CN113980916A - 一种慢病毒的纯化方法 - Google Patents
一种慢病毒的纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113980916A CN113980916A CN202111136995.0A CN202111136995A CN113980916A CN 113980916 A CN113980916 A CN 113980916A CN 202111136995 A CN202111136995 A CN 202111136995A CN 113980916 A CN113980916 A CN 113980916A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- lentivirus
- precipitate
- centrifuging
- supernatant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 70
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 10
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 18
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 6
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229920006221 acetate fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种慢病毒的纯化方法，该纯化方法是在纯化的浓缩过程中使用一定浓度的PEG(添加KCl或NaCl)按比例与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀；用PBS溶解，对获得的慢病毒悬液进行核酸酶Benzonase酶切处理；添加鱼精蛋白进行沉淀慢病毒，添加1mol/L NaCl溶解病毒，离心，得到初纯化的慢病毒悬液；再经过蔗糖密度梯度离心，获得纯化的慢病毒。本发明制得的慢病毒纯化液无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留度低，安全性好，纯度和滴度高，可达到动物实验及临床要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种慢病毒的纯化方法，属于病毒学技术领域。
背景技术
慢病毒属于逆转录病毒科，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，感染个体最终发病。慢病毒感染患者早期很难观察，大多经历长达数年的潜伏期，之后缓慢发病，因此称为慢病毒(Lentivirus)。慢病毒通常与免疫系统和中枢神经系统的慢性疾病有关，如人类免疫缺陷病毒(HIV)会导致艾滋病。慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，对其自身元件进行改造而发展起来的一类能够携带外源基因的病毒载体。
与其他病毒相比，慢病毒有其独特的优点：
(1)宿主更广泛：对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率；
(2)可稳定表达：慢病毒基因组可整合于宿主基因组，因此可以长时间、稳定表达外源基因；
(3)可携带大约5kb或更长的外源基因片段：基于慢病毒载体的优点，其被广泛应用于RNAi、基因治疗以及转基因动物等研究中。体外构建能够表达siRNA的慢病毒载体，然后进行细胞转染，使其在细胞内转录siRNA，可发挥长期阻断基因表达的作用。同时，以慢病毒作为基因载体的多种基因疗法已在国内外开展临床研究，效果非常理想，在基因治疗中拥有广阔的应用前景。
当使用慢病毒载体感染细胞时，通常需要浓缩病毒颗粒以获得高滴度及高纯度的慢病毒，特别是需要感染大量细胞或者用于某些对转导具有抵抗力的细胞系时。离心除去细胞碎片及杂质是纯化慢病毒初级的简单有效的方法，在纯化过重中浓缩过程使用蔗糖及磷酸缓冲盐溶液的添加剂及切向流来辅助病毒的纯化。
目前获得高纯度慢病毒主要有三种方法：PEG沉淀法、超滤法和超离法。
PEG沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于沉淀病毒的主要分子量为2000-6000的PEG，将PEG配成50％左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃过夜，然后离心使病毒沉淀。
超滤法：采用超滤膜以压力差为推动动力的膜过滤方法为超滤膜过滤。超滤膜大多由醋酯纤维或与其性能类似的高分子材料制得，适用于处理溶液中溶质的分离和增浓。
超离法：物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。
PEG可与病毒结合，形成多聚体，较低离心力即可获得病毒沉淀。利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将大分子或病毒等颗粒截留。超滤膜的孔径要比病毒颗粒小，只能去除比病毒小的细胞碎块。超速离心沉淀慢病毒仍然会有部分质粒DNA和宿主DNA的残留。因此，这些方法纯化得到的慢病毒纯度较低，进而限制了其应用范围。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种慢病毒的纯化方法。本发明制得的慢病毒纯化液无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留度低，安全性好，纯度和滴度高，可达到动物实验及临床要求。
本发明的技术方案如下。
一种慢病毒的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
(5)用PEG与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀；
(6)用PBS溶解沉淀，对获得的慢病毒悬液进行核酸酶酶切处理；
(7)添加鱼精蛋白沉淀慢病毒，溶解病毒，离心，得到初纯化的慢病毒悬液；
(8)再经过蔗糖密度梯度离心，获得纯化的慢病毒。
进一步地，所述步骤(1)为：5X PEG按0.5-2:1体积比与病毒上清进行混合，3-5℃，沉淀1-3h，每10-30min将混合液颠倒混匀；3-5℃，4000-6000rpm，5-15min离心病毒混合液，弃上清，得到白色的慢病毒沉淀；所述5X PEG中添加了KCl或NaCl。
更进一步地，所述步骤(1)具体为：5X PEG按0.5:1比例与病毒上清进行混合，4℃，沉淀2h，每20min将混合液颠倒混匀；4℃，5000rpm，10min离心病毒混合液，弃上清，得到白色的慢病毒沉淀；所述5X PEG中添加了1mol/L的KCl或NaCl。
进一步地，所述步骤(2)为：用10mL PBS溶解病毒沉淀，得到病毒溶液；在所述病毒溶液中添加1μL的核酸酶Benzonase酶进行酶切处理。
进一步地，所述步骤(3)为：添加0.5-2mg/mL鱼精蛋白35-40℃放置20-40min，离心，得到初纯化的慢病毒沉淀。
更进一步地，所述步骤(3)具体为：添加1mg/mL鱼精蛋白37℃放置30min，10000rpm，4℃，离心10min，得到初纯化的慢病毒沉淀。
进一步地，所述步骤(4)具体为：依次在超速离心管底部加入2mL 70％，1mL 50％，1mL30％，4mL 20％蔗糖(v/w)浓度梯度溶液，20000rpm，4℃，离心2h；取30％-50％的溶液，每1mL加10mL PBS混匀，得到病毒-蔗糖-PBS混合液；再取新的超速离心管，底部加入6mL20％蔗糖溶液，再加入病毒-蔗糖-PBS混合液，20000rpm，4℃，离心2h，弃掉上清，留下病毒沉淀，用1mL病毒保存液重悬病毒沉淀，4℃冰箱中1-2h溶解病毒沉淀，0.5h混匀一次；10000rpm，10min离心，取上清。
进一步地，所述慢病毒的滴度用QPCR法检测。
本发明还提供了上述慢病毒的纯化方法在细胞感染中的应用。
本发明还提供了上述慢病毒的纯化方法在基因表达中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种新慢病毒纯化的方法，使用一定浓度的PEG(添加KCl或NaCl)按比例与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀，用PBS溶解，对获得慢病毒悬液添加核酸酶Benzonase酶(Benzonase核酸酶，或来自粘质沙雷氏菌的内切核酸酶，可用于降解所有形式的DNA及RNA，并同时不带有蛋白水解活性)处理，添加鱼精蛋白(鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其他蛋白共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共沉淀而不影响病毒的感染力。当像这种沉淀物加入1mol/L NaCl时，病毒又重现释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀，直径小于50nm的小型病毒则不能与鱼精蛋白共同沉淀，因此可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白)进行沉淀慢病毒，添加1mol/L NaCl溶解病毒，离心，得到初纯化的慢病毒悬液，在经过蔗糖密度梯度离心，获得纯化的慢病毒。本发明极大地提高了慢病毒的滴度和纯度，增加了其应用范围(增加稳定株筛选的成功率，注射动物进行实验等)。
附图说明
图1：各组细胞图片(100×)。
具体实施方式
1、慢病毒包装
1)用0.25％(m/V，单位是mg/mL)的胰酶消化对数期293T细胞，将细胞收集至离心管中，计数。
2)细胞铺板。取10mm皿，按照实验分组，每组样品4个平板，每皿6×106个细胞/皿，转染时细胞密度在70～80％。
3)放入5％(V/V)CO2，37℃培养箱培养中培养24h后进行转染。
4)转染前将培养基换成10mL DMEM基础培养基。
5)将目的质粒和包装质粒用1mL DMEM基础培养基孵育5min，同时用1mL DMEM基础培养基孵育Lipofiter 5min，然后将质粒和Lipofiter轻柔混合继续孵育20min。随后将2mL液体全部均匀滴加到培养皿中。6h后将培养基更换成10mL完全培养基(不含双抗)。
6)24h之后即能观察到荧光，确认转染是否成功。
7)收毒：收48h病毒上清，保存于4℃，更换10mL完全培养基(不含双抗)。
8)收72h病毒上清。
2、浓缩纯化
1)将48h和72h病毒液混合，4℃，4000rpm离心5min，用0.45μm过滤器过滤。
2)5X PEG(添加10-50mL 1mol/L的KCl或NaCl)按0.5:1体积比与病毒上清进行混合，4℃，沉淀2h，每20min将混合液颠倒混匀。
3)4℃，5000rpm，10min离心病毒混合液，得到白色的慢病毒沉淀，弃掉上清，用10mL PBS溶解病毒沉淀，得到病毒溶液。
4)在上一步骤得到的病毒溶液中添加1μL的核酸酶Benzonase酶，添加1mg/mL鱼精蛋白37℃放置30min，10000rpm，4℃，离心10min，得到到初纯化的慢病毒沉淀。
5)添加1mol/L NaCl溶解病毒，得到初纯化的慢病毒悬液。
6)依次在超速离心管底部加入2mL 70％，1mL 50％，1mL 30％，4mL 20％蔗糖(v/w)浓度梯度溶液，20000rpm，4℃，离心2h。
7)取30％-50％中的溶液，每1mL加10mL PBS混匀，得到病毒-蔗糖-PBS混合液。
8)再取新的超速离心管，底部加入6mL 20％蔗糖溶液，再加入病毒-蔗糖-PBS混合液，20000rpm，4℃，离心2h。
9)弃掉上清，留下病毒沉淀，用1mL病毒保存液重悬病毒沉淀，4℃冰箱中1-2h溶解病毒沉淀，0.5h混匀一次。
10)10000rpm，10min离心，取上清分装-80℃保存。
11)QPCR法检测慢病毒滴度。
12)将得到的慢病毒进行感染目的细胞或注射实验动物，观察细胞感染病毒的效率及动物注射病毒情况。
实施例：LUC慢病毒包装、纯化、滴度检测及应用
1、293T细胞的复苏
从液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴锅中快速摇晃融化，加入5mL DMEM完全培养基(90％DMEM+10％FBS+1％P/S)混匀。
1000rpm离心4min，弃上清,加1mL DMEM完全培养基，将细胞悬液加入10cm培养皿中，补加7mL培养基，放入5％CO2，37℃培养箱培养中培养。
2、细胞密度大于80％时进行传代1:4传代处理，将细胞扩培至4皿。
3、当细胞密度大于80％时，处理细胞，并进行计数铺板，铺板皿数为4皿，铺板密度已第二天细胞长到60-70％为最佳。
4、第二天细胞长到70％后更换基础培养基，将携带LUC基因的目的质粒和包装质粒用1mL DMEM基础培养基孵育5min，同时用1mL DMEM基础培养基孵育Lipofiter 5min，然后将质粒和Lipofiter轻柔混合继续孵育20min。随后将2mL液体全部均匀滴加到培养皿中。6h后将培养基更换成10mL完全培养基(不含双抗)
5、24h之后即能观察到荧光，确认转染是否成功。
6、收毒：收48h病毒上清，保存于4℃，更换10mL完全培养基(不含双抗).
7、收72h病毒上清，进行纯化处理
8、QPCR检测病毒滴度>108IU/mL，纯化后的病毒感染细胞24h后荧光覆盖率达到50％。
QPCR滴度检测：
(1)病毒感染前一天，取6孔板接种293T细胞，每孔细胞为3×105个细胞
(2)接种细胞72h后，收取细胞，制备基因组样本
(3)QPCR反应：
QPCR体系：2XtaqMan Master MIx：10μL；
正向引物(100pmol mL-1)：1μL；
反向引物(100pmol mL-1)：1μL；
模板：2μL；
无核酸酶水加至20μL。
QPCR反应条件：
50℃2min；
95℃5min；
95℃5min；
60℃30sec；
35-40cycles。
(4)数据分析
根据标准曲线确定样品基因组对应的拷贝数
根据公式计算慢病毒滴度：IU/mL(平均每基因组整合的慢病毒拷贝数×感染细胞的数目×病毒载体稀释倍数×1000)/体积
LUC慢病毒PEG沉淀组数据如表1所示。
表1 LUC慢病毒PEG沉淀组数据
| 体积(μL) | 0.5 | 5 | 50 |
| 原病毒基因数量平均值 | 211.76 | 1015.552 | 5053.562 |
| 内参基因的数量平均值 | 6982.87 | 4973.95 | 3372.385 |
| 每个细胞慢病毒拷贝数 | 0.27 | 2.35 | 13.62 |
| 慢病毒滴度(IU/mL) | 11500000 | 12900000 | 131000000 |
| 平均滴度(IU/mL) | 51800000 |
LUC慢病毒超滤组数据如表2所示。
表2 LUC慢病毒超滤组数据
| 体积(μL) | 0.5 | 5 | 50 |
| 原病毒基因数量平均值 | 270.682 | 2790.845 | 6868.011 |
| 原病毒基因数量平均值 | 7682.87 | 4786.73 | 3469.992 |
| 每个细胞慢病毒拷贝数 | 0.35 | 2.55 | 14.08 |
| 慢病毒滴度(IU/mL) | 21500000 | 109000000 | 461000000 |
| 平均滴度(IU/mL) | 197000000 |
LUC慢病毒纯化组数据如表3所示。
表3 LUC慢病毒纯化组数据
(5)病毒感染细胞：
三种不同方法纯化后的LUC慢病毒感染N2a细胞，准备N2a细胞，将纯化后的三种病毒分别以MOI＝20加入到N2a细胞中，48h后，在荧光显微镜下观察细胞的荧光覆盖情况，并进行拍照，N2a细胞的荧光图和白光图如图1所示，用本专利方法纯化后的病毒感染效率在90％以上，远高于仅用PEG法或超滤法纯化的病毒。
Claims (10)
1.一种慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)用PEG与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀；
(2)用PBS溶解沉淀，对获得的慢病毒悬液进行核酸酶酶切处理；
(3)添加鱼精蛋白沉淀慢病毒，溶解病毒，离心，得到初纯化的慢病毒悬液；
(4)再经过蔗糖密度梯度离心，获得纯化的慢病毒。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)为：5X PEG按0.5-2:1体积比与病毒上清进行混合，3-5℃，沉淀1-3h，每10-30min将混合液颠倒混匀；3-5℃，4000-6000rpm，5-15min离心病毒混合液，弃上清，得到白色的慢病毒沉淀；所述5X PEG中添加了KCl或NaCl。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：5X PEG按0.5:1比例与病毒上清进行混合，4℃，沉淀2h，每20min将混合液颠倒混匀；4℃，5000rpm，10min离心病毒混合液，弃上清，得到白色的慢病毒沉淀。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)为：用10mL PBS溶解病毒沉淀，得到病毒溶液；在所述病毒溶液中添加1μL的核酸酶Benzonase酶进行酶切处理。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)为：添加0.5-2mg/mL鱼精蛋白35-40℃放置20-40min，离心，得到初纯化的慢病毒沉淀。
6.根据权利要求1或5所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：添加1mg/mL鱼精蛋白37℃放置30min，10000rpm，4℃，离心10min，得到初纯化的慢病毒沉淀。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)具体为：依次在超速离心管底部加入2mL 70％，1mL 50％，1mL 30％，4mL 20％蔗糖(v/w)浓度梯度溶液，20000rpm，4℃，离心2h；取30％-50％的溶液，每1mL加10mL PBS混匀，得到病毒-蔗糖-PBS混合液；再取新的超速离心管，底部加入6mL 20％蔗糖溶液，再加入病毒-蔗糖-PBS混合液，20000rpm，4℃，离心2h，弃掉上清，留下病毒沉淀，用1mL病毒保存液重悬病毒沉淀，4℃冰箱中1-2h溶解病毒沉淀，0.5h混匀一次；10000rpm，10min离心，取上清。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述慢病毒的滴度用QPCR法检测。
9.权利要求1-8任一所述的纯化方法在细胞感染中的应用。
10.权利要求1-8任一所述的纯化方法在基因表达中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111136995.0A CN113980916A (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种慢病毒的纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111136995.0A CN113980916A (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种慢病毒的纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113980916A true CN113980916A (zh) | 2022-01-28 |
Family
ID=79736899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111136995.0A Pending CN113980916A (zh) | 2021-09-27 | 2021-09-27 | 一种慢病毒的纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113980916A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114921425A (zh) * | 2022-07-04 | 2022-08-19 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种慢病毒的纯化方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104371982A (zh) * | 2014-10-21 | 2015-02-25 | 武汉维诺赛生物技术有限公司 | 一种慢病毒的纯化方法 |
| CN104845947A (zh) * | 2015-04-18 | 2015-08-19 | 湖北创瑞生物科技有限公司 | 一种重组单纯疱疹病毒的纯化方法 |
| CN105378074A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-03-02 | 费城儿童医院 | 在无血清悬浮细胞培养系统中生产重组慢病毒载体的可扩大的制造方法 |
| CN110268052A (zh) * | 2016-12-22 | 2019-09-20 | 蓝天疫苗有限责任公司 | 纯化病毒的方法 |
| CN110669793A (zh) * | 2019-10-15 | 2020-01-10 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 制备慢病毒颗粒包装ebovrna作为ebov核酸检测阳性参考品的方法 |
| US20200179506A1 (en) * | 2016-05-31 | 2020-06-11 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Zika virus vaccine and methods of production |
| CN111876393A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-11-03 | 恒瑞源正（上海）生物科技有限公司 | 一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法 |
-
2021
- 2021-09-27 CN CN202111136995.0A patent/CN113980916A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105378074A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-03-02 | 费城儿童医院 | 在无血清悬浮细胞培养系统中生产重组慢病毒载体的可扩大的制造方法 |
| CN104371982A (zh) * | 2014-10-21 | 2015-02-25 | 武汉维诺赛生物技术有限公司 | 一种慢病毒的纯化方法 |
| CN104845947A (zh) * | 2015-04-18 | 2015-08-19 | 湖北创瑞生物科技有限公司 | 一种重组单纯疱疹病毒的纯化方法 |
| US20200179506A1 (en) * | 2016-05-31 | 2020-06-11 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Zika virus vaccine and methods of production |
| CN110268052A (zh) * | 2016-12-22 | 2019-09-20 | 蓝天疫苗有限责任公司 | 纯化病毒的方法 |
| CN110669793A (zh) * | 2019-10-15 | 2020-01-10 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 制备慢病毒颗粒包装ebovrna作为ebov核酸检测阳性参考品的方法 |
| CN111876393A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-11-03 | 恒瑞源正（上海）生物科技有限公司 | 一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BOROUJENI 等: "The Superiority of Sucrose Cushion Centrifugation to Ultrafiltration and PEGylation in Generating High-Titer Lentivirus Particles and Transducing Stem Cells with Enhanced Efficiency", 《MOL BIOTECHNOL》, vol. 60, no. 3, 31 March 2018 (2018-03-31), pages 185 - 193, XP036439657, DOI: 10.1007/s12033-017-0044-5 * |
| 程志坚 等: "小鼠BMPR I b基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞", 《陕西医学杂志》, vol. 41, no. 7, 5 July 2012 (2012-07-05), pages 772 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114921425A (zh) * | 2022-07-04 | 2022-08-19 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种慢病毒的纯化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111154713B (zh) | 人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用 | |
| CN113980916A (zh) | 一种慢病毒的纯化方法 | |
| CN112410304A (zh) | 一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用 | |
| WO2016010154A1 (ja) | 抗原特異的ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞の製造方法 | |
| CN113373120B (zh) | Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用 | |
| CN111004776A (zh) | 一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法 | |
| CN114790463B (zh) | 稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法及其应用 | |
| CN106497975A (zh) | 基因重组干细胞制剂的制备方法及其在皮肤损伤修复、瘢痕抑制中的应用 | |
| CN115558638A (zh) | 胎盘间充质干细胞制备的外泌体及其用途 | |
| CN114645024A (zh) | 降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及dna残留的方法 | |
| WO2022071966A1 (en) | Bioreactor production of virus from adherent cells | |
| CN112391349A (zh) | 滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增nk细胞的方法 | |
| CN113136369A (zh) | 一种修饰有脂氧合酶基因的细胞及其制备方法和应用 | |
| CN113025660A (zh) | 一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法 | |
| CN116656616B (zh) | 一种制备外泌体的方法及其应用 | |
| CN118109410B (zh) | 一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用 | |
| CN113913397A (zh) | 一种溶瘤病毒的纯化方法 | |
| CN115386592B (zh) | 一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法 | |
| CN117777314B (zh) | 慢病毒载体及其应用 | |
| CN117801122B (zh) | 慢病毒载体及其应用 | |
| CN118166040A (zh) | 一种circRNA_17725过表达的工程化间充质干细胞、外泌体、其制备方法及应用 | |
| CN116590345B (zh) | 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用 | |
| JP2023537979A (ja) | 臨床グレードのレンチウイルスベクターを製造する方法 | |
| CN117660371A (zh) | 一种新型冠状病毒假病毒、表达细胞以及制备方法 | |
| CN116497023A (zh) | 基于CRISPR-Cas9靶向敲除人BNIP3基因的sgRNA、细胞系及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |