CN116590345B - 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用 - Google Patents

永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种永生化小鼠足细胞系的制备方法，包括：取6‑8天乳鼠肾脏，并分离得肾小球悬液；肾小球悬液培养得足细胞悬液；用携带SV40tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转染足细胞悬液中的足细胞，得转染细胞；转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系。永生化小鼠足细胞系及其在药物筛选中的应用。本发明具有降低永生化小鼠足细胞系的分化时间，提高永生化小鼠足细胞系的体外存活时间的有益效果。

Description

永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用
技术领域
本发明涉及永生化细胞技术领域。更具体地说，本发明涉及一种永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用。
背景技术
足细胞是肾小球一种特殊的终末分化细胞，足突紧紧地包裹着肾小球毛细血管，在维持肾脏的结构和功能中发挥重要作用。足细胞足突之间形成的裂隙隔膜、带有特殊窗孔的内皮细胞和基底膜共同组成了肾小球滤过屏障，阻挡了蛋白质和其他大分子的有效滤过。越来越多的研究证明足细胞结构和功能的改变是引起肾小球疾病的重要原因，且肾小球疾病是导致终末期肾病的主要原因，要进一步从细胞分子水平研究足细胞的生物学作用，必须进行足细胞的体外培养。由于肾小球足细胞是特殊终末分化的上皮细胞，不再进行分裂增殖，极大地限制人们对足细胞的认识和研究。因此，很有必要建立永生化足细胞系。
目前，建立的多种小鼠永生化足细胞系，例如存在分化时间长，体外培养时间短的问题，而且在提取原代足细胞过程中，存在操作难度大，耗时长，花费高的问题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种永生化小鼠足细胞系的制备方法，能够降低永生化小鼠足细胞系的分化时间，提高永生化小鼠足细胞系的体外存活时间，且有效降低操作难度大，耗时，花费。
本发明还有一个目的是提供一种永生化小鼠足细胞系，具有短的分化时间，长的体外存活时间。
本发明还有一个目的是提供一种永生化小鼠足细胞系的分化方法，具有短的分化时间。
本发明还有一个目的是提供永生化小鼠足细胞系在药物筛选中的应用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种永生化小鼠足细胞系的制备方法，包括以下步骤：
取6-8天乳鼠肾脏，并分离得肾小球悬液；
肾小球悬液培养得足细胞悬液；
用携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转染足细胞悬液中的足细胞，得转染细胞；
转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系。
优选的是，取7天乳鼠肾脏。
优选的是，从乳鼠肾脏中分离得肾小球悬液，具体为：
乳鼠肾脏在细胞培养皿中剁碎；
向细胞培养皿中加入组织裂解液，裂解后终止消化，得裂解后的肾脏组织；
将裂解后的肾脏组织碾碎后用70μm细胞筛过滤，用HBSS缓冲液正面冲洗滤网，收集过滤和冲洗后的滤液；
将滤液离心后重悬沉淀物，得肾小球悬液。
优选的是，组织裂解液包括1mg/mLⅣ型胶原酶、0.002U/mL DNaseⅠ，其中，裂解条件为：37℃裂解4-6min。
优选的是，肾小球悬液培养得足细胞悬液，具体为：
将肾小球悬液放入5％ CO2，37℃培养箱培养，在肾小球贴壁的第二天开始隔天换液一次，镜下观察待细胞的融合度达到80％后，将细胞消化下来，得细胞消化液；
将细胞消化液用40μm细胞筛过滤后在细胞培养皿中培养，隔天换液一次，镜下观察待细胞的融合度达到80％后，将细胞消化下来，离心后重悬沉淀物，得足细胞悬液。
优选的是，用携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转染足细胞悬液中的足细胞，得转染细胞，具体为：
足细胞悬液后用血球计数板计数，稀释到2×105cells/mL，得稀释后足细胞悬液；
按接种量为500uL/孔，将稀释后足细胞悬液接种到细胞培养板中，培养至细胞融合到70％时去除培养基，加入慢病毒稀释液，混匀后放于5％ CO2、37℃细胞培养箱孵育转染，其中，慢病毒稀释液为利用RPMI 1640完全培养基稀释携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒制备得到；
病毒感染细胞8-16h后，更换相同病毒滴度的培养基；
病毒感染细胞48h后，添加含0.5μg/mL浓度嘌呤霉素的培养基对细胞筛选两天；
继续培养细胞，直到细胞融合度达到90％，得转染细胞。
优选的是，转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系，具体为：
A1、用RPMI 1640完全培养基培养转染细胞，培养至细胞融合到80％时，将细胞消化下来，离心后重悬沉淀物，然后稀释到1个/100uL；
A2、按照接种量为100uL/孔，接种到96孔细胞培养板中培养，并对只有1个细胞的孔对应的细胞再进行一次同A1-A2的传代操作，得到单克隆细胞；
A3、将单克隆细胞依次传代至48孔、24孔、6孔细胞培养板进行扩增，得到永生化小鼠足细胞系。
利用所述的永生化小鼠足细胞系的制备方法制备得到的永生化小鼠足细胞系。
永生化小鼠足细胞系的分化方法，包括以下步骤：
利用永生化小鼠足细胞系的制备方法制备得到的永生化小鼠足细胞系；
取永生化小鼠足细胞系在39℃条件下培养分化。
所述永生化小鼠足细胞系在药物筛选中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
相对于传统永生化小鼠足细胞系，降低永生化小鼠足细胞系的分化时间，在39℃的条件下，4天开始分化；提高永生化小鼠足细胞系的体外存活时间达30天。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案所述实时荧光定量PCR检测永生化小鼠足细胞系、肾皮质足细胞特异性基因表达图；
图2为本发明的其中一种技术方案所述实时荧光定量PCR检测永生化小鼠足细胞系、肾皮质PECs特异性基因表达图；
图3为本发明的其中一种技术方案所述实时荧光定量PCR检测永生化小鼠足细胞系、肾皮质肾小管上皮细胞特异性基因表达图；
图4为本发明的其中一种技术方案所述实时荧光定量PCR检测永生化小鼠足细胞系、肾皮质系膜细胞特异性基因表达图；
图5为本发明的其中一种技术方案所述实时荧光定量PCR检测永生化小鼠足细胞系、肾皮质内皮细胞特异性基因表达图；
图6为本发明的其中一种技术方案所述足细胞在不同温度下培养的增殖曲线；
图7为本发明的其中一种技术方案所述足细胞体外存活5天时足细胞光学显微镜细胞形态图；
图8为本发明的其中一种技术方案所述足细胞体外存活10天时足细胞光学显微镜细胞形态图；
图9为本发明的其中一种技术方案所述足细胞体外存活20天时足细胞光学显微镜细胞形态图；
图10为本发明的其中一种技术方案所述足细胞体外存活30天时足细胞光学显微镜细胞形态图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
永生化小鼠足细胞系的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取6-8天乳鼠肾脏，并分离得肾小球悬液，具体为：
步骤1.1、取6-8天新生乳鼠肾脏；
步骤1.2、将取出的乳鼠肾脏在6cm细胞培养皿中剁碎，剁碎的粒径约为1-2mm3；
步骤1.3、在细胞培养皿中加入组织裂解液，37℃裂解4-6min后，加入胎牛血清(FBS：fetal bovine serum)终止消化，得裂解之后的肾脏组织，其中，组织裂解液包括1mg/mLⅣ型胶原酶、0.002U/mL DNaseⅠ，公知足细胞在肾小球滤过屏障中所处的特殊解剖位置及其复杂精细的结构，使得足细胞容易受到损伤，若损伤因素持续存在和/或损伤程度持续加重，将可能导致足细胞凋亡，在该步骤中通过Ⅳ型胶原酶、DNaseⅠ配合裂解，提高裂解效果，降低对细胞的损伤；
步骤1.4、将裂解之后的肾脏组织碾碎，用70μm细胞筛过滤，用HBSS缓冲液(D-Hank's平衡盐溶液)正面冲洗滤网，收集过滤和冲洗后的滤液，在该步骤中，相对于传统的连续过两道筛，降低对细胞的损伤，特别是对足细胞的损伤，因为足细胞是包裹在肾小球的外侧，两次过筛容易造成足细胞损伤；
步骤1.5、随后将滤液1000×g，4℃，离心5-8min，吸弃上清液，用RPMI 1640完全培养基(含10％FBS+1％青-链霉素)重悬沉淀物，得肾小球悬液；
综上，在步骤一中，通过裂解酶以及过筛情况的设置，减少细胞源头损伤，进一步在分化天数和存活天数上体现出优势；
步骤二、肾小球悬液培养得足细胞悬液；
步骤2.1、将肾小球悬液放入5％ CO2，37℃培养箱培养，在肾小球贴壁的第二天开始隔天换液一次，显微镜下观察肾小球外层细胞向外扩展的情况，待肾小球贴壁，细胞的融合度达到80％后，用胰酶细胞消化液(含胰酶的质量体积比(g/mL)为0.25％，含EDTA的质量体积比0.02-0.1％)将细胞消化下来，得细胞消化液；
步骤2.2、将细胞消化液用40μm细胞筛过滤(主要目的在于过滤掉有系膜细胞和内膜细胞组成的肾小球核)，在细胞培养皿中培养足细胞，隔天换液一次，镜下观察足细胞的形态和融合度，待细胞的融合度达到80％，用胰酶细胞消化液将细胞消化下来，1000×g，4℃，离心5min，用RPMI 1640完全培养基重悬沉淀物，得足细胞悬液；
步骤三、用携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转染足细胞悬液中的足细胞，得转染细胞；
将足细胞悬液用血球计数板计数，稀释到浓度为2×105cells/mL；
按照接种量为500uL/孔，将足细胞悬液均匀接种到24孔细胞培养板中培养，待细胞融合到70％时去除培养基，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后加入慢病毒稀释液，混匀后放于5％ CO2、37℃细胞培养箱孵育转染，其中，慢病毒稀释液为利用RPMI 1640完全培养基稀释携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒制备得到，慢病毒稀释液与RPMI 1640完全培养基按照体积比为1：100稀释；
V40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒为购买的pLenti-SV40 Large T(tsA58)-puro慢病毒低度液，货号为CI0003，规格为5*200μL，滴度≥108TU/mL，即每毫升病毒液中至少含有1*108个具有生物活性的病毒颗粒；
病毒感染细胞8-16h后，更换慢病毒稀释液；
病毒感染细胞48h后，添加含0.5μg/mL浓度嘌呤霉素的培养基对细胞筛选两天，用于筛选去除转染不成功的细胞；
继续培养细胞，直到细胞融合度达到90％，得转染细胞；
步骤四、转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系
S9、转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系，具体的：
A1、用RPMI 1640完全培养基继续培养细胞，培养后将细胞用胰酶细胞消化液消化下来，1000×g，4℃，离心5min，用RPMI 1640完全培养基重悬后细胞计数，稀释到1个/100uL；
A2、按照接种量为100uL/孔，接种到96孔细胞培养板中培养，并对只有1个细胞的孔对应的细胞再进行一次同A1-A2的传代操作，得到单克隆细胞，其中，接种培养4h后观察对只有1个细胞的孔进行标计；
A3、将单克隆细胞依次传代至48孔、24孔、6孔细胞培养板进行扩增，得到永生化小鼠足细胞系。
实施例1
永生化小鼠足细胞系的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取7天乳鼠肾脏，并分离得肾小球悬液，具体为：
步骤1.1、取7天新生乳鼠肾脏；
步骤1.2、将取出的乳鼠肾脏在6cm细胞培养皿中剁碎，剁碎的粒径约为1-2mm3；步骤1.3、在细胞培养皿中加入组织裂解液，37℃裂解5min后，加入胎牛血清(FBS：fetalbovine serum)终止消化，得裂解之后的肾脏组织，其中，组织裂解液包括1mg/mLⅣ型胶原酶、0.002U/mLDNaseⅠ；
步骤1.4、将裂解之后的肾脏组织碾碎，用70μm细胞筛过滤，用HBSS缓冲液(D-Hank's平衡盐溶液)正面冲洗滤网，收集过滤和冲洗后的滤液；
步骤1.5、随后将滤液1000×g，4℃，离心5min，吸弃上清液，用RPMI 1640完全培养基(含10％ FBS+1％青-链霉素)重悬沉淀物，得肾小球悬液；
步骤二、肾小球悬液培养得足细胞悬液；
步骤2.1、将肾小球悬液放入5％ CO2，37℃培养箱培养，在肾小球贴壁的第二天开始隔天换液一次，显微镜下观察肾小球外层细胞向外扩展的情况，待肾小球贴壁，细胞的融合度达到80％后，用胰酶细胞消化液(含胰酶的质量体积比(g/mL)为0.25％，含EDTA的质量体积比0.02％)将细胞消化下来，得细胞消化液；
步骤2.2、将细胞消化液用40μm细胞筛过滤，在细胞培养皿中培养足细胞，隔天换液一次，镜下观察足细胞的形态和融合度，待细胞的融合度达到80％，用胰酶细胞消化液将细胞消化下来，1000×g，4℃，离心5min，用RPMI 1640完全培养基重悬沉淀物，得足细胞悬液；
步骤三、用携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转染足细胞悬液中的足细胞，得转染细胞；
将足细胞悬液用血球计数板计数，稀释到浓度为2×105cells/mL；
按照接种量为500uL/孔，将足细胞悬液均匀接种到24孔细胞培养板中培养，待细胞融合到70％时去除培养基，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后加入慢病毒稀释液，混匀后放于5％ CO2、37℃细胞培养箱孵育转染，其中，慢病毒稀释液为利用RPMI 1640完全培养基稀释携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒制备得到，V40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒为购买的pLenti-SV40 Large T(tsA58)-puro慢病毒低度液，货号为CI0003，规格为5*200μL，滴度≥108TU/mL，即每毫升病毒液中至少含有1*108个具有生物活性的病毒颗粒；
病毒感染细胞8-16h后，更换慢病毒稀释液；
病毒感染细胞48h后，添加含0.5μg/mL浓度嘌呤霉素的培养基对细胞筛选两天，用于筛选去除转染不成功的细胞；
继续培养细胞，直到细胞融合度达到90％，得转染细胞；
步骤四、转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系
S9、转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系，具体的：
A1、用RPMI 1640完全培养基继续培养细胞，培养后将细胞用胰酶细胞消化液消化下来，1000×g，4℃，离心5min，用RPMI 1640完全培养基重悬后细胞计数，稀释到1个/100uL；
A2、按照接种量为100uL/孔，接种到96孔细胞培养板中培养，并对只有1个细胞的孔对应的细胞再进行一次同A1-A2的传代操作，得到单克隆细胞，其中，接种培养4h后观察对只有1个细胞的孔进行标计；
A3、将单克隆细胞依次传代至48孔、24孔、6孔细胞培养板进行扩增，得到永生化小鼠足细胞系。
实施例2
永生化小鼠足细胞系的分化方法，包括以下步骤：
按照实施例1的制备方法制备得到的永生化小鼠足细胞系；
取实施例1制得的永生化小鼠足细胞系中足细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1×104个细胞；
将24孔细胞培养板放入39℃条件下分化培养。
实施例3
永生化小鼠足细胞系在药物筛选中的应用，具体的：利用永生化小鼠足细胞系构建体外足细胞损伤模型，用于药物筛选。
对比例1
永生化小鼠足细胞系的分化方法，包括以下步骤：
按照实施例1的制备方法制备得到的永生化小鼠足细胞系；
取实施例1制得的永生化小鼠足细胞系中足细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1×104个细胞；
将24孔细胞培养板放入33℃条件下分化培养。
实验1采用实时荧光定量PCR对实施例1得到的永生化小鼠足细胞系进行鉴定，具体方法如下：
针对足细胞特异性的基因，用实时荧光定量PCR检测实施例1得到的永生化小鼠足细胞系中：
A、足细胞特异性基因(Wt1、Synpo、Thsd7a、Nphs1和Nphs2)；
B、PECs特异性基因(Cldn1、Pax8和Krt8)；
C、肾小管上皮细胞特异性基因(Slc5a2、Slc34a1和Fxyd2)；
D、系膜细胞特异性基因(Padgftb和Gata3)；
E、内皮细胞特异性基因(Pecam1和Flt1)的表达，并以肾皮质(MKC)细胞作为对照，进行足细胞鉴定，如图1-5所示，由图1-5可知，永生化小鼠足细胞系中的基因的表达符合足细胞的特征。
实验2、对实施例1、对比例1得到的永生化小鼠足细胞系进入分化的时间进行测定，具体方法如下：
实施例1、对比例1在进行分化培养的过程中，每隔24h将细胞消化下来，用血球计数板计数，选定4个1mm2区域计细胞数，(细胞数)/mm2＝(四个区域细胞总数/4)，第六天足细胞长满培养板后停止计数，以培养天数为横坐标，(细胞数)/mm2为纵坐标作足细胞在不同温度下的增殖曲线，如图6所示，由图6可知，足细胞在33℃时，在第四天开始了细胞指数增长，未出现明显分化现象，在39℃时，在第4天足细胞就开始分化，相对于现有的永生化小鼠足细胞系(相较于实施例1，其区别在于制备过程中以6周小鼠肾脏分离得肾小球悬液，将裂解之后的肾脏组织碾碎后先后依次经过孔径为100μm、70μm的筛网)在12天才能分化，本申请的永生化小鼠足细胞系大大降低了足细胞的分化分时间，提高实验效率。
实验3、在39℃下，永生化小鼠足细胞系中足细胞体外生存时长测定，具体实验操作方法：
取按照实施例1制得的永生化小鼠足细胞系中足细胞分别接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1×104个细胞；
通过光学显微镜观察通过实施例1制得的永生化小鼠足细胞系中足细胞在39℃下5天、10天、20天、30天的细胞状态，如图7-10所示，从图7-10可知：在39℃下，足细胞体外生存时长至少为30天，相对于现有的永生化小鼠足细胞系存活时间增加。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.永生化小鼠足细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取6-8天乳鼠肾脏，并分离得肾小球悬液；
肾小球悬液培养得足细胞悬液；
用携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转染足细胞悬液中的足细胞，得转染细胞；
转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系；
其中，从乳鼠肾脏中分离得肾小球悬液，具体为：
乳鼠肾脏在细胞培养皿中剁碎；
向细胞培养皿中加入组织裂解液，裂解后终止消化，得裂解后的肾脏组织；组织裂解液包括1mg/mLⅣ型胶原酶、0.002U/mL DNaseⅠ，其中，裂解条件为：37℃裂解4-6min；
将裂解后的肾脏组织碾碎后用70μm细胞筛过滤，用HBSS缓冲液正面冲洗滤网，收集过滤和冲洗后的滤液；
将滤液离心后重悬沉淀物，得肾小球悬液。
2.如权利要求1所述的永生化小鼠足细胞系的制备方法，其特征在于，取7天乳鼠肾脏。
3.如权利要求1所述的永生化小鼠足细胞系的制备方法，其特征在于，肾小球悬液培养得足细胞悬液，具体为：
将肾小球悬液放入5％CO2，37℃培养箱培养，在肾小球贴壁的第二天开始隔天换液一次，镜下观察待细胞的融合度达到80％后，将细胞消化下来，得细胞消化液；
将细胞消化液用40μm细胞筛过滤后在细胞培养皿中培养，隔天换液一次，镜下观察待细胞的融合度达到80％后，将细胞消化下来，离心后重悬沉淀物，得足细胞悬液。
4.如权利要求1所述的永生化小鼠足细胞系的制备方法，其特征在于，用携带SV40tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转染足细胞悬液中的足细胞，得转染细胞，具体为：
足细胞悬液后用血球计数板计数，稀释到2×105cells/mL，得稀释后足细胞悬液；
按接种量为500uL/孔，将稀释后足细胞悬液接种到细胞培养板中，培养至细胞融合到70％时去除培养基，加入慢病毒稀释液，混匀后放于5％CO2、37℃细胞培养箱孵育转染，其中，慢病毒稀释液为利用RPMI 1640完全培养基稀释携带SV40 tsA58和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒制备得到；
病毒感染细胞8-16h后，更换相同病毒滴度的培养基；
病毒感染细胞48h后，添加含0.5μg/mL浓度嘌呤霉素的培养基对细胞筛选两天；
继续培养细胞，直到细胞融合度达到90％，得转染细胞。
5.如权利要求1所述的永生化小鼠足细胞系的制备方法，其特征在于，转染细胞传代培养，筛选建立永生化小鼠足细胞系，具体为：
A1、用RPMI 1640完全培养基培养转染细胞，培养至细胞融合到80％时，将细胞消化下来，离心后重悬沉淀物，然后稀释到1个/100uL；
A2、按照接种量为100uL/孔，接种到96孔细胞培养板中培养，并对只有1个细胞的孔对应的细胞再进行一次同A1-A2的传代操作，得到单克隆细胞；
A3、将单克隆细胞依次传代至48孔、24孔、6孔细胞培养板进行扩增，得到永生化小鼠足细胞系。
6.永生化小鼠足细胞系的分化方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用如权利要求1-5任一项所述的永生化小鼠足细胞系的制备方法制备得到的永生化小鼠足细胞系；
取永生化小鼠足细胞系在39℃条件下培养分化。
7.利用如权利要求1-5任一项所述的永生化小鼠足细胞系的制备方法制备得到的永生化小鼠足细胞系。
8.权利要求7所述永生化小鼠足细胞系在药物筛选中的应用。
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