CN114908035A - 肾足细胞和肾小球内皮细胞共培养模型及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肾足细胞/肾小球内皮细胞共培养模型，构建所述模型的方法，以及所述共培养模型的用途，特别是检测细胞毒害污染物的用途。

Description

肾足细胞和肾小球内皮细胞共培养模型及其应用
技术领域
本发明涉及一种肾足细胞/肾小球内皮细胞共培养模型，构建所述模型的方法，以及所述共培养模型的用途，特别是检测细胞毒害污染物的用途。
背景技术
传统毒理学实验方法多基于动物体内实验来评价毒性，该方法有伦理问题，价格昂贵，无法避免种属差异等问题，难以应用于初步评判种类数量庞大的环境污染物。体外细胞模型可以从一定程度上解决这些问题，为快速准确评价这些环境有机污染物的毒性提供初步基础理论依据。
虽然不断有新的污染物体外单一细胞评价模型建立，但单一细胞培养不能实施细胞之间通讯机制是限制其评价效果的一大阻碍。在原生组织和器官中，细胞存在于三维微环境中，细胞之间、细胞与胞外基质之间存在复杂的相互作用。传统体外单一细胞培养技术不能充分反映或复制细胞在体内的特性，无法动态观察细胞的相互作用，这使得单一细胞培养在药物筛选和其他组织工程应用中准确性差，范围受到限制。
因此，亟需一种可有效实施细胞间通讯的体外细胞培养模型，以用于准确评价细胞毒害污染物的毒性。
发明内容
肾小球滤过屏障是迄今为止最复杂的生物膜，主要由三层组成：内皮细胞层，基底膜，足细胞层。滤过屏障的每一个组成部分在结构和功能上紧密相关，任何一部分的损伤都可能引起肾小球滤过功能的改变，但其分子机制仍然很大程度上是未知的。本申请发明人首次建立了肾足细胞/肾小球内皮细胞体外共培养模型，所述共培养模型可有效实施肾足细胞和肾小球内皮细胞之间的细胞通讯，可用于初步准确评价待测物的细胞毒性；此外，本发明的共培养模型还具备操作简便等优点。
共培养模型
因此，在一方面，本申请提供了一种体外共培养模型，其包含细胞共培养装置，所述细胞共培养装置包括至少一个嵌入式共培养单元，所述嵌入式共培养单元包括嵌入放置在第一容器中的第二容器，所述第二容器通过通透性膜与所述第一容器实现流体相通；所述第一容器培养有第一细胞，所述第二容器培养有第二细胞；
其中，所述第一细胞为肾足细胞，所述第二细胞为肾小球内皮细胞；或者，所述第一细胞为肾小球内皮细胞，所述第二细胞为肾足细胞。
如本文所用，所述“嵌入放置”意于表示，所述第二容器置入所述第一容器之后，将所述共培养单元划分为两个相对的用于细胞培养的区室，即，所述第二容器的底部不与所述第一容器的底部直接接触。
在某些实施方案中，所述第一细胞不与所述第二容器以及所述第二细胞直接接触。
在某些实施方案中，所述肾足细胞和所述肾小球内皮细胞为细胞系。在某些实施方案中，所述肾足细胞为大鼠肾足细胞系。
在某些实施方案中，所述肾小球内皮细胞为人肾小球内皮细胞系。
在某些实施方案中，所述第二容器为Transwell嵌套。
如本文所用，所述“Transwell嵌套”涉及由支持物(例如，孔板)支撑的具有包含多个过滤孔的底面的可移动插入腔室。
在某些实施方案中，所述通透性膜为多孔滤膜，其滤孔的等效孔径小于3μm。
在某些实施方案中，所述滤孔的等效孔径为0.05-3.0μm(例如，0.1-3.0μm、0.2-3.0μm、0.3-3.0μm、0.4-3.0μm、0.1-2.0μm、0.1-1.0μm)。在某些实施方案中，所述滤孔的等效孔径为0.4μm。
在某些实施方案中，所述第一容器为细胞培养板(例如，细胞培养孔板)。
在某些实施方案中，所述体外共培养模型具备以下特征的一项或多项：
(1)所述通透性膜位于所述第二容器的底部；
(2)所述第二细胞贴壁培养于所述第二容器的底部；
(3)所述第一细胞贴壁培养于所述第一容器的底部；
(4)所述用于培养所述肾小球内皮细胞的容器的底部包被有纤连蛋白。
在某些实施方案中，所述第一容器含有第一培养基，所述第二容器含有第二培养基。
在某些实施方案中，所述第一培养基和所述第二培养基相同或不相同。
在某些实施方案中，所述第一培养基和所述第二培养基不含内皮细胞生长添加剂。
如本文所用，所述“内皮细胞生长添加剂”，简称ECGS，是指含有正常哺乳动物内皮细胞(例如微血管内皮细胞)培养所必需的生长因子(例如，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性FGF(bFGF))、激素和蛋白质的培养基补充剂，其一般提取自牛神经组织。本领域常用的ECGS一般可购自ScienCell公司(货号：1052)、Sigma-aldrich公司(货号：E2759)等。
在某些实施方案中，所述第一培养基和/或所述第二培养基为包含血清的基础培养基。在某些实施方案中，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12(例如，DMEM/F12(1:1))。
在某些实施方案中，所述血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
在某些实施方案中，所述血清的浓度为5％-20％，例如5％-15％，5％-10％，10％-20％，10％-15％。
在某些实施方案中，所述第一培养基由血清(例如5％-20％的胎牛血清、新生牛血清或小牛血清)和基础培养基以及任选的抗生素组成。在某些实施方案中，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12(例如，DMEM/F12(1:1))。
在某些实施方案中，所述第二培养基由血清(例如5％-20％的胎牛血清、新生牛血清或小牛血清)和基础培养基以及任选的抗生素组成。在某些实施方案中，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12(例如，DMEM/F12(1:1))。
共培养模型构建方法
在另一方面，本申请还提供了构建如上所述的体外共培养模型的方法，其包括在所述第一容器中接种所述第一细胞，在所述第二容器中接种所述第二细胞的步骤。
在所述方法的某些实施方案中，所述第一细胞为肾足细胞，所述第二细胞为肾小球内皮细胞。
在所述方法的某些实施方案中，所述肾足细胞和所述肾小球内皮细胞为细胞系。
在某些实施方案中，所述肾足细胞为大鼠肾足细胞系。
在某些实施方案中，所述肾小球内皮细胞为人肾小球内皮细胞系。
在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)(a)使用含内皮细胞生长添加剂的培养基在所述第二容器中接种所述肾小球内皮细胞；
(b)梯度降低所述第二容器的培养体系中内皮细胞生长添加剂的浓度，直至所述培养体系中不含内皮细胞生长添加剂；
(2)使用不含内皮细胞生长添加剂的培养基在所述第一容器中接种所述肾足细胞；
其中，步骤(1)和步骤(2)以任意顺序进行。
在某些实施方案中，所述含内皮细胞生长添加剂的培养基是ECM培养基。
如本文所用，所述“ECM培养基”是指ECM完全培养基，其为专门为正常内皮细胞体外培养设计的适于其生长的完全培养基，其包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和血清。市售的ECM培养基(例如，ScienCell公司，货号：1001)以包含ECM基础培养基和内皮细胞生长添加剂以及任选的其他组分(例如血清)的套装形式进行售卖，使用前将套装内的ECM基础培养基和内皮细胞生长添加剂以及任选的其他组分(例如血清)进行混合制备成ECM完全培养基待用。除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“ECM培养基”指ECM完全培养基，所述ECM完全培养基包含ECM基础培养基和内皮细胞生长添加剂。
在某些实施方案中，步骤(1)(a)中，所述培养基中内皮细胞生长添加剂的浓度为0.8％-1.5％(例如，1％)。
在某些实施方案中，步骤(1)(a)中，所述培养基还含有血清。在某些实施方案中，所述血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。在某些实施方案中，所述血清的浓度为5％-20％，例如5％-15％，5％-10％，10％-20％，10％-15％。
在某些实施方案中，步骤(2)中，所述培养基还含有血清。在某些实施方案中，所述血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。在某些实施方案中，所述血清的浓度为5％-20％，例如5％-15％，5％-10％，10％-20％，10％-15％。
在某些实施方案中，在步骤(1)中所述第二容器未嵌入第一容器中。在某些实施方案中，所述方法还包括(3)：将步骤(1)获得的第二容器嵌入放置于步骤(2)获得的第一容器中。
在某些实施方案中，在步骤(3)中所述第一容器的培养基和所述第二容器的培养基相同。在某些实施方案中，所述培养基为不含内皮细胞生长添加剂的包含血清的基础培养基。在某些实施方案中，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12(例如，DMEM/F12(1:1))。在某些实施方案中，所述血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。在某些实施方案中，所述血清的浓度为5％-20％，例如5％-15％，5％-10％，10％-20％，10％-15％。在某些实施方案中，所述培养基由血清(例如5％-20％的胎牛血清、新生牛血清或小牛血清)和基础培养基以及任选的抗生素组成。在某些实施方案中，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12(例如，DMEM/F12(1:1))。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)包括：使用不含内皮细胞生长添加剂的培养基置换所述第二容器中的培养基。
在某些实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中所使用的所述不含内皮细胞生长添加剂的培养基相同。在某些实施方案中，步骤(1)最终获得的培养体系包含与步骤(2)相同的不含内皮细胞生长添加剂的培养基。在某些实施方案中，所述不含内皮细胞生长添加剂的培养基为包含血清的基础培养基。在某些实施方案中，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12(例如，DMEM/F12(1:1))。在某些实施方案中，所述不含内皮细胞生长添加剂的培养基由血清(例如5％-20％的胎牛血清、新生牛血清或小牛血清)和基础培养基以及任选的抗生素组成。在某些实施方案中，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12(例如，DMEM/F12(1:1))。
在某些实施方案中，步骤(2)中，所述培养基还含有血清。在某些实施方案中，所述血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。在某些实施方案中，所述血清的浓度为5％-20％，例如5％-15％，5％-10％，10％-20％，10％-15％。
易于理解，步骤(1)(b)中，可通过本领域已知的多种方法，实现梯度降低所述第二容器的培养体系中内皮细胞生长添加剂的浓度，直至所述培养体系中不含内皮细胞生长添加剂。例如，可通过使用不含内皮细胞生长添加剂的培养基置换所述第二容器中的培养基的方式来实现。所述置换方法的一个示例性实施方案如下：
(i)一次置换：
接种所述肾小球内皮细胞后，使用无内皮细胞生长添加剂的培养基(例如，含10％FBS的DMEM-H培养基)置换部分体积的步骤(1)(a)中所述第二容器中的培养基，并培养细胞；
(ii)二次置换：
使用(i)中所述的无内皮细胞生长添加剂的培养基(例如，含10％FBS的DMEM-H培养基)置换部分体积的经所述一次置换后的所述第二容器中的培养基，并培养细胞；
(iii)去除经所述二次置换后的所述第二容器中的培养基，加入无内皮细胞生长添加剂的培养基(例如，含10％FBS的DMEM培养基、含10％FBS的DMEM/F12培养基(例如DMEM/F12(1:1)培养基))。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)(iii)中加入的所述无内皮细胞生长添加剂的培养基与步骤(2)中所使用的所述不含内皮细胞生长添加剂的培养基相同。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)(i)中所述的无内皮细胞生长添加剂的培养基与步骤(1)(b)(iii)中加入的所述无内皮细胞生长添加剂的培养基不相同。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)(i)中所述的无内皮细胞生长添加剂的培养基为包含血清(例如5％-20％的胎牛血清、新生牛血清或小牛血清)的DMEM-H培养基。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)(i)中所述的无内皮细胞生长添加剂的培养基由血清(例如5％-20％的胎牛血清、新生牛血清或小牛血清)和DMEM-H基础培养基以及任选的抗生素组成。
在某些实施方案中，所述置换方法的一个示例性实施方案如下：
(i)一次置换：
接种所述肾小球内皮细胞3-5h(例如4h)后，使用无内皮细胞生长添加剂的培养基(例如，含10％FBS的DMEM-H培养基)置换50％体积的步骤(1)(a)中所述第二容器中的培养基，并培养细胞3-5h(例如4h)；
(ii)二次置换：
使用(i)中所述的无内皮细胞生长添加剂的培养基(例如，含10％FBS的DMEM-H培养基)置换50％体积的经所述一次置换后的所述第二容器中的培养基，并培养细胞10-18h(例如12-16h)；
(iii)去除经所述二次置换后的所述第二容器中的培养基，加入无内皮细胞生长添加剂的培养基(例如，含10％FBS的DMEM培养基、含10％FBS的DMEM/F12培养基(例如DMEM/F12(1:1)培养基))。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)(iii)中加入的所述无内皮细胞生长添加剂的培养基与步骤(2)中所使用的所述不含内皮细胞生长添加剂的培养基相同。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)(i)中所述的无内皮细胞生长添加剂的培养基与步骤(1)(b)(iii)中加入的所述无内皮细胞生长添加剂的培养基不相同。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)(i)中所述的无内皮细胞生长添加剂的培养基为包含血清(例如5％-20％的胎牛血清、新生牛血清或小牛血清)的DMEM-H培养基。
在某些实施方案中，步骤(1)(b)(i)中所述的无内皮细胞生长添加剂的培养基由血清(例如5％-20％的胎牛血清、新生牛血清或小牛血清)和DMEM-H基础培养基以及任选的抗生素组成。
在某些实施方案中，所述方法还包括在所述第二容器的底部包被纤连蛋白的步骤。
在某些实施方案中，所述纤连蛋白的包被浓度为10-40μg/μL(例如，10-30μg/μL，10-25μg/μL，10-20μg/μL，10-15μg/μL，15-40μg/μL，15-30μg/μL。在某些实施方案中，所述纤连蛋白的包被浓度为15-30μg/μL。
在某些实施方案中，所述方法包含以下特征的一项或多项；
(i)所述肾足细胞的接种密度为1.0×105-3.0×105个/ml；
(ii)所述肾小球内皮细胞的接种密度为1.0×105-3.0×105个/ml；
(iii)所述肾足细胞和/或所述肾小球内皮细胞经传代3-6代之后接种于所述第一容器或所述第二容器中；
(iv)所述肾足细胞的消化用胰酶浓度为0.20％-0.30％(例如0.25％)；
(v)所述肾小球内皮细胞的消化用胰酶浓度为0.03％-0.07％(例如0.05％)。
用途
在另一方面，本申请还提供了如上所述的体外共培养模型用于检测待测物细胞毒性的用途。在某些实施方案中，所述待测物为可能会造成肾脏损伤的物质。
检测方法
在另一方面，本申请还提供了一种检测待测物的细胞毒性的方法，其包括使用如上所述的体外共培养模型。
在所述方法的某些实施方案中，所述第一细胞为肾足细胞，所述第二细胞为肾小球内皮细胞。
在某些实施方案中，所述肾足细胞和所述肾小球内皮细胞为细胞系。
在某些实施方案中，在某些实施方案中，所述肾足细胞为大鼠肾足细胞系。
在某些实施方案中，所述肾小球内皮细胞为人肾小球内皮细胞系。
在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)将如上所述的共培养模型中的肾足细胞与所述待测物接触并培养；
(2)去除所述待测物；
(3)将所述肾足细胞与所述肾小球内皮细胞在所述共培养模型中进行共培养；
(4)检测所述肾小球内皮细胞的活性指标，从而判断所述待测物的细胞毒性。
在某些实施方案中，所述待测物不添加至所述共培养模型中的所述第二容器中。在某些实施方案中，所述共培养模型中的肾小球内皮细胞不与所述待测物接触。
在某些实施方案中，所述待测物为可能会造成肾脏损伤的物质。
例如，当以三氯生或者或苯并(A)芘为待测物时，在所述方法的一个示例性实施方案中，所述方法具备以下一个或多个特征：
(i)步骤(1)中，将如上所述的共培养模型中的肾足细胞与所述待测物接触并培养0.5-2h；
(ii)步骤(3)中，将所述肾足细胞与所述肾小球内皮细胞在所述共培养模型中共培养16-30h(例如24h)。
在某些实施方案中，所述肾小球内皮细胞的活性指标选自：活细胞比例，死细胞比例，细胞周期分布，Ang-l、Ang-2表达量或其比例(例如，Ang-1/Ang-2)，超氧化物歧化酶(SOD)活性，凋亡相关因子(例如Bax、Caspase-3)表达量，细胞形态，肾小球内皮细胞过滤屏障功能，及其组合。
在某些实施方案中，当所述活细胞比例显著低于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的活细胞比例，和/或，所述死细胞比例显著高于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的死细胞比例，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，所述细胞周期分布包括S期的细胞比例、G2/M细胞比例和/或增殖率((S期+G2/M期)比例)，当处于S期的细胞比例、G2/M细胞比例和/或增殖率((S期+G2/M期)比例)显著低于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞进行的相应比例，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，当所述Ang-1/Ang-2比值显著低于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞培养上清中Ang-1/Ang-2的比值，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，当所述超氧化物歧化酶(SOD)活性显著低于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，当所述Bax或Caspase-3的表达量显著高于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的Bax或Caspase-3的表达量，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，所述肾小球内皮细胞过滤屏障功能通过渗透系数确定，当所述渗透系数显著高于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的渗透系数，则指示所述待测物具备细胞毒性。
例如，当选择活细胞或死细胞比例作为所述肾小球内皮细胞的活性指标时，在所述方法的某些实施方案中，所述步骤(4)包括：
(i)检测所述肾小球内皮细胞的活细胞或死细胞比例；
(ii)将所述活细胞或死细胞比例与未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的活细胞或死细胞比例进行比较；
(iii)当所述活细胞比例显著低于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞进行的活细胞比例，和/或，所述死细胞比例显著高于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞进行的死细胞比例，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，所述活细胞比例可通过CCK-8法或活细胞染色法(例如Calcein-AM染色)进行检测。
在某些实施方案中，所述死细胞比例可通过死细胞染色法(例如PI染色)进行检测。
例如，当选择细胞周期分布作为所述肾小球内皮细胞的活性指标时，在所述方法的某些实施方案中，所述步骤(4)包括：
(i)检测所述肾小球内皮细胞处于各细胞周期的细胞分布；
(ii)将所述处于各细胞周期的细胞分布比例与未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的处于各细胞周期的细胞分布进行比较；
(iii)当处于S期的细胞比例、G2/M细胞比例和/或增殖率((S期+G2/M期)比例)显著低于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞进行的相应比例，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，所述处于各细胞周期的细胞分布可通过流式细胞术进行检测。
例如，当选择血管生成素(Ang)作为所述肾小球内皮细胞的活性指标时，在所述方法的某些实施方案中，所述步骤(4)包括：
(i)检测所述肾小球内皮细胞的培养上清中Ang-1/Ang-2比值；
(ii)将所述Ang-1/Ang-2比值与未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞培养上清中的Ang-1/Ang-2比值进行比较；
(iii)当所述Ang-1/Ang-2比值显著低于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞培养上清中Ang-1/Ang-2的比值，则指示所述待测物具备细胞毒性。
例如，当选择超氧化物歧化酶(SOD)活性作为所述肾小球内皮细胞的活性指标时，在所述方法的某些实施方案中，所述步骤(4)包括：
(i)检测所述肾小球内皮细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性；
(ii)将所述超氧化物歧化酶(SOD)活性与未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性进行比较；
(iii)当所述超氧化物歧化酶(SOD)活性显著低于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性，则指示所述待测物具备细胞毒性。
例如，当选择凋亡相关因子Bax或Caspase-3的表达量作为所述肾小球内皮细胞的活性指标时，在所述方法的某些实施方案中，所述步骤(4)包括：
(i)检测所述肾小球内皮细胞Bax或Caspase-3的表达量；
(ii)将所述Bax或Caspase-3的表达量与未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的Bax或Caspase-3的表达量进行比较；
(iii)当所述Bax或Caspase-3的表达量显著高于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的Bax或Caspase-3的表达量，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，所述Bax或Caspase-3的表达量为相对于细胞内保守表达蛋白(例如，GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的相对表达量。
在某些实施方案中，可通过Western blot检测所述Bax或Caspase-3的表达量。
例如，当选择肾小球内皮细胞过滤屏障功能作为所述肾小球内皮细胞的活性指标时，在所述方法的某些实施方案中，所述步骤(4)包括：
(i)检测所述肾小球内皮细胞肾小球内皮细胞对通透性标志物的渗透系数；
(ii)将所述渗透系数与未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的渗透系数进行比较；
(iii)当所述渗透系数显著高于未经待测物处理的对照肾小球内皮细胞的渗透系数，则指示所述待测物具备细胞毒性。
在某些实施方案中，可通过荧光标记的通透性标志物(例如，FITC-labeled BSA，荧光素钠)对肾小球内皮细胞肾小球内皮细胞的过率屏障功能进行检测。
如本文所用，所述“显著高于”是指，可指示所述经待测物处理的肾小球内皮细胞活性指标的参数是未经所述待测物处理的对照肾小球内皮细胞的相应参数的1.1倍以上。例如1.1-200倍。例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0倍；7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200倍。
如本文所用，所述“显著低于”是指，可指示所述经待测物处理的肾小球内皮细胞活性指标的参数是未经所述待测物处理的对照肾小球内皮细胞的相应参数的0.8倍以下。例如0.8-0.0倍。例如0.8、0.7、0.75、0.6、0.65、0.5、0.55、0.4、0.45、0.3、0.35、0.2、0.25、0.1、0.15、0.05或0.0倍。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。
除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。
发明的有益效果
本发明通过transwell培养装置建立了大鼠肾足细胞/人肾小球内皮细胞体外共培养模型，所述共培养模型可有效实施肾足细胞和肾小球内皮细胞之间的细胞通讯，可用于初步准确评价待测物的细胞毒性；此外，本发明的共培养模型还具备操作简便等优点。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了本申请肾足细胞/人肾小球内皮细胞共培养体系的示例性示意图。
图2显示了实施例1中单独培养组和共培养组中内皮细胞的CCK-8检测结果(P＜0.05，vs单独培养组)；其中，“Control”表示单细胞培养组，“Coculture”表示共培养组。
图3显示了实施例1中PI单染流式细胞术检测人肾小球内皮细胞周期的检测结果；其中，图3A显示了各组流式结果直方图，“Control”表示单细胞培养组，“Coculture”表示共培养组；图3B显示了处于各周期细胞的比例；“Control”表示单细胞培养组，“Coculture”表示共培养组；(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，vs对照组)。
图4显示了实施例1中单独培养组和共培养组内皮细胞的Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测结果；其中，图4A为流式散点图；图4B为各组的细胞凋亡率；“Control”表示单细胞培养组，“Coculture”表示共培养组；(P＜0.05)。
图5显示了实施例1中单独培养组和共培养组内皮细胞培养上清中Ang-l(图5B)、Ang-2(图5C)、Ang-l/Ang-2(图5A)的相对含量(相对于单独培养组)；“Control”表示单细胞培养组，“Coculture”表示共培养组。
图6显示了实施例1中单独培养组、共培养组中内皮细胞的SOD相对活性(相对于单独培养组)；“Control”表示单细胞培养组，“Coculture”表示共培养组；(P＜0.05)。
图7显示了实施例1中通过western-blotting检测单独培养组、共培养组中内皮细胞中凋亡相关因子Bax、Caspase-3的表达变化；其中，图7A为western-blotting的目标条带；图7B为Bax/GAPDH、Caspase-3/GAPDH的相对比值(相对于单独培养组)；“Control”表示单细胞培养组，“Coculture”表示共培养组；(P＜0.05)。
图8显示了实施例2中共培养对照组、TCS处理组及苯并(A)芘处理组共培养体系中内皮细胞的CCK-8检测结果(P＜0.05，vs共培养对照组)。
图9显示了实施例2中共培养对照组、TCS处理组及苯并(A)芘处理组共培养体系中内皮细胞的活死细胞染色结果；其中，图9A为各组显微镜照片，图9B为各组相对活细胞比例；共培养对照组：肾足细胞未经任何处理；TCS处理组：肾足细胞经80μM TCS刺激；苯并(A)芘处理组：肾足细胞经10μM苯并(A)芘刺激。Calcein-AM：活细胞标记染料，PI：死细胞标记染料。
图10显示了实施例2中共培养对照组、TCS处理组及苯并(A)芘处理组共培养体系中内皮细胞的SOD相对活性；共培养对照组：肾足细胞未经任何处理；TCS处理组：肾足细胞经80μM TCS刺激；苯并(A)芘处理组：肾足细胞经10μM苯并(A)芘刺激。
图11显示了实施例2中TCS处理组及苯并(A)芘处理组共培养体系中内皮细胞对Na-F和BSA的相对渗透系数(相对于对照组)。
图12显示了实施例2中共培养对照组、TCS处理组及苯并(A)芘处理组共培养体系中内皮细胞的Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测结果；其中，图12A为流式散点图；图12B为各组的相对细胞凋亡率(相对于共培养对照组)。
图13显示了不同肾足细胞接种密度对共培养体系中肾足细胞生长状态的影响。其中，图13A、13B和13C分别为接种密度为0.1×105个/ml、5×105个/ml、1.5×105个/ml的细胞形态(接种后48h)图。
图14显示了培养方式对共培养体系中内皮细胞形态的影响，其中，图14A为直接使用90％DMEM+10％FBS培养基于嵌套内接种人肾小球内皮细胞的细胞形态；图14B为使用不添加内皮细胞生长添加剂的ECM于嵌套内接种人肾小球内皮细胞的细胞形态。
图15显示了共聚焦显微镜20倍镜下，使用不同浓度的纤连蛋白包被嵌套后接种的内皮细胞的形态。其中，图15A、15B和15C分别对应15μg/μL、0μg/μL和30μg/μL纤连蛋白包被浓度。
图16显示了使用DMEM/F-12(1:1)培养基建立的共培养体系中，对照组和TCS处理组中内皮细胞的CCK-8检测结果(P＜0.05，vs共培养对照组)。
图17显示了使用DMEM/F-12(1:1)培养基建立的共培养体系中，对照组和TCS处理组中内皮细胞的SOD相对活性；对照组：肾足细胞未经任何处理；TCS处理组：肾足细胞经80μM TCS刺激。
图18显示了使用DMEM/F-12(1:1)培养基建立的共培养体系中，对照组和TCS处理组中内皮细胞对Na-F和BSA的相对渗透系数(相对于对照组)。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.共培养体系的建立
1材料和方法
1.1材料永生化大鼠肾足细胞系Rat podocyte(购于北京北纳创联生物技术研究院，货号：338697)，人肾小球内皮细胞系(Human Glomerular Endothelial Cells，HRGEC)(购于北京北纳创联生物技术研究院，货号：339278)，DMEM高糖培养基(Gibco公司，DMEM-H)，DMEM培养基(Gibco公司，DMEM)，ECM培养基(Sciencell公司)，青-链霉素双抗溶液(Sciencell公司)，胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶(北京索莱宝公司，Transwell嵌套(0.4μm孔径，康宁公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，Annexin VFITC/PI试剂盒(BD公司)，PI试剂盒(BD公司)，M-PER哺乳动物蛋白抽提试剂(Thermo Fisher Scientific公司)，Bcl-2相关蛋白(Bax)一抗(1:1000，Cell Signaling Technology公司)，Caspase-3一抗(1：1000，Cell Signaling Technology公司)，GAPDH一抗(1:5000，Proteintech公司)，二抗(1:5000，ZSGBBIO公司)，PBS缓冲溶液(Gibco公司)，流式细胞仪(BD公司)，酶标仪(美谷分子仪器公司)。
1.2大鼠肾足细胞的培养
将冻存的永生化大鼠肾足细胞复苏后，使用含有10％胎牛血清和1％青-链霉素双抗的DMEM培养基进行培养，将细胞置于37℃孵箱中，保持5％CO2浓度，每2d换液1次。当细胞的交汇程度达到约80％时，使用胰蛋白酶进行消化、传代处理。选取复苏后3-6代处于对数生长期的细胞进行单独培养或共培养。
1.3人肾小球内皮细胞培养
预处理细胞培养板：在Transwell嵌套内加入15μg/μL纤连蛋白，完全覆盖表面。室温空气干燥至少30分钟，吸去多余的纤连蛋白溶液。可4℃保存两周，PBS清洗后备用。将冻存的人肾小球内皮细胞复苏后，使用含有5％胎牛血清、1％内皮细胞生长添加剂和1％青-链霉素双抗的ECM培养基进行培养，将细胞置于37℃孵育箱中，保持5％CO2浓度，每2d换液1次。当细胞的交汇程度达到约80％时，使用胰蛋白酶进行消化、传代处理。选取复苏后3-6代处于对数生长期的细胞进行共培养。
1.4肾足细胞(外室)/人肾小球内皮细胞(嵌套内)共培养体系的建立
取复苏后3-6代生长状态良好的大鼠肾足细胞，使用0.25％的胰酶消化制成单细胞悬液，进行细胞计数，将细胞密度调整至1-2×105/mL后将2.5mL细胞悬液均匀接种于6孔板内底面(即外室)，90％DMEM+10％FBS培养基单独培养24h。
利用孔径0.4μm的Transwell嵌套建立非接触的细胞共培养系统。取复苏后3-6代生长状态良好的人肾小球内皮细胞，使用0.05％的胰酶消化制成单细胞悬液，进行细胞计数，将细胞密度调整至2-3×105/mL后将1.5mL细胞悬液均匀接种于按照上述步骤1.3中所述的经纤连蛋白包埋好的Transwell嵌套内底面，采用梯度培养基培养方式单独培养24h。梯度培养基为：首先在嵌套内加入2mL 100％ECM培养基(含1％内皮细胞生长添加剂)孵育4h；之后将培养基轻柔吸出1mL，加入1mL 90％DMEM-H+10％FBS培养基孵育4h；之后再次将培养基轻柔吸出1mL，再次加入1mL 90％DMEM-H+10％FBS培养基孵育12-16h；然后，用90％DMEM+10％FBS培养基轻柔冲洗嵌套去除内皮细胞生长添加剂，并加入1.5mL 90％DMEM+10％FBS培养基。共培养时，足细胞生长的6孔板更换新鲜90％DMEM+10％FBS培养基，将经过梯度培养液处理的嵌套放入6孔板中，置于37℃培养箱中，保持5％CO2浓度。
1.5实验分组
单独培养组：单独培养人肾小球内皮细胞；共培养组：大鼠肾足细胞+人肾小球内皮细胞。
1.6 CCK-8法检测人肾小球内皮细胞活性
分别于0h、24h、48h、72h从孵箱中拿出共培养板中移出小室，弃上清液，放置到新的24孔板中，每孔中加入0.5mL新鲜培养基和CCK-8试剂50μL，于37℃孵箱中孵育2h，使用酶标仪检测450nm处的吸光值。以24孔板小室内细胞作为1次生物学重复，本实验共进行了3次重复。
1.7 PI单染流式细胞术检测人肾小球内皮细胞周期
在细胞共培养48h后，取出共培养板，移出Transwell嵌套，使用0.05％的胰酶消化后，制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清后，PBS洗涤，离心(1000r/min，5min)，弃掉PBS后，加入1mL PBS和2mL无水乙醇固定，4℃过夜。取出固定好的细胞，参照试剂盒说明书配置反应溶液，加入细胞，避光10min后，流式细胞仪检测并分析人肾小球内皮细胞周期分布。
1.8 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测人肾小球内皮细胞凋亡率
在细胞培养48h后，使用0.05％的胰酶消化嵌套内细胞后，制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清后，PBS洗涤，离心(1000r/min，5min)，弃掉PBS后，加入PBS溶液重悬细胞，将5μL碘化丙啶(PI)和5μL Annex分别用V-FITC试剂(BD LSRII,FranklinLakes,NJ,USA)和100μL结合缓冲液在黑暗中染色15分钟，用流式细胞仪检测人肾小球内皮细胞凋亡率。
1.9炎症因子
检测细胞培养上清时，用无菌离心管收集。离心20min左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清。使用人血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)ELISA试剂盒检测Ang-1(北京，索莱宝)。使用人血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)ELISA试剂盒检测Ang-2(北京，索莱宝)。
检测细胞内的成份时，去细胞培养上清后，用PBS(PH7.2-7.4)悬浮细胞，使细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20min左右(2000-3000转/分)。仔细收集冻融上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。使用人血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)ELISA试剂盒检测Ang-1。使用人血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)ELISA试剂盒检测Ang-2。
1.10肾组织的氧化损伤指标
收集1×107细胞到离心管内，离心后弃上清，按照每500万细胞加入1mL提取液，超声波破碎(功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次)。8000g 4℃离心10分钟，取上清，冰上待测。使用超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒进行检测(北京，索莱宝)。
1.11 Western blotting检测人肾小球内皮细胞增殖、凋亡相关蛋白的表达变化情况
在细胞共培养48h后，移出小室，使用0.05％的胰酶消化后，收集细胞并裂解，提取细胞总蛋白并定量。按30-50μg的蛋白量加样，经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5％脱脂牛奶封闭，一抗(Bax为1：1000，Caspase-3为1：1000，GAPDH为1：5000)，4℃孵育过夜后、洗膜，二抗(1：5000)孵育2h，凝胶成像仪观察拍照，利用Image J软件进行定量分析。
1.12统计学方法
采用统计软件SPSS22.0进行分析。实验数据均为计量资料，以±s表示，两样本间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 CCK-8法检测人肾小球内皮细胞活性
在共培养0h、24h、48h、72h的4个时间点，对两组人肾小球内皮细胞样本进行CCK-8检测，检测结果如图2所示。从图2的生长曲线可以看出，单独培养组和共培养组人肾小球内皮细胞的细胞活性均随着时间延长而增加，但共培养组人肾小球内皮细胞的细胞活性增加更明显，并且在共培养48h和72h两个时间点两组差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 PI单染流式细胞术检测人肾小球内皮细胞周期
PI单染流式细胞术的检测结果如图3所示，图3表明，与大鼠肾足细胞共培养之后，人肾小球内皮细胞周期中3个时期的比例出现显著变化。与单独培养组相比，共培养组人肾小球内皮细胞的G1期细胞比例显著下降(P＜0.01)，S期的细胞比例显著增高(P＜0.01)，G2/M期的细胞比例虽然稍微下降(P＜0.05)，但增值率(S(合成期)+G2/M(合成后期/分裂期))显著升高，结果提示共培养条件下大鼠肾足细胞能够显著促进人肾小球内皮细胞的增殖功能。
2.3 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测人肾小球内皮细胞的凋亡
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测结果如图4所示，结果表明，与大鼠肾足细胞共培养之后，人肾小球内皮细胞的凋亡率显著下降(P＜0.05)，表明共培养条件下大鼠肾足细胞能够抑制人肾小球内皮细胞的凋亡。
2.4炎症因子
与单独培养组相比，共培养条件下人肾小球内皮细胞上清中Ang-l增加，Ang-2减小，Ang-l/Ang-2比值增加(见图5)，表明共培养条件下人肾小球内皮细胞生长情况良好，大鼠足细胞促进人肾小球内皮细胞分泌Ang-l，抑制其分泌Ang-2。
2.5肾组织的氧化损伤指标
SOD广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用，是常见的肾组织的氧化损伤指标。SOD检测结果(图6)表明，与大鼠肾足细胞共培养后，人肾小球内皮细胞的SOD活性值升高(P＜0.05)，抗氧化能力增强。
2.6 Western blotting检测人肾小球内皮细胞增殖、凋亡相关蛋白的表达变化情况
采用Western blotting检测凋亡相关因子Bax、Cleaved Caspase-3的表达变化，结果(图7)显示，与单独培养组相比，共培养组人肾小球内皮细胞Bax、Cleaved Caspase-3的水平显著降低(P＜0.05)。上述结果提示，在共培养条件下，大鼠肾足细胞能够抑制人肾小球内皮细胞的凋亡。
此外，发明人发现，将永生化大鼠肾足细胞更换为人原代肾足细胞，其余步骤及条件参照上述实施例1中肾足细胞/人肾小球内皮细胞共培养体系的建立。
结果显示，传代2-3后肾足细胞增殖能力明显减弱，不能满足实验需要。
另外发明人还发现，通过保持人肾小球内皮细胞接种于Transwell嵌套内，接种密度为2×105个/mL。调整肾足细胞接种密度，其余步骤及条件参照上述实施例1中肾足细胞/人肾小球内皮细胞共培养体系的建立。各接种密度下的细胞状态如图13所示，图13显示，当肾足细胞接种密度为0.1×105个/mL时，接种48h后，细胞密度太小，影响细胞状态(图13A)。而当肾足细胞接种密度在5×105个/mL时，接种48h后，细胞密度太大，状态不好容易成片飘起(图13B)；相对而言，当人肾小球内皮细胞接种于Transwell嵌套内，接种密度为2.5×105个/mL时，肾足细胞接种于Transwell外室，接种密度为1-2×105个/mL时，肾足细胞生长状态更好(图13C)。
另外，其余步骤及条件参照上述实施例1中肾足细胞/人肾小球内皮细胞共培养体系的建立，共培养时，直接用90％DMEM+10％FBS培养基接种人肾小球内皮细胞于包埋好的Transwell嵌套内底面，培养24h，细胞接种率明显下降(见图14A)，说明共培养时人肾小球内皮细胞不适应由100％ECM培养基直接更换为90％DMEM+10％FBS培养基。而人肾小球内皮细胞在嵌套内培养时，若ECM培养基里不添加内皮细胞生长添加剂，则人肾小球内皮细胞形态圆缩，增殖活性差(见图14B)。
为了增加内皮细胞接种时的黏附率，发明人使用15μg/μL纤连蛋白预处理包被嵌套，完全覆盖表面。室温空气干燥至少30min，吸去多余的纤连蛋白溶液。相比15μg/μL纤连蛋白预处理包被嵌套，0μg/μL纤连蛋白预包被时，内皮细胞增殖活性、黏附能力降低；30μg/μL纤连蛋白预包被时，细胞增殖活性、黏附能力与15μg/μL纤连蛋白预处理包被组无显著性差异(P＞0.05)(见图15)。
实施例2.共培养体系在检测细胞毒害污染物中的应用
1 材料和方法
1.1 材料
永生化大鼠肾足细胞系Rat podocyte(购于北京北纳创联生物技术研究院，货号：338697)，人肾小球内皮细胞系(Human Glomerular Endothelial Cells，HRGEC)(购于北京北纳创联生物技术研究院，货号：339278)，DMEM高糖培养基(购于Gibco公司，DMEM-H)，DMEM培养基(Gibco公司，DMEM)，DMEM/F-12(1:1)培养基(购于Gibco公司)，ECM培养基(购于Sciencell公司)含1％青-链霉素双抗溶液、1％内皮细胞生长添加剂和5％胎牛血清，胰蛋白酶(购于北京索莱宝公司)，Transwell嵌套(0.4μm孔径，购于康宁公司)，CCK-8试剂盒(购于日本同仁化学研究所)，Annexin VFITC/PI试剂盒(购于BD公司)，PI试剂盒(购于BD公司)，M-PER哺乳动物蛋白抽提试剂(购于Thermo Fisher Scientific公司)，活细胞/死细胞染色试剂盒(购于江苏凯基生物技术股份有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(购于北京索莱宝公司)，荧光示踪白蛋白：FITC-labeled BSA(购于索莱宝公司，分子量67000Da)，荧光素钠Sodium Fluorescein：Na-F(购于Sigma公司，美国)(分子量376Da)，PBS缓冲溶液(购于Gibco公司)，流式细胞仪(购于BD公司)，酶标仪(购于美谷分子仪器公司)。
1.2大鼠肾足细胞的培养
将冻存的肾足细胞复苏后，使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养，将细胞置于37℃孵箱中，保持5％CO2浓度，每2d换液1次。当细胞的交汇程度达到约80％时，使用胰蛋白酶进行消化、传代处理。选取复苏后3-6代处于对数生长期的细胞进行单独培养或共培养。
1.3人肾小球内皮细胞培养
预处理细胞培养板：在Transwell嵌套内加入15μg/μL纤连蛋白，完全覆盖表面。室温空气干燥至少30分钟，吸去多余的纤连蛋白溶液。可4℃保存两周，PBS清洗后备用。将冻存的人肾小球内皮细胞复苏后，使用含有5％胎牛血清、1％内皮细胞生长添加剂和1％青-链霉素双抗的ECM培养基进行培养，将细胞置于37℃孵育箱中，保持5％CO2浓度，每2d换液1次。当细胞的交汇程度达到约80％时，使用胰蛋白酶进行消化、传代处理。选取复苏后3-6代处于对数生长期的细胞进行共培养。
1.4肾足细胞(外室)/人肾小球内皮细胞(嵌套内)共培养体系的建立
取复苏后3-6代生长状态良好的大鼠肾足细胞，使用0.25％的胰酶消化制成单细胞悬液，进行细胞计数，将细胞密度调整至1-2×105/mL后将2.5mL细胞悬液均匀接种于6孔板内底面(即外室)，90％DMEM+10％FBS培养基单独培养24h。
利用孔径0.4μm的Transwell嵌套建立非接触的细胞共培养系统。取复苏后3-6代生长状态良好的人肾小球内皮细胞，使用0.05％的胰酶消化制成单细胞悬液，进行细胞计数，将细胞密度调整至2-3×105/mL后将1.5mL细胞悬液均匀接种于按照上述步骤1.3中所述的经纤连蛋白包埋好的Transwell嵌套内底面，采用梯度培养基培养方式单独培养24h。梯度培养基为：首先在嵌套内加入2mL 100％ECM培养基(含1％内皮细胞生长添加剂)孵育4h；之后将培养基轻柔吸出1mL，加入1mL 90％DMEM-H+10％FBS培养基孵育4h；之后再次将培养基轻柔吸出1mL，再次加入1mL 90％DMEM-H+10％FBS培养基孵育12-16h；然后，用90％DMEM+10％FBS培养基轻柔冲洗嵌套去除内皮细胞生长添加剂，并加入1.5mL 90％DMEM+10％FBS培养基。共培养时，足细胞生长的6孔板更换新鲜90％DMEM+10％FBS培养基，将经过梯度培养液处理的嵌套放入6孔板中，置于37℃培养箱中，保持5％CO2浓度。
1.5实验分组
共培养对照组：大鼠肾足细胞未经任何处理；TCS(三氯生)处理组：给予Transwell双层培养室下层的大鼠肾足细胞1.2mL 80μM三氯生刺激(Transwell嵌套内培养的内皮细胞不与三氯生直接接触)，1小时后更换新鲜的90％DMEM+10％FBS培养基，24h后观察上层嵌套人肾小球内皮细胞活力、渗透性能、凋亡等指标，每组作3个重复。苯并(A)芘处理组：给予Transwell双层培养室下层的大鼠肾足细胞1.2mL 10μM苯并(A)芘刺激(Transwell嵌套内培养的内皮细胞不与三氯生直接接触)，1小时后更换新鲜的90％DMEM+10％FBS培养基，24h后观察上层嵌套人肾小球内皮细胞活力、渗透性、凋亡等指标，每组作3个重复。
1.6 CCK-8法检测共培养体系中人肾小球内皮细胞活性
分别于0h、24h、48h、72h从孵育箱中拿出共培养板，并移出Transwell嵌套，弃上清液，放置到新的外室空置的6孔板中，每室加入0.5mL新鲜培养基和CCK-8试剂50μL，于37℃孵箱中孵育1h，然后将反应后的溶液转移至96孔板中，使用酶标仪检测450nm处的吸光值。以嵌套内细胞作为1次生物学重复，本实验共进行了3次重复。
1.7活死细胞检测
在细胞给药24h后，使用活细胞/死细胞染色试剂盒进行Calcein-AM/PI双染细胞的方法染色活细胞和死细胞，按照说明书进行操作。
1.8肾组织的氧化损伤指标
收集1×107细胞到离心管内，离心后弃上清，按照每500万细胞加入1mL提取液，超声波破碎(功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次)。8000g 4℃离心10分钟，取上清，冰上待测。使用超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒进行检测。
1.9过滤屏障检测
外室大鼠肾足细胞给药后，共培养体系继续培养24h，使用荧光示踪白蛋白FITC-labeled BSA和荧光素钠Na-F两个渗透率标记指示剂测试人肾小球内皮细胞过滤膜的渗透率。弃去嵌套内和外室培养基，用PBS轻柔冲洗，加入0.5mL PBS配制的混合荧光通透性指示剂，其中荧光示踪白蛋白BSA2μg/mL，荧光素钠Na-F 75μg/mL，37℃、5％二氧化碳孵育20min。收集嵌套内和外室培养液各100μL于96孔板内。BSA荧光测定信号为485nm(激发光)和538nm(发射光)；Na-F为440nm(激发光)和525nm(发射光)。制作BSA标准曲线0、0.01、0.05、0.1、0.8、2μg/mL，计算出嵌套内和外室的FITC-labeled BSA浓度。制作Na-F标准曲线0、5、10、25、50、75μg/mL，计算出嵌套内和外室的Na-F浓度。以未经处理组，预包被嵌套组作对照组。人肾小球内皮细胞过滤膜对白蛋白/荧光素钠的通透性计算公式：渗透系数＝(外室指示剂浓度/嵌套内指示剂浓度)×100％。
1.10 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测人肾小球内皮细胞凋亡率
在细胞处理24h后，使用0.05％的胰酶消化嵌套内细胞后，制成单细胞悬液，离心(1000r/min,5min)，弃上清后，PBS洗涤，离心(1000r/min,5min)，弃掉PBS后，加入PBS溶液重悬细胞，将5μL碘化丙啶(PI)和5μL Annex分别用V-FITC试剂(BD LSRII,FranklinLakes,NJ,USA)和100μL结合缓冲液在黑暗中染色15分钟，用流式细胞仪检测人肾小球内皮细胞凋亡率。
1.11统计学方法
采用统计软件SPSS22.0进行分析。实验数据均为计量资料，两样本间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 CCK-8法检测共培养体系中人肾小球内皮细胞活性
在共培养0h、24h、48h、72h的4个时间点，使用CCK-8法，对共培养对照组、TCS处理组和苯并(A)芘处理组中的人肾小球内皮细胞进行CCK-8检测，结果如图8所示。从图8的生长曲线可以看出，对照组、TCS处理组和苯并(A)芘处理组的细胞活性均随着时间延长而增加，但对照组人肾小球内皮细胞的细胞活性增加更明显，并且在共培养48h和72h两个时间点两组差异有统计学意义(P＜0.05)。证明在本申请的共培养体系中，三氯生或苯并(A)芘诱导的肾足细胞损伤可以降低人肾小球内皮细胞活力，从而，可通过检测本申请共培养体系中肾小球内皮细胞的活力来检测三氯生(TCS)或苯并(A)芘的存在。
2.2共培养体系中人肾小球内皮细胞的活死细胞染色
共培养体系培养24h后用活/死细胞双染试剂盒对人肾小球内皮细胞进行荧光染色，观察其存活情况，结果如图9所示。图9显示，与对照组相比较，TCS处理组和苯并(A)芘处理组中活细胞Calcein-AM染色荧光绿强度降低，显示活细胞数量变少；PI染色红色荧光强度增加，显示死细胞数量变多。表明可通过检测本申请的共培养体系中肾小球内皮细胞的活细胞或死细胞比率来检测三氯生(TCS)或苯并(A)芘的存在。
2.3肾组织的氧化损伤指标
超氧化物歧化酶(SOD)是常见的肾组织的氧化损伤指标。SOD检测结果如图10所示，图10显示，与对照组相比较，TCS处理组和苯并(A)芘处理组中人肾小球内皮细胞的SOD活性值降低(P＜0.05)，抗氧化能力减弱。表明可通过检测本申请的共培养体系中肾小球内皮细胞的SOD的活性来检测三氯生(TCS)或苯并(A)芘的存在。
2.4污染物诱导肾小球内皮细胞产生屏障功能障碍
给药24h后，采用两种通透性标志物Na-F和BSA评价共培养体系中人肾小球内皮细胞的渗透性，结果如图11所示。图11的结果显示，相比对照组，TCS显著提高了人肾小球内皮细胞对Na-F和BSA的相对渗透系数，分别为115.3±2.8％和119.3±2.4％；苯并(A)芘处理组显著提高了人肾小球内皮细胞对Na-F和BSA的相对渗透系数，分别为109.2±2.1％和108.5±1.9％。表明可通过检测本申请的共培养体系中肾小球内皮细胞的屏障功能来检测三氯生(TCS)或苯并(A)芘的存在。
2.5 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测，共培养体系中人肾小球内皮细胞的凋亡情况
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测结果如图12所示，图12显示，与肾足细胞共培养对照组总凋亡率5.81％±5.2相比，TCS处理组和苯并(A)芘处理组人肾小球内皮细胞的凋亡率显著上升(P＜0.05)，其中，TCS处理组细胞总凋亡率20.47％±5.32，苯并(A)芘处理组总凋亡率23.26％±4.82。
此外，发明人将DMEM培养基替换为DMEM/F-12(1:1)培养基后，发现DMEM/F-12(1:1)培养基与DMEM培养基在共培养过程中具有一致作用，所建立的共培养体系仍可很好的应用于待测物(例如TCS)的检测。
具体方法为(未提及的步骤参见本实施例的“材料和方法”部分)：
取复苏后3-6代生长状态良好的大鼠肾足细胞，使用0.25％的胰酶消化制成单细胞悬液，进行细胞计数，将细胞密度调整至1-2×105/mL后将2.5mL细胞悬液均匀接种于6孔板内底面(即外室)，90％DMEM+10％FBS培养基单独培养24h。
利用孔径0.4μm的Transwell嵌套建立非接触的细胞共培养系统。取复苏后3-6代生长状态良好的人肾小球内皮细胞，使用0.05％的胰酶消化制成单细胞悬液，进行细胞计数，将细胞密度调整至2-3×105/mL后将1.5mL细胞悬液均匀接种于按照上述步骤1.3中所述的经纤连蛋白包埋好的Transwell嵌套内底面，采用梯度培养基培养方式单独培养24h。梯度培养基为：首先在嵌套内加入2mL 100％ECM培养基(含1％内皮细胞生长添加剂)孵育4h；之后将培养基轻柔吸出1mL，加入1mL 90％DMEM-H+10％FBS培养基孵育4h；之后再次将培养基轻柔吸出1mL，再次加入1mL 90％DMEM-H+10％FBS培养基孵育12-16h；然后，用90％DMEM/F-12(1:1)+10％FBS培养基轻柔冲洗嵌套去除内皮细胞生长添加剂，并加入1.5mL90％DMEM/F-12(1:1)+10％FBS培养基。共培养时，足细胞生长的6孔板更换新鲜90％DMEM/F-12(1:1)+10％FBS培养基，将经过梯度培养液处理的嵌套放入6孔板中，置于37℃培养箱中，保持5％CO2浓度。
对照组：大鼠肾足细胞未经任何处理；TCS(三氯生)处理组：给予Transwell双层培养室下层的大鼠肾足细胞1mL 80μM三氯生(使用90％DMEM/F-12(1:1)+10％FBS培养基配制)刺激(Transwell嵌套内培养的内皮细胞不与三氯生直接接触)，1小时后更换新鲜的90％DMEM/F-12(1:1)+10％FBS培养基，24h后观察上层嵌套人肾小球内皮细胞活力、渗透性能、凋亡等指标，每组作3个重复。
检测对照组及TCS处理组肾小球内皮细胞的活性、氧化损伤指标及过滤屏障。检测方法参见本实施例的“材料和方法”部分。
检测结果如图16-18所示，结果表明，三氯生诱导的肾足细胞损伤可以降低人肾小球内皮细胞活力；使人肾小球内皮细胞的SOD活性值降低(P＜0.05)，抗氧化能力减弱；显著提高人肾小球内皮细胞对Na-F和BSA的相对渗透系数。表明将共培养体系中的DMEM培养基替换为DMEM/F-12(1:1)培养基后，所述共培养体系仍可很好的用于检测三氯生(TCS)的存在。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (16)

1.一种体外共培养模型，其包含细胞共培养装置，所述细胞共培养装置包括至少一个嵌入式共培养单元，所述嵌入式共培养单元包括嵌入放置在第一容器中的第二容器，所述第二容器通过通透性膜与所述第一容器实现流体相通；所述第一容器培养有第一细胞，所述第二容器培养有第二细胞；
其中，所述第一细胞为肾足细胞，所述第二细胞为肾小球内皮细胞；或者，所述第一细胞为肾小球内皮细胞，所述第二细胞为肾足细胞；
优选地，所述第一细胞不与所述第二容器以及所述第二细胞直接接触。
2.权利要求1的体外共培养模型，其中，所述肾足细胞和所述肾小球内皮细胞为细胞系。
3.权利要求1或2的体外共培养模型，其中，所述第二容器为Transwell嵌套；
优选地，所述通透性膜为多孔滤膜，其滤孔的等效孔径小于3μm；
优选地，所述第一容器为细胞培养板(例如，细胞培养孔板)。
4.权利要求1-3任一项的体外共培养模型，其具备以下特征的一项或多项：
(1)所述通透性膜位于所述第二容器的底部；
(2)所述第二细胞贴壁培养于所述第二容器的底部；
(3)所述第一细胞贴壁培养于所述第一容器的底部；
(4)所述用于培养所述肾小球内皮细胞的容器的底部包被有纤连蛋白。
5.权利要求1-4任一项的体外共培养模型，其中，所述第一容器含有第一培养基，所述第二容器含有第二培养基；
优选地，所述第一培养基和所述第二培养基相同或不相同；
优选地，所述第一培养基和所述第二培养基不含内皮细胞生长添加剂；
优选地，所述第一培养基和/或所述第二培养基为包含血清的基础培养基；优选地，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12。
6.构建权利要求1-5任一项的体外共培养模型的方法，其包括在所述第一容器中接种所述第一细胞，在所述第二容器中接种所述第二细胞的步骤。
7.权利要求6的方法，其中，所述第一细胞为肾足细胞，所述第二细胞为肾小球内皮细胞；
优选地，所述肾足细胞和所述肾小球内皮细胞为细胞系。
8.权利要求7的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)(a)使用含内皮细胞生长添加剂的培养基在所述第二容器中接种所述肾小球内皮细胞；
(b)梯度降低所述第二容器的培养体系中内皮细胞生长添加剂的浓度，直至所述培养体系中不含内皮细胞生长添加剂；
(2)使用不含内皮细胞生长添加剂的培养基在所述第一容器中接种所述肾足细胞；
其中，步骤(1)和步骤(2)以任意顺序进行；
优选地，所述含内皮细胞生长添加剂的培养基是ECM培养基；
优选地，在步骤(1)中所述第二容器未嵌入第一容器中；优选地，所述方法还包括(3)：将步骤(1)获得的第二容器嵌入放置于步骤(2)获得的第一容器中；
优选地，在步骤(3)中所述第一容器的培养基和所述第二容器的培养基相同。
9.权利要求8的方法，其中，步骤(1)(b)包括：使用不含内皮细胞生长添加剂的培养基置换所述第二容器中的培养基；
优选地，步骤(1)最终获得的培养体系包含与步骤(2)相同的不含内皮细胞生长添加剂的培养基；优选地，所述不含内皮细胞生长添加剂的培养基为包含血清的基础培养基；优选地，所述基础培养基选自DMEM，DMEM-H，DMEM/F12。
10.权利要求7-9任一项的方法，其中，所述方法还包括在所述第二容器的底部包被纤连蛋白的步骤。
11.权利要求1-5任一项的体外共培养模型用于检测待测物细胞毒性的用途。
12.一种检测待测物的细胞毒性的方法，其包括使用权利要求1-5任一项的体外共培养模型。
13.权利要求12的方法，其中所述第一细胞为肾足细胞，所述第二细胞为肾小球内皮细胞；
优选地，所述肾足细胞和所述肾小球内皮细胞为细胞系。
14.权利要求13的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1-5任一项所述的共培养模型中的肾足细胞与所述待测物接触并培养；
(2)去除所述待测物；
(3)将所述肾足细胞与所述肾小球内皮细胞在所述共培养模型中进行共培养；
(4)检测所述肾小球内皮细胞的活性指标，从而判断所述待测物的细胞毒性。
15.权利要求12-14任一项的方法，其中，所述待测物为可能会造成肾脏损伤的物质。
16.权利要求14-15任一项的方法，其中，所述肾小球内皮细胞的活性指标选自：活细胞比例，死细胞比例，细胞周期分布，Ang-l、Ang-2表达量或其比例(例如，Ang-1/Ang-2)，超氧化物歧化酶(SOD)活性，凋亡相关因子(例如Bax、Caspase-3)表达量，细胞形态，肾小球内皮细胞过滤屏障功能，及其组合。
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