CN110669793A - 制备慢病毒颗粒包装ebovrna作为ebov核酸检测阳性参考品的方法 - Google Patents

制备慢病毒颗粒包装ebovrna作为ebov核酸检测阳性参考品的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了制备慢病毒颗粒包装EBOV RNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，制备方法将EBOV的三个基因NP、GP和L基因的部分片段串联后整合到慢病毒的表达载体中，将构建的慢病毒表达质粒与包装质粒分别在工程大肠杆菌菌株中扩增，得到大量的质粒，再将构建的表达质粒和包装质粒共同转染至HEK293T细胞中，经细胞表达后得到大量的包装了EBOV的RNA基因的慢病毒颗粒。本发明涉及基因工程技术领域。该制备慢病毒颗粒包装EBOV RNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，得到的颗粒作为EBOV核酸检测的阳性参考品，具有很好模拟实际样本中从病毒核酸提取到核酸检测的整个过程的优点，将EBOV的假病毒颗粒通过冻干保护剂进行冻干后得到的冻干粉，非常稳定。

Description

制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品 的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒颗粒包装埃博拉病毒(EBOV)三个基因NP、GP和L基因的部分片段的RNA，作为EBOV核酸检测阳性参考品的制备方法，并涉及使该阳性参考品的稳定保存的方法。
背景技术
埃博拉病毒(EBOV)有着极高的致死率和传染性，是全球关注度极高的烈性病原，其常用的检测方法主要是RT-PCR，而相应的试剂盒一定要匹配阳性参考物质，EBOV的核酸检测试剂盒的阳性参考物质一般为质粒DNA、反转录RNA、或灭活的病毒，这些阳性参考物质目前都存在着以下不同的缺陷：
1.如灭活病毒需要四级生物安全实验室制备，且灭活病毒的安全性尚不能保证；
2.反转录的RNA性质很不稳定，容易降解，保存困难；
3.而质粒DNA作为通用的阳性模板不能模拟样本从RNA提取到进行核酸扩增检测的整个过程，模拟性不足。
以上这些原因都会导致检测结果的不准确甚至是假阴性结果，因此，作为试剂盒的阳性参照，如何构建一种可以模拟病毒从RNA提取至核酸扩增检测步骤全过程的阳性参考物质是一个急需解决的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，本发明的EBOV核酸阳性参考品能完全模拟病毒RNA提取和核酸检测全过程，且稳定性高，可用于EBOV核酸检测试剂盒的阳性参考，利用本发明建立的制备方法可以得到高稳定性和高拷贝数的包装了EBOV RNA的慢病毒颗粒。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，具体包括以下步骤：
S1、将合成的带有XbaI和BamHI的EBOV基因，经XbaI和BamHI酶切，同时将慢病毒表达质粒也用XbaI和BamHI酶切；
S2、将步骤S1所得的EBOV基因的核苷酸片段与慢病毒表达载体用T4连接酶进行连接，构建重组的含EBOV基因的慢病毒表达载体；
S3、将构建好的重组质粒以及慢病毒的三个包装质粒分别转化到大肠杆菌中，进行扩增并提取相应的质粒；
S4、将步骤S3得到的4个质粒转染至细胞后进行假病毒颗粒的表达与包装，得到包装了EBOV RNA的假病毒；
S5、收集步骤S4中的细胞培养液上清，过滤，得到粗产物；
S6、将步骤S5得到的过滤液经PEG8000沉淀，收集沉淀重悬至缓冲液PBS中；
S7、将步骤S6得到的溶液经透析袋透析除去PEG8000；
S8、将步骤S7得到的溶液用DNaseI处理，并超离重悬沉淀在PBS中后，再超离一次，重悬沉淀在PBS中；
S9、将步骤S8得到的溶液加入冻干保护剂冻干后，得到包装了EBOV RNA的假病毒冻干粉。
优选的，所述步骤S1中所使用的慢病毒表达载体为pEB-copGFP(T2A)PURO。
优选的，所述步骤S3中的三个包装质粒分别为VSV-G、PLP1和PLP2。
优选的，所述步骤S3中大肠杆菌为DH5α。
优选的，所述步骤S4中所转染的细胞为HEK293T细胞。
优选的，所述步骤S4中将慢病毒表达载体质粒连同3个包装质粒转化进HEK293T的具体步骤为：
T1、分别取100～200μL的无血清细胞培养基(DMEM)、30μL lipofectamine 3000细胞转染试剂盒中的P3000TM试剂、3～15μg的PLP1、3～15μg的PLP2、3～15μg的VSVG和3～15μg的pEB-copGFP(T2A)PURO-EBOV，再用无血清细胞培养基定容至650μL，轻轻混匀；
T2、另取575μL无血清细胞培养基，稀释75μL lipofectamine 3000试剂，加完后轻轻混匀；
T3、将步骤T1中的650μL混合液加入步骤T2中的650μL混合液，轻轻混匀，室温孵育5min；
T4、用移液器吸净细胞培养盘中的培养基，并用D-Hanks缓冲液1-5mL清洗细胞，将孵育完成的步骤T3中的脂质体溶液均匀的加入至25cm2的细胞培养盘中，37℃孵育15min；
T5、细胞培养盘中再加入5mL含有10％的胎牛血清的细胞培养液，置于37℃含有5％的二氧化碳的细胞培养箱中培养，6h后更换新鲜的细胞培养液，于24～120h收集上清液两次，并合并两次收集的上清。
优选的，所述步骤S6中PEG8000沉淀慢病毒颗粒的具体步骤为：在过滤后的细胞培养液上清中加入固体NaCl至浓度为1M，溶解后加入固体PEG8000至终浓度10％(w/v)，充分振荡溶解，四度冰箱放置过夜，使慢病毒颗粒形成沉淀，4℃10,000rpm离心15min，弃上清，然后用PBS缓冲液重悬沉淀，并转移至干净的2mL ep管。
优选的，所述步骤S7中所用到的除去PEG8000的方法是透析法，用7K的透析袋低温透析6小时，换液3次。
优选的，所述步骤S8中DNaseI处理浓度、温度和时间分别为0.5～2mg/mL、37℃和1h，且步骤S8中去除DNaseI的方法为20,000～40,000rpm超离2～4h，并重复超离一次，收集沉淀，用PBS溶解，分装冻存。
优选的，所述步骤S9冻干保护剂成分分别为10～30％的海藻糖和1～3％的BSA，且冻干保护程序为：
A1、Freeze-30℃,1h 30min；
A2、Freeze-30℃,2h；
A3、Condenser preparation,15min；
A4、Chamber vacuum,400μbar；
A5、Primary drying,-40℃,200μbar,1h；
A6、Primary drying,-40℃,200μbar,17h；
A7、Secondary drying 4℃,1h；
A8、Secondary drying 4℃,4h；
A9、End of cycle。
优选的，慢病毒颗粒包装的EBOV RNA对应的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
(三)有益效果
本发明提供了制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法。与现有技术相比具备以下有益效果：
(1)、该制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，通过慢病毒包装EBOV三个基因NP、GP和L基因的部分片段RNA序列从而得到EBOV RNA核酸参考物质，该参考物质能真实模拟EBOV检测过程中从样本中RNA提取到核酸检测的全过程。
(2)、该制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，通过提供的EBOV RNA核酸参考物质，因为采用了第三代慢病毒包装系统，通过该系统得到的慢病毒安全性高，用于核酸检测参考物质无需用到生物安全实验室。
(3)、该制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，通过冻干工艺得到的包装了EBOV RNA的慢病毒颗粒稳定性高，作为EBOV核酸检测的阳性参考品无需低温运输，无需低温保存，大大节约了使用成本。
附图说明
图1为本发明实施例3制得的包装了EBOV RNA片段的慢病毒颗粒的TEM图；
图2为本发明实施例3中典型的qPCR检测曲线图；
图3为本发明实施例3中ddPCR退火温度优化检测结果图；
图4为本发明实施例5中包装了EBOV RNA片段的慢病毒颗粒冻干管的均匀性检测结果图；
图5为本发明实施例5中包装了EBOV RNA片段的慢病毒颗粒冻干粉在不同温度下放置两周和四周的qPCR结果图；
图6为本发明实施例5中包装了EBOV RNA片段的慢病毒颗粒冻干粉在不同温度下放置两周和四周的ddPCR结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
展示实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
由于常用的EBOV的核酸检测阳性参考物质(质粒DNA、反转录RNA、或灭活的病毒)存在着模拟性不足、不稳定或有安全隐患等缺点。因此，本发明提供一种安全稳定的EBOV核酸参考物质的制备方法，用慢病毒颗粒包裹了EBOV RNA基因，该核酸参考物质能真实模拟RNA提取至检测的全过程，且稳定性好，安全性高，在EBOV的核酸检测试剂盒中有着很好的应用前景。
本发明的EBOV核酸参考物质，是将EBOV的NP、GP和L基因的部分片段RNA包装在慢病毒颗粒中，该核酸参考物质的EBOV串联的NP、GP和L基因的序列如SEQ ID No.1所示。
一般的，通过序列组合得到的EBOV的序列，通过载体包装后得到的包装了EBOVRNA的假病毒颗粒，都是基于类似的原理得到相应的阳性参考物质，因此，由上述方法得到的包装了病毒EBOV RNA的假病毒颗粒具有类似的功能和应用，也包括在本发明的范围内。
请参阅图1-6，本发明实施例提供五种技术方案：制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，具体包括以下实施例：
实施例1
首先需要构建含有EBOV基因的慢病毒颗粒表达载体，本实施例中，基因表达序列采用如下操作制得：
获得SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，克隆该序列，选取常用于核酸检测EBOV的基因NP、GP和L基因，通过文献检索获得相应的核酸检测序列，并分析这三个基因的保守序列，选取了NP(在KJ660346.2Zaire ebolavirus基因组的第560位-1839位)、GP(在KJ660346.2Zaire ebolavirus基因组的第6053位-7100位)、L gene(在KJ660346.2Zaireebolavirus基因组的第10348位-13589位和13900-14471位)共3453bp的核苷酸序列，委托某基因合成公司合成，两端加上XbaI和BamHI的限制性内切酶的位点。
四质粒(包括慢病毒表达载体：pEB-copGFP(T2A)PURO和三个包装质粒：VSV-G，PLP1，PLP2)的慢病毒包装载体购自某基因公司，将合成的EBOV基因连接至慢病毒表达载体pEB-copGFP(T2A)PURO上，具体的酶切连接过程如下：
采用限制性核酸内切酶XbaI和BamH I对EBOV串联序列和pEB-copGFP(T2A)PURO质粒进行双酶切，双酶切体系：5μL 10×酶切缓冲液，EBOV的NP、GP和L基因的部分序列串联的序列10μL(约1μg片段或1μg质粒)，1μL的XbaI，1μL的BamHI，无菌水补齐至50μL，在37℃水浴中酶切30-40min，EBOV序列片段或pEB-copGFP(T2A)PURO质粒经过双酶切后跑胶纯化去除小片段后回收，后使用Nanodrop 2000进行浓度的测定。
接着，将酶切后的EBOV序列片段以及酶切后的载体pEB-copGFP(T2A)PURO，按1:10～20的摩尔比使用T4连接酶连接，将连接产物进行大肠杆菌DH5α的转化，完成阳性克隆的筛选，连接体系如下：
1μL的T4DNA连接酶，1μL的T4DNA连接缓冲液，酶切后的EBOV序列片段和酶切后的载体pEB-copGFP(T2A)PURO按1:10～20的摩尔比体积适量，加入无菌水将总体积补齐至10μL，在16℃连接过夜。
将连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α中，具体步骤如下：
S1、从-80℃取出感受态细胞DH5α，冰上放置5-10min。
S2、将10μL的连接产物加入已经融化的感受态细胞DH5α，并用移液器轻轻混匀后，冰浴30min。
S3、冰浴后的感受态细胞与连接产物混合物42℃水浴90s，迅速将混合物放至冰上，冰浴1-2min。
S4、向混合物中加入800μL无抗性的LB液体培养基，37℃，150r/min，培养1h。
S5、4500r/min，5min离心收集菌体，弃上清，并留100μL于管内，用移液器轻轻混匀菌体。
S6、将混匀的感受态转移到含有100μg/mL氨苄抗性的LB固体平板上，并用无菌的涂布棒涂抹均匀。
S7、将LB固体平板在37℃恒温培养箱中培养12-16h后，挑取单克隆。
单克隆进行质粒提取后用双酶切验证，将条带正确的克隆送测序公司进行测序验证。
实施例2
包装了EBOV基因序列的假病毒颗粒的表达，本发明中采用的慢病毒包装系统为第三代四质粒包装系统，拥有一个表达载体以及三个包装质粒：包装系统将Rev基因单独放在一个质粒上为了阻止同源重组产生有自我复制能力的病毒；第二个质粒表达Gag和Pol结构蛋白；第三个质粒采用疱疹性口炎病毒糖蛋白VSV-G取代了自身的包膜蛋白Env，相较于第一代双质粒包装系统和第二代三质粒包装系统其拥有更高的安全性。假病毒颗粒的构建过程为：将外源基因构建入慢病毒表达载体内，连同三个包装质粒VSV-G，PLP1，PLP2转染细胞后进行假病毒颗粒的包装。包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，可通过PEG8000沉淀或超速离心对假病毒颗粒进行浓缩富集。本实施例中包装了EBOV基因序列的假病毒颗粒的表达的具体方法如下：
首先将四质粒转染至细胞中，转染采用25cm2细胞培养盘，细胞为HEK293T，细胞量大约为8×106。转染使用lipofectamine 3000细胞转染试剂盒，步骤如下：
T1、取一定量无血清细胞培养基(DMEM)，用于稀释30μL的p3000TM试剂，3～15μg的PLP1，3～15μg的PLP2，3～15μg的VSVG，3～15μg的pEB-copGFP(T2A)PURO-EBOV，加完后用无血清细胞培养基用定容至650μL轻轻混匀。
T2、另取650μL无血清细胞培养基，用于稀释75μL lipofectamine 3000试剂，加完后轻轻混匀。
T3、将用于稀释质粒的650μL无血清细胞培养基加入稀释lipofectamine3000试剂的650μL无血清细胞培养基后，轻轻混匀，室温孵育5min。
T4、用移液器吸净细胞培养盘中的培养基，并用D-Hanks缓冲液1mL清洗一次，将孵育完成的脂质体溶液均匀的加入25cm2的细胞培养盘中。
T5、细胞培养盘中再加入5mL含有10％的胎牛血清的细胞培养液，置于37℃，含有5％的二氧化碳的细胞培养箱中培养，6h后更换新鲜的细胞培养液，于24～120h收集两次上清液。
接着进行假病毒颗粒的富集：将转染后的收集的两次细胞上清液合并，3000rpm，10min离心后使用0.45μm无菌滤膜过滤去除细胞碎片，向过滤后的细胞上清液中加入浓度DNA酶使其终浓度为1mg/mL，消化过夜，消化后的细胞上清液用PEG8000富集假病毒颗粒，具体过程如下：加入固体NaCl至浓度为1M，再加入固体PEG 8000至终浓度10％(w/v)，充分振荡溶解，四度冰箱放置过夜，使噬菌体颗粒形成沉淀，4℃10,000rpm离心15-20min，尽量弃尽上清，再用500μL PBS重悬沉淀，并转移至干净的2mL ep管，20μL分装后于-80℃保存。
实施例3
包装了EBOV基因序列的假病毒颗粒的验证，首先将假病毒颗粒制样后进行透射电镜TEM的观察。具体过程如下：
将铜网置于20μL的包装了EBOV基因序列的假病毒颗粒的微滴内，吸附10min后，取出铜网并用20μL的2％的磷钨酸(phosphotungstic acid PTA pH 6.8)进行负染固定样品30s，之后将铜网取出，置于滤纸片上晾干过夜后进行透射电镜观察，结果如图1所示，颗粒的大小在80-120nm范围内。
接着用荧光定量PCR验证包装了EBOV基因序列的假病毒颗粒，如图1所示，1为EBOV-NP基因，2为EBOV-GP基因。
取30μL浓缩后的假病毒颗粒加110μL无菌水补至140μL，进行假病毒颗粒的RNA提取，提取步骤参考试剂盒说明书QIAamp viral RNA minikit，提取RNA后，利用合成的EBOV的引物和探针进行荧光定量PCR(Taqman探针法)验证。采用的EBOV的引物探针序列如下：
NP引物探针序列：
正向：5’-GAGCTTATGGTCTTTTCCCTCA-3’
反向：5’-TCRCTTGAGACTCYGCATATTG-3’
探针：5’-FAM-GCTCGCCACAGCMCACGGGAGY-BHQ-1-3’；
GP引物探针序列：
正向：5’-TGGGCTGAAAAYTGCTATACAATC-3’
反向：5’-CTTTGTGMACATASCGGTACAC-3’
探针：5’-HEX-TACTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ-1-3’
L gene引物探针序列：
正向：5’-ATTTGAATGGGGTCCAATTATGCC-3’
反向：5’-AAGCAGTRCCTATACTAGTACCA-3’
探针：5’-FAM-GCAGTCCCTTAAAACGGCTACAAGAATGGSAC-BHQ-1-3’
荧光定量PCR体系为(20μL体系)：10μL 2×RT qPCR mix，正向引物和反向引物各0.8μL，探针(10μM)0.8μL，2μL RT-PCR酶，5μL模板，DEPC处理过的水补齐至20μL。
荧光定量PCR扩增程序为：37℃，15min；95℃，15min；再按95℃，15s，60℃，60s循环40次；FAM荧光检测在60℃。
最后利用数字PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)对包装了EBOV基因序列的假病毒颗粒进行绝对定量表征验证。
定量表征前对退火温度进行了优化，设置退火温度从60℃、59.2℃、58.0℃、56.1℃、53.8℃、51.9℃、50.7℃、50℃，ddPCR检测结果如图3所示，可以看出，退火温度为56.1℃时阳性信号与阴性信号区分最大，因此，后续实验中采用56.1℃的退火温度。
按前述方法提取病毒RNA后，用BioRad一步法试剂盒One-Step RT-ddPCR kit forprobes(Bio-Rad)进行ddPCR表征。一步法RT ddPCR体系(21μL)：5μL Supermix，2μL RT，1μL300mM DTT，0.9μL 20μM EBOV-NP正向引物，0.9μL 20μM EBOV-NP反向引物，0.5μL 10μMEBOV-NP探针，2μL提取的包装了EBOV RNA慢病毒的RNA，DCEP处理的水补齐至21μL，轻轻混匀并离心10s后，自动分液滴后进行PCR扩增。PCR扩增程序为：46℃60min；95℃10min；再按95℃30s，56℃60s，循环40次；98℃10min。反应完成后使用数字PCR微滴检测仪进行信号检测。
实施例4
假病毒颗粒冻干粉的制备，在分装的20μL假病毒颗粒溶液中加入20μL20～60％海藻糖，2～6％BSA的假病毒冻干保护剂，轻轻混匀后，置于冷冻干燥仪(Telstar，LYOBETA3PS，西班牙)，设置冻干工艺如下：1)Freeze-30℃,1h 30min；2)Freeze-30℃,2h；3)Condenser preparation,15min；4)Chamber vacuum,400μbar；5)Primary drying,-40℃,200μbar,1h；6)Primary drying,-40℃,200μbar,17h；7)Secondary drying 4℃,1h；8)Secondary drying 4℃,4h；9)End of cycle。运行结束后，制成假病毒颗粒冻干粉，置于4℃保存。
实施例5
假病毒颗粒作为EBOV病毒检测阳性参考物质的质量评估，假病毒颗粒冻干粉中加入140μL DEPC水，涡旋混匀。首先进行定值，考虑到对假病毒颗粒定值过程中提取效率对定值结果的影响，通过如下方法进行提取效率的评估：将EBOV假病毒颗粒采用RNA提取试剂盒提取RNA，再次采用RNA提取试剂盒进行提取，用一步法ddPCR测试两次RNA的拷贝数。得到的提取效率为93％。接下来，取三管EBOV慢病毒冻干粉进行定值，结果如表1所示。
表1.假病毒颗粒冻干管的定值
Figure BDA0002234302010000121
接着进行假病毒颗粒的均一性表征。从假病毒颗粒冻干粉300份中随机抽取15份，利用ddPCR一步法进行均一性测试。结果如图4所示，相应的copies/μL的结果如表2所示。
表2.假病毒颗粒的均匀性表征
Figure BDA0002234302010000131
然后进行了假病毒颗粒在不同温度下的稳定性测试，将假病毒颗粒冻干粉管分别置于-80℃，-20℃，4℃，20℃，37℃，45℃和56℃放置两周和四周，提取RNA进行qPCR和ddPCR的表征，测试假病毒颗粒溶液在不同温度下的稳定性。相应的结果如图5和图6所示，从两个图均可以看出，从-80℃至45℃的条件下，两周和四周的qPCR的Ct值以及ddPCR的copies/μL变化不明显，因此包装了EBOV基因序列的慢病毒颗粒在温度高至45℃均有很好的稳定性。
本发明序列表Seq No.1：包装的EBOV片段的cDNA序列
GTTCAACAGGGGATTGTTCGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAAACAATCTTGAGGAAATTTGCCAACTTATCATACAGGCCTTTGAAGCTGGTGTTGATTTTCAAGAGAGTGCGGACAGTTTCCTTCTCATGCTTTGTCTTCATCATGCGTACCAAGGAGATTACAAACTTTTCTTGGAAAGTGGCGCAGTCAAGTATTTGGAAGGGCACGGGTTCCGTTTTGAAGTCAAGAAGCGTGATGGAGTGAAGCGCCTTGAGGAATTGCTGCCAGCAGTATCTAGTGGGAGAAACATTAAGAGAACACTTGCTGCCATGCCGGAAGAGGAGACGACTGAAGCTAATGCCGGTCAGTTCCTCTCCTTTGCAAGTCTATTCCTTCCGAAATTGGTAGTAGGAGAAAAGGCTTGCCTTGAGAAGGTTCAAAGGCAAATTCAAGTACATGCAGAGCAAGGACTGATACAATATCCAACAGCTTGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTGATTTTCCGTTTGATGCGAACAAATTTTTTGATCAAATTTCTTCTAATACACCAAGGGATGCACATGGTTGCCGGACATGATGCCAACGATGCTGTGATTTCAAATTCAGTGGCTCAAGCTCGTTTTTCAGGTCTATTGATTGTCAAAACAGTACTTGATCATATCCTACAAAAGACAGAACGAGGAGTTCGTCTCCATCCTCTTGCAAGGACCGCCAAGGTAAAAAATGAGGTGAACTCCTTCAAGGCTGCACTCAGCTCCCTGGCCAAGCATGGAGAGTATGCTCCTTTCGCCCGACTTTTGAACCTTTCTGGAGTAAATAATCTTGAGCATGGTCTTTTCCCTCAACTGTCGGCAATTGCACTCGGAGTCGCCACAGCCCACGGGAGCACCCTCGCAGGAGTAAATGTTGGAGAACAGTATCAACAGCTCAGAGAGGCAGCCACTGAGGCTGAGAAGCAACTCCAACAATATGCGGAGTCTCGTGAACTTGACCATCTTGGACTTGATGATCAGGAAAAGAAAATTCTTATGAACTTCCATCAGAAAAAGAACGAAATCAGCTTCCAGCAAACAAACGCGATGGTAACTCTAAGAAAAGAGCGCCTGGCCAAGCTGACAGAAGCTATCACTGCTGCATCACTGCCCAAAACAAGTGGACATTACGATGATGATGACGACATTCCCTTTCCAGGACCCATCAATGATGACGACAATCCTGGCCATCAAGATGATGATCCGACTGACTCACAGGATACGACCATTCCCGATGTAATATTGCAGTTACCTCGTGATCGATTCAAGAGGACATCATTCTTTCTTTGGGTAATTATCCTTTTCCAAAGAACATTTTCCATCCCGCTTGGAGTTATCCACAATAGTACATTACAGGTTAGTGATGTCGACAAACTAGTTTGTCGTGACAAACTGTCATCCACAAATCAATTGAGATCAGTTGGACTGAATCTCGAGGGGAATGGAGTGGCAACTGACGTGCCATCTGCGACTAAAAGATGGGGCTTCAGGTCCGGTGTCCCACCAAAGGTGGTCAATTATGAAGCTGGTGAATGGGCTGAAAACTGCTACAATCTTGAAATCAAAAAACCTGACGGGAGTGAGTGTCTACCAGCAGCGCCAGACGGGATTCGGGGCTTCCCCCGGTGCCGGTATGTGCACAAAGTATCAGGAACGGGACCATGTGCCGGAGACTTTGCCTTCCACAAAGAGGGTGCTTTCTTCCTGTATGATCGACTTGCTTCCACAGTTATCTACCGAGGAACGACTTTCGCTGAAGGTGTCGTTGCATTTCTGATACTGCCCCAAGCTAAGAAGGACTTCTTCAGCTCACACCCCTTGAGAGAGCCGGTCAATGCAACGGAGGACCCGTCGAGTGGCTATTATTCTACCACAATTAGATATCAGGCTACCGGTTTTGGAACTAATGAGACAGAGTACTTGTTCGAGGTTGACAATTTGACCTACGTCCAACTTGAATCAAGATTCACACCACAGTTTCTGCTCCAGCTGAATGAGACAATATATGCAAGTGGGAAGAGGAGCAACACCACGGGAAAACTAATTTGGAAGGTCAACCCCGAAATTGATACAACAATCGGGGAGTGGGCCTTCTGGGAAACTAAAAAAACCTCACTAGAAAAATTCGCAGTGAAGAGTTGTCTTTCACAGCTGTATCAAACGGACCCAAAAACATCAGTGGTCAGAGTCCGGCGCGAACTTCTTCCGACCCAGAGACCAACACAACAAATGAAGACCACAAAATCATGGCTTCAGAAAATTCCTCTGCAATGGTTCAAGTGCACAGAAAGGACATGCTGGGATGCAGTATTCGAGCCTAATGTTCTGGGATATAATCCACCTCACAAATTCAGTACCAAACGTGTACCGGAACAATTTTTAGAGCAAGAAAACTTTTCTATTGAGAATGTTCTTTCCTACGCGCAAAAACTCGAGTATCTACTACCACAATATCGGAATTTTTCTTTCTCATTGAAAGAGAAAGAGTTGAATGTAGGTAGAACTTTCGGAAAATTGCCTTATCCGACTCGCAATGTTCAAACACTTTGTGAAGCTCTGTTAGCTGATGGTCTTGCTAAAGCATTTCCTAGCAATATGATGGTAGTTACGGAACGTGAACAAAAAGAAAGCTTATTGCATCAAGCATCATGGCACCACACAAGTGATGATTTCGGTGAGCATGCCACAGTTAGAGGGAGTAGCTTTGTAACTGATTTAGAGAAATACAATCTTGCATTTAGGTATGAGTTTACAGCACCTTTTATAGAATATTGCAACCGTTGCTATGGTGTTAAGAATGTTTTTAATTGGATGCATTATACAATCCCGCCAGCCTAGCAAAAGTTACAAGTGCCTGTGGAATCTTTTTAAAACCTGATGAAACATTTGTACATTCAGGTTTTATCTATTTTGGAAAAAAACAATATTTGAATGGGGTCCAATTGCCTCAGTCCCTTAAAACGGCTACAAGAATGGCACCATTGTCTGATGCAATTTTTGATGATCTTCAAGGGACCCTGGCTAGTATAGGTACTGCTTTTGAGCGATCCATCTCTGAGACACGACATATCTTTCCTTGCAGAATAACCGCAGCTTTCCATACGTTCTTTTCGGTGAGAATCTTGCAATATCATCACCTCGGATTTAATAAAGGTTTTGACCTTGGACAGTTAACACTCGGCAAACCTCTGGATTTCGGAACAATATCATTGGCACTAGCGGTACCGCAGGTGCTTGGAGGGTTATCCTTCTTGAATCCTGAGAAATGTTTCTACCGGAATCTAGGAGATCCAGTTACCTCAGGTTTATTCCAGTTAAAAACTTATCTCCGAATGATTGAGATGGATGATTTATTCTTACCTTTAATTGCGAAGAACCCTGGGAACTGCACTGCCATTG。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、将合成的带有XbaI和BamHI的EBOV基因，经XbaI和BamHI酶切，同时将慢病毒表达质粒也用XbaI和BamHI酶切；
S2、将步骤S1所得的EBOV基因的核苷酸片段与慢病毒表达载体用T4连接酶进行连接，构建重组的含EBOV基因的慢病毒表达载体；
S3、将构建好的重组质粒以及慢病毒的三个包装质粒分别转化到大肠杆菌中，进行扩增并提取相应的质粒；
S4、将步骤S3得到的4个质粒转染至细胞后进行假病毒颗粒的表达与包装，得到包装了EBOV RNA的假病毒；
S5、收集步骤S4中的细胞培养液上清，过滤，得到粗产物；
S6、将步骤S5得到的过滤液经PEG8000沉淀，收集沉淀重悬至缓冲液PBS中；
S7、将步骤S6得到的溶液经透析袋透析除去PEG8000；
S8、将步骤S7得到的溶液用DNaseI处理，并超离重悬沉淀在PBS中后，再超离一次，重悬沉淀在PBS中；
S9、将步骤S8得到的溶液加入冻干保护剂冻干后，得到包装了EBOV RNA的假病毒冻干粉。
2.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S1中所使用的慢病毒表达载体为pEB-copGFP(T2A)PURO。
3.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S3中的三个包装质粒分别为VSV-G、PLP1和PLP2。
4.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S3中大肠杆菌为DH5α。
5.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S4中所转染的细胞为HEK293T细胞。
6.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S4中将慢病毒表达载体质粒连同3个包装质粒转化进HEK293T的具体步骤为：
T1、分别取100～200μL的无血清细胞培养基、30μL lipofectamine 3000细胞转染试剂盒中的P3000TM试剂、3～15μg的PLP1、3～15μg的PLP2、3～15μg的VSVG和3～15μg的pEB-copGFP(T2A)PURO-EBOV，再用无血清细胞培养基定容至650μL，轻轻混匀；
T2、另取575μL无血清细胞培养基，稀释75μL lipofectamine 3000试剂，加完后轻轻混匀；
T3、将步骤T1中的650μL混合液加入步骤T2中的650μL混合液，轻轻混匀，室温孵育5min；
T4、用移液器吸净细胞培养盘中的培养基，并用D-Hanks缓冲液1-5mL清洗细胞，将孵育完成的步骤T3中的脂质体溶液均匀的加入至25cm2的细胞培养盘中，37℃孵育15min；
T5、细胞培养盘中再加入5mL含有10％的胎牛血清的细胞培养液，置于37℃含有5％的二氧化碳的细胞培养箱中培养，6h后更换新鲜的细胞培养液，于24～120h收集上清液两次，并合并两次收集的上清。
7.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S6中PEG8000沉淀慢病毒颗粒的具体步骤为：在过滤后的细胞培养液上清中加入固体NaCl至浓度为1M，溶解后加入固体PEG 8000至终浓度10％(w/v)，充分振荡溶解，四度冰箱放置过夜，使慢病毒颗粒形成沉淀，4℃10,000rpm离心15min，弃上清，然后用PBS缓冲液重悬沉淀，并转移至干净的2mL ep管。
8.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S7中所用到的除去PEG8000的方法是透析法，用7K的透析袋低温透析6小时，换液3次。
9.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S8中DNaseI处理浓度、温度和时间分别为0.5～2mg/mL、37℃和1h，且步骤S8中去除DNaseI的方法为20,000～40,000rpm超离2～4h，并重复超离一次，收集沉淀，用PBS溶解，分装冻存。
10.根据权利要求1所述的制备慢病毒颗粒包装EBOVRNA作为EBOV核酸检测阳性参考品的方法，其特征在于：所述步骤S9冻干保护剂成分分别为10～30％的海藻糖和1～3％的BSA，且冻干保护程序为：
A1、Freeze-30℃,1h 30min；
A2、Freeze-30℃,2h；
A3、Condenser preparation,15min；
A4、Chamber vacuum,400μbar；
A5、Primary drying,-40℃,200μbar,1h；
A6、Primary drying,-40℃,200μbar,17h；
A7、Secondary drying 4℃,1h；
A8、Secondary drying 4℃,4h；
A9、End of cycle。
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