偶有病例报道，均属于输入性或实验室意外感染，未发现有EHF流行。EBOV已经被证实是通过体液传播的，如口腔和结膜接触传播，这在非人灵长类动物试验已确证。自然界的动物各种行为和其它因素都有可能造成EBOV的爆发。为了防止EBOV进入我国，对我国的经济以及人身安全造成严重的损失，目前我国急需建立一种快速、准确、敏感的检测方法。

EHF的病原是EBOV，属于丝状病毒科(Filoviridae)丝状病毒属(Filovirus)成员，是非分节段的单股负链RNA病毒。目前已鉴定的埃博拉病毒有5种亚型，分别是：EBOV-扎伊尔型(Ebola-Zaire，简称EBOV-Z)，EBOV-苏丹型(Ebola-Sudan简称EBOV-S)，EBOV-本迪布焦型(Ebola-Bundibugyo，简称EBOV-B)，EBOV-科特迪瓦型(Ebola-IvoryCoast，简称EBOV-C)，EBOV-莱斯顿型(Ebola-Reston，简称EBOV-R)。感染EBOV-Z，EBOV-S和EBOV-B的致死率大约在25％-90％。EBOV属于我国必须严密监控其传播入我国的急性烈性外来人兽共患传染病，建立一种敏感、特异的，能够同时检测EBOV5种亚型病毒的检测方法对我国EBOV的防控工作具有重要意义。

荧光定量PCR具有快速、敏感和高通量的特点，SYBRGreenI荧光定量PCR利用SYBRGreenI能结合到双链DNA的小沟部位放出荧光的方法广泛应用于核酸的特异性检测。在EBOV的检测方法研究领域，IgG-捕获ELISA和IgM-捕获ELISA是仅有的两类常用检测方法，建立一种敏感、特异的，同时针对5种亚型EBOV的荧光定量PCR方法更具有重要的实践意义。

经对现有技术的文献检索发现，国内没有EBOV检测技术的专利公布。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对没有EBOV荧光定量PCR检测技术的问题，提供一种EBOV5种亚型的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。该方法检测的敏感性可达到100个拷贝的病毒RNA分子，对于单个样本检测小于2个小时，操作简易，可以进行高通量的样品检测。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明的技术方案一为，一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子，所述的遗传标记分子是埃博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸中连续的50-273个核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸中连续的50-196个，优选196bp个核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株ZaireEbolavirusstrainMayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。所有的埃博拉病毒NP基因等位基因在上述位置范围内的核苷酸片段都是本发明保护的检测埃博拉病毒的遗传标记。

优选的，所述的遗传标记分子是博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株ZaireEbolavirusstrainMayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。

更优选的，所述的遗传标记分子是SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、或SEQIDNO：5所示序列的核苷酸。

本发明的技术方案二为，一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子的引物对，所述的引物长度25-38个核苷酸，且一个与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、或SEQIDNO：5所示序列相同，另一个相应的与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、或SEQIDNO：5所示序列互补，并且扩增产物的长度为50-300bp，优选297bp。

优选的，所述的引物对中，一条引物的序列是SEQIDNO：6、另一条是SEQIDNO：7；或者一条是SEQIDNO：8、另一条是SEQIDNO：9；或者一条是SEQIDNO：10、另一条是SEQIDNO：11；或者一条是SEQIDNO：12、另一条是SEQIDNO：13；或者一条是SEQIDNO：14、另一条是SEQIDNO：15。

本发明的技术方案三为，一种检测埃博拉病毒的引物对，该引物对中，引物长度15-30bp，更佳的是20-22，其中一个引物含有一到两个简并碱基，该简并碱基分别和Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点相同，该引物中该简并碱基以外的序列与Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列相同或有个别不同，但是不影响PCR扩增反应；另一个引物也含有一到两个简并碱基，该简并碱基分别和Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点互补，该引物中该简并碱基以外的序列与Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列互补或有个别不互补，但是不影响PCR扩增反应，该引物对的扩增片段为70-300bp。

优选的，所述的引物对中，一条是SEQIDNO：16所示序列的核苷酸，另一条是SEQIDNO：17所示序列的核苷酸。该引物对的扩增片段为196bp。

本发明的技术方案四为，一种检测埃博拉病毒的PCR试剂盒，该试剂盒包括如上所述的本发明的引物。

优选的，所述的试剂盒还包括：阳性对照品、阴性对照品、RNA提取试剂、反转录试剂、和SYBRGreenI荧光定量反应液。

本发明的技术方案五为，一种检测埃博拉病毒的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

1)提取待检样品的RNA；

2)将上述提取的RNA反转录成cDNA；

3)将上述cDNA加入荧光定量反应液中用实时荧光PCR仪进行扩增检测；

4)通过比较待检样品和标准品的循环阈值而对待检样品的其实拷贝数进行定量。

本发明的技术方案六为，一种埃博拉病毒NP基因的用途，其用于制备埃博拉病毒的遗传标记分子。

本发明的技术方案七为，本发明所述的检测埃博拉病毒的遗传标记分子作为埃博拉病毒的特征序列在常规非生物安全P4级实验室中检测埃博拉病毒的应用。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明采用的EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测方法利用了PCR技术的核酸高效扩增、SYBRGreenI荧光染料和计算机辅助荧光检测技术敏感性的优点，克服了常规PCR检测的不足，具有极大的优点。(1)通用性好。本发明可以同时检测5种亚型的EBOV，只需要一次反应就可以特异性的检测EBOV。只要待检样品中有Z、S、B、C、R五种亚型EBOV中的任何一种存在或者多种同时存在，就能检测出来阳性。(2)敏感性高。由于荧光定量PCR利用扩增产物的积累和荧光信号建立对应关系，计算机辅助设备接受荧光信号并判定结果。检测敏感性比常规PCR更高。(3)操作简单、高通量、防污染。使用荧光定量PCR检测，不需要打开反应管盖进行琼脂糖电泳，不易污染后续待检测样品。操作简单，适合高通量大规模样品检测。(4)节约时间。荧光定量PCR扩增产物较短，不需要PCR产物的延伸时间，整个实验可以更快速完成。(5)安全性高。本发明中采用的阳性对照是根据EBOV五种亚型病毒NP基因序列体外转录的一段273nt的RNA分子，相对于以灭活病毒液作为阳性对照的检测，增加了安全性，体外转录的RNA分子还可以大量制备，阳性对照来源稳定、可靠，避免了灭活病毒株在每次实验中带来的可能生物安全风险。(6)EBOV属于我国必须严密监控其传播入我国的急性烈性外来人兽共患传染病，本发明建立的敏感性高、特异性强、安全性好，能够同时检测EBOV5种亚型病毒的检测方法对我国EBOV的防控工作具有重要意义。(7)本发明是一种通用检测方法，在一次PCR检测中就可以检测五种亚型EBOV。只要待检样品中有五种亚型EBOV中的任何一种存在或者多种同时都存在，就能检测出来阳性。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是引物序列与EBOV、MARV、XFHV、DHFV相应基因比对结果。

图2是EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测方法特异性扩增曲线。

图3是EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测方法敏感性扩增曲线。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，从埃博拉病毒的NP基因中发现较合适的扩增序列。其中，NP为主要的核衣壳蛋白。NP蛋白对于核衣壳组成至关重要。核衣壳是病毒吸附、侵入宿主细胞的主要功能者，与致病性关系重大，也是引起宿主细胞抗体反应的关键。因此，选择这一NP基因序列作为引物，具有很好的特征性。

由于埃博拉病毒的传染性和致病性极强，埃博拉病毒的实验必须在生物安全4级实验室内操作。目前世界上具备上述条件的实验室为数不多。本发明发现埃博拉病毒NP基因的某一片段是埃博拉病毒的特征序列，可以代表埃博拉病毒而与其他病毒区分开来。而这一核苷酸片段没有任何传染性或致病性，可以在普通实验室中应用，而不必在生物安全4级实验室内操作。由此本发明建立了一种在世界上非P4级实验室可以用的检测方法，可应用于调查我国人或动物是否感染了EBOV。

特异性遗传标志物

目前埃博拉病毒共有5种亚型，该5种亚型的多个埃博拉病毒株的NP基因进行同源性比较结果表明，5种亚型间基因序列同源性大于65％，亚型内部不同毒株序列同源性95％以上，亚型间的差异区域集中在固定的点。

虽然通过同源性比较，NP基因的全长基因中有多个区域可以作为5种亚型埃博拉病毒的各个亚型的特异性标志区域。但是SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5所示的核苷酸序列是特别优选的分别适合作为EBOVZ、S、B、C、R的特异性遗传标志的序列。因此，基于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5，本发明提供了各型埃博拉病毒的阳性标准分子。还提供了特异性扩增这些阳性标准分子的引物对，所述的引物长度25-38个核苷酸，且一个与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、或SEQIDNO：5所示序列相同，另一个相应的与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、或SEQIDNO：5所示序列互补，并且扩增产物的长度为50-300bp，较佳的如297bp、196bp。例如，SEQIDNO：6与SEQIDNO：1所示的序列相同，而另一个引物SEQIDNO：7与SEQIDNO：1所示的序列互补，且扩增产物的长度为297bp。这些引物序列优选SEQIDNO：6～15所示。

引物对

本发明人根据5种亚型埃博拉病毒的NP基因特异性标志片段，利用他们之间序列上的共同点及其差异，设计了引物对。该引物对在目前所有的五种埃博拉病毒标准株中扩增出相应的DNA片段，而未在其他相关病毒，包括马尔堡病毒、新疆出血热病毒、登革热病毒、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒中扩增出相应片段，说明以NP基因片段为基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。并且该引物对可以在一个反应体系中同时对五种亚型埃博拉病毒进行检测。在一次PCR反应中，就可以鉴定样品中是否含有埃博拉病毒病毒。只要待检样品中有五种亚型埃博拉病毒中的任何一种存在或者多种同时存在，就能检测出来阳性。

就敏感性而言，本发明以NP基因特异性标志片段为基础设计的PCR反应系统能够检测到10²个阳性标准分子/μl。本发明检测的敏感性可达到100个拷贝的病毒RNA分子(体外转录获得)，对于单个样本检测小于2个小时，操作简易，可以进行高通量的样品检测。

本发明的引物对对于五种亚型EBOV中的任何一种都可以特异性扩增得到产物，而对其他序列不能特异性扩增，从而可以一次性检测出待检样品中是否含有五种亚型EBOV中的任何一种或者多种RNA。该引物对中，引物长度25±5nt，更佳的是20±2bp，其中一个引物含有一到两个简并碱基，该简并碱基分别和Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点相同，该引物中该简并碱基以外的序列与Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列相同或有个别不同，但是不影响PCR扩增反应；另一个引物也含有一到两个简并碱基，该简并碱基分别和Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点互补，该引物中该简并碱基以外的序列与Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列互补或有个别不互补，但是不影响PCR扩增反应，该引物对的扩增片段为70-300bp。优选的，所述的引物对中，一条是SEQIDNO：16所示序列的核苷酸，另一条是SEQIDNO：17所示序列的核苷酸，该引物对的扩增片段为196bp。

本发明所述的特异性扩增埃博拉病毒的引物，可根据本发明的遗传标记物的序列(SEQIDNO：1～5)进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得，例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成。

本发明所述的引物具有很好的亚种特异性。用本发明的引物进行常规RT-PCR反应，结果能从含有埃博拉病毒RNA材料中扩增出大小196bp的产物。因此，以本发明引物进行常规PCR反应，并通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速的检测埃博拉病毒，而且所需的样品量很少。

试剂盒

将本发明的引物与荧光染料技术结合，便得到了本发明的埃博拉病毒的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。这种方法不仅克服了常规PCT方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。

为了增加对埃博拉病毒定量的功能，还可以使用荧光定量PCR。可以采用嵌合荧光染料法，采用荧光染料SYBRGreenI。SYBRGreenI是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。在PCR反应过程中，当SYBRGreenI与扩增产生的双链DNA结合，通过测定荧光强度，即可确定双链DNA的含量。SYBRGreenI特别是能用于所有PCR反应体系，无需荧光探针，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。并且在PCR结束后可直接进行融解曲线反应分析。通过融解曲线的分析，能判断是否存在着变异或非特异性的扩增。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

在一优选例中，一种快速定量检测埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括特异性扩增埃博拉病毒遗传标记分子的引物和荧光探针。优选的如引物序列为SEQIDNO：16和SEQIDNO：17。

该试剂盒较佳的还包括阳性对照品，阴性对照品。其中，阳性对照品是埃博拉病毒的遗传标记核苷酸，优选SEQIDNO：1～5所示序列核苷酸中的任何一种或多种。阴性对照品是马尔堡病毒、新疆出血热病毒、或者登革热病毒的NP基因为基础的遗传标记核苷酸。或者是乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖或呼吸综合征病毒的培养物。该试剂盒较佳的还包括定量校准品。本发明中所述的定量标准品是阳性对照分子SEQIDNO：1(选择本发明所述的5种亚型病毒阳性对照分子都可以)，定量时采用SEQIDNO：1的10倍梯度水稀释液，稀释度从10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8。在荧光定量PCR中，由于每个稀释度中RNA分子不同，得到的Ct值就不同，根据定量标准品(梯度稀释的阳性对照分子)Ct值定量样品中的病毒RNA分子。

该试剂盒较佳的还包括常规的两步法RT-PCRSYBRGreenI荧光定量检测试剂盒所包含的成分，如包括RNA提取试剂、反转录试剂、SYBRGreenI荧光定量检测试剂。其中较佳的，RNA提取试剂含有Trizol、RNA酶抑制剂。反转录试剂含有逆转录酶(AMV)、AMV缓冲液。AMV缓冲液含有dNTPs、随机引物、RNA酶抑制剂、无菌双蒸水。SYBRGreenI荧光定量检测试剂含有SYBRGreenI荧光定量反应液，其中包括SYBRGreenI荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、TaqDNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl₂溶液。

本试剂盒采用了SYBRGreenI嵌合荧光法进行RealTimePCR的专用试剂，可快速对目的基因进行定量检测。较佳的，本试剂盒提供的SYBRGreenI荧光定量检测试剂中含有反应液荧光定量组合物，其包含了引物、Taq酶等所有组份。使用时只需加入模板即可进行PCR反应，操作非常快捷简单。

荧光可以被定量PCR仪内的荧光信号采集系统检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量成正比例关系。对埃博拉病毒的定量可以通过与定量标准品的循环阈值(Ct，ThresholdCycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数。Ct值与起始模板数成一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多；相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用梯度稀释标准品的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可以准确测出该样品的起始拷贝数。

本发明的检测埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，通过对各组分，如引物浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等的优化，反复实验，试剂盒完全可以满足快速特异检测埃博拉病毒的实际需求。

本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒检测埃博拉病毒的方法，该方法包括以下步骤：

1)提取待检样品的RNA；

2)将上述提取的RNA反转录成cDNA；

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

以下实施例中，T7RiboMAX^TMExpressRNAiSystem试剂盒购自上海吉泰生物科技有限公司。dNTPs、dUTP、SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)试剂盒、AMV、RNA酶抑制剂购自大连宝生物工程有限公司。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。荧光定量PCR仪是Mactercyclereprealplex4(EffendorfInc.)。ND-1000微量紫外可见分光光度计购自NanoDropTechnologies，Inc.。

实施例1引物设计

一、实验步骤

EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR引物指的是：长度25±5nt的寡核苷酸链，其与EBOV的Z、S、B、C、R5种亚型病毒NP基因序列完全相同或者互补。

根据NCBI基因数据库中公布的EBOV和MARV、XFHV、DHFV的NP基因序列(参考毒株信息见表1)，利用引物和探针设计软件PrimerExpress2.0(美国应用生物系统公司)设计了对Z、S、B、C、R5种亚型EBOV特异性的引物。引物序列见表2，表2中引物基因位置指在ZaireEbolavirusstrainMayinga(NCBI登录号AF499101.1)基因上位置。设计的引物与EBOV、MARV、XFHV、DHFV相应基因序列比对结果见图1。

表1.设计引物和探针参考的毒株信息

表2.EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR的引物

二、实验结果

该设计的引物中，上游引物引入了2个简并碱基，下游引物引入了一个简并碱基，能保证特异性的扩增5个亚型EBOV基因序列。设计的引物相对于MARV、XHFV、DHFV相应序列都存在6个以上的碱基错配，不能有效扩增这些病毒的序列。引物序列经NCBIblast比对，与EBOV基因组中NP基因以外的序列的同源性低于40％，不会对EBOVNP基因以外序列非特异扩增。

实施例2RNA阳性标准分子和阴性标准分子的制备

一、实验步骤

1、5种亚型EBOV、以及马尔堡病毒(marburgvirus，MARV)、登革热病毒(denguevirus，DHFV)、新疆出血热病毒(xinjianghemorrhagicfevervirus，XHFV)(参考的毒株见表3)，按照登录号所示的序列，由南京金思特科技有限公司完全人工合成它们的全长NP基因cDNA。MARV、XHFV、DHFV作为阴性标准分子。

表3.人工合成全长NP基因cDNA参考的毒株信息

2、根据实施例1设计合成的引物(见表1)，沿EBOVNP基因序列引物扩增区域分别向外延长至273nt，设计上游引物和连接T7启动子序列的下游引物，引物序列见表4。该引物序列在ZaireEbolavirusstrainMayinga(登录号AF499101.1)基因上位置见图1。

3、以人工合成的五种亚型EBOV、以及MARV、XHFV、DHFV的全长NP基因cDNA为模板，用表4的引物PCR扩增分别得到各病毒297bp(含T7启动子序列)的NP基因DNA片段。

表4.病毒NP基因片段体外转录引物序列

注：双下划线字体为T7启动子序列。T7启动子序列全长“GGATCCTAATACGACTCACTATA”，RNA聚合酶结合T7序列后，从“TATA”后的序列就开始合成模板链的互补的RNA了。T7启动子是RNA聚合酶识别的基因序列。T7启动子序列只是结合RNA聚合酶，这段序列不会转录出RNA。

4、在扩增得到的20.0μLPCR产物中加入5.0μL高压灭菌的3M醋酸钠(pH5.2)，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置10min，12000r/m离心10min，弃去上清液，用1000μL70％乙醇洗涤沉淀，弃去上清液，沉淀于室温干燥10min，加入无DNA酶、无RNA酶的水50μL充分溶解沉淀，用紫外分光光度计测定DNA浓度。用以体外转录。

5、按T7RiboMAX^TMExpressRNAiSystem说明书进行体外转录，DNA模板加入量2μg，体外转录反应体系配制见表5。

表5.T7转录体系的配制

组分	体积
		RiboMAX^TM Express T7 2×Buffer	10.0μl
DNA片段	4.0μL(2μg)
		无RNA酶的水	4.0μl10 -->
Enzyme Mix，T7 Express	2.0μl
		总体积	20.0μl

按如下体外转录：37℃反应1h，加入无RNA酶的DNA酶1.0μl(1U)，37℃30min。加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)，加入等体积的异丙醇，混匀后冰浴5min，14000×g离心10min，小心吸去上清液，500μl70％乙醇洗涤沉淀，吸去上清液，沉淀于室温干燥10-15min，加入100μl水充分溶解沉淀，紫外分光光度计测定RNA浓度，计算每微升溶液中RNA分子拷贝数。测定方法为：体外转录RNA分子长273nt，每个碱基平均分子量是330，阿伏伽德罗常熟(每mol的微粒数)6.02×10²³个/mol，已知浓度的RNA单位体积中模板数公式为：分子数(个/μl)(RNA浓度×6.02×10²³个/mol)/[273bp×330g(mol×bp)]。测定含量后小份分装，-80℃保存备用。即为5种亚型EBOV、以及MARV、DENV、XHFV由NP基因而来的273nt长的RNA分子，作为以下实验的阳性标准分子和阴性标准分子。

实施例3样本RNA的提取

一、实验步骤

组织样品处理：取待检组织样品(如肝脏、肾脏)100mg左右置研磨器中加入1000μLDEPC水研磨。取100μL已研磨好的待检组织上清，置1.5mL灭菌离心管中，加入1000μLTrizol，混匀，静置10min。

液体样品处理：取待检液体样品(如血液、鼻部拭子的生理盐水稀释物、呼吸道分泌物的生理盐水稀释液)100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入1000μLTrizol，混匀，静置10min。加入200μL三氯甲烷，强力摇震15s，室温静置2～3min，4℃，12000g离心15min。小心吸取上层清液450μL至另一洁净无DNA酶无RNA酶的1.5mL离心管内，加入650μL异丙醇，上下颠倒几次，室温静置10分钟。4℃，12000g离心15分钟。弃去上清液，加入4℃预冷的750μL75％乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心6分钟，弃去上清，沉淀室温干燥至近似透明。加入DEPC水20μL(含RNA酶抑制剂20U)溶解RNA，-80℃保存或继续PCR。

实施例4EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测方法的建立和优化

一、实验步骤

1、将RNA反转录为cDNA

以实施例2所得的EBOV-Z的273nt长的RNA分子为模板，进行反转录。反转录体系配制如下：模板RNA10μL、AMVBuffer4μL、dNTPs(2.5mM)1μL、随机引物(10μM)1μl、RNA酶抑制剂0.5μl、AMV0.5μl，无RNA酶水3μl。反转录反应条件为：42℃，1h；95℃，5mins。随机引物是商品化产品。随机引物将任意RNA反转录为cDNA。

2、EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测方法的建立和优化

以得到反转录产物cDNA为模板，采用实施例1所得的引物(见表2)，按照SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)试剂盒说明书进行EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR。通过100-1000nM范围内各个浓度引物的组合，寻找具有较优反应效率和曲线的反应体系和反应条件。每个样品3个重复，阴性对照模板以MARV的NP基因体外转录的273ntRNA分子代替，空白对照模板以水代替。

二、结果

1、结果分析条件设定

阈值设定原则以阈值线刚好高于阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示为准。或可以根据仪器噪音情况进行调整。

2、质控标准

(1)空白对照无Ct值，且无规则扩增曲线。

(2)阳性对照Ct值应＜35.0，扩增曲线典型。否则，此次实验无效。

3、结果判定

(1)阴性

无Ct值并且无规则扩增曲线，表示样品中无EBOV基因组。

(2)阳性

Ct值≤35.0，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在EBOV基因组。

(3)有效原则

Ct值＞35.0的样品须重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

4、实验结果

经过优化，EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测反应体系见表6，反应条件见表7。

表6.优化后EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测的反应体系

表7.优化后EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测的反应条件

实施例5EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测的特异性

一、实验步骤

1、其他病毒的RNA提取

乙型脑炎病毒(JEV，SA14-14-2疫苗毒株)，购买自辽宁成大生物技术有限公司乙型脑炎病毒疫苗，按照说明书加生理盐水稀释。猪瘟病毒(CSFV，HCLV疫苗毒株)，购买自哈尔滨维科生物技术开发公司疫苗，按照说明书加生理盐水溶解。猪流感病毒(SIV，疫苗毒株)，购买自Intervet公司的End-FLUence(withImugen)疫苗，直接用于本实施例。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，CH-1R疫苗毒株)，购买自哈尔滨维科生物技术开发公司疫苗，按照说明书加生理盐水溶解。将该4种病毒按实施例3中液体样品的提取步骤提取RNA。

2、EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测

分别将实施例2所得的阳性标准分子(EBOV五种亚型的NP基因体外转录的273nt长的RNA)和阴性标准分子(XHFV、MARV、DHFV的NP基因体外转录的273nt长的RNA)和上述4种病毒RNA反转录为cDNA，然后以此作为模板，进行EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测。其中，采用实施例1所得的引物(见表2)，采用实施例4所得的经过优化的反应体系(见表6)和反应条件(见表7)。每个样品2个重复，空白对照组模板以水代替。

二、结果

1、阈值设定原则、质控标准、阴性阳性判定方法、有效原则同实施例4。

2、实验结果

(1)分别检测以下样品：阳性标准分子(EBOV五种亚型的NP基因体外转录的273nt长的RNA)、阴性标准分子(XHFV、DHFV的NP基因体外转录的273nt长的RNA)、乙型脑炎病毒(JEV，SA14014-2疫苗毒株)、猪瘟病毒(CSFV，HCLV疫苗毒株)、猪流感病毒(SIV，疫苗毒株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，疫苗毒株)，扩增曲线见图2。

(2)从扩增曲线可知，EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR能特异性的检测EBOVNP基因阳性标准分子，检测结果为阳性。其它样品没有规则扩增曲线，检测结果为阴性。

实施例6EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测的敏感性

一、实验步骤

1、将实施例2所得的EBOV-Z的NP基因体外转录的273ntRNA分子用无RNA酶水10倍梯度稀释，从10¹-10¹⁰，每个稀释度中含有RNA分子数分别为10¹⁰-10¹个RNA分子/μl，得到稀释的阳性标准分子。

2、分别将稀释的阳性标准分子反转录为cDNA，然后以此作为模板，进行EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测。其中，采用实施例1所得的引物(见表2)，采用实施例4所得的经过优化的反应体系(见表6)和反应条件(见表7)。阴性对照模板以MARV的NP基因体外转录的273ntRNA分子代替，空白对照模板以水代替。

二、结果

2、实验结果

(1)能够检测到10²个阳性标准分子/μl，其Ct值小于35。10¹个RNA分子组和空白对照组无规则扩增曲线。全部样品扩增曲线见图3。

实施例7EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR用于临床样品的检测

一、实验步骤

将实施例2所得的EBOV-Z的NP基因体外转录的273nt长的RNA分子用无RNA酶水10倍梯度稀释，取含有RNA分子数10⁶的样品作为强阳性对照，10²个RNA分子的样品作为弱阳性对照。

采集野生动物，野猪、猴子血液样品，鼻部拭子的生理盐水稀释样品，呼吸道分泌物的生理盐水稀释液，或病、死野猪、猴子解剖取肝脏、肾脏等组织样品，按照实施例3提取RNA(所用研磨器及所有接触到临床样品的实验器材都高压消毒)。

将提取的临床样品的RNA反转录为eDNA，然后以此作为模板，用上面稀释的RNA分子作为对照模板，进行EBOVSYBRGreenI荧光定量PCR检测。其中，采用实施例1所得的引物(见表2)，采用实施例4所得的经过优化的反应体系(见表6)和反应条件(见表7)。阴性对照模板以MARV的NP基因体外转录的273ntRNA分子代替，空白对照模板以水代替。

二、结果

2、实验结果

阴性。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子，其特征在于，所述的遗传标记分子是博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株ZaireEbolavirusstrainMayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。

2.一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子的引物对，其特征在于，所述的引物对中，一条引物的序列是SEQIDNO:6、另一条是SEQIDNO:7；或者一条是SEQIDNO:8、另一条是SEQIDNO:9；或者一条是SEQIDNO:10、另一条是SEQIDNO:11；或者一条是SEQIDNO:12、另一条是SEQIDNO:13；或者一条是SEQIDNO:14、另一条是SEQIDNO:15。

3.一种检测埃博拉病毒的引物对，其特征在于，所述的引物对中，一条是SEQIDNO:16所示序列的核苷酸，另一条是SEQIDNO:17所示序列的核苷酸。

4.一种检测埃博拉病毒的PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求3所述的引物对。

5.如权利要求4所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：阳性对照品、阴性对照品、RNA提取试剂、反转录试剂、和SYBRGreenI荧光定量反应液。

6.一种埃博拉病毒NP基因第857位至第1130位核苷酸的用途，所述的位置是指在埃博拉病毒株ZaireEbolavirusstrainMayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置，其特征在于，用于制备埃博拉病毒的遗传标记分子。