CN114934021B - 一种Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了人Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系，其保藏号为CGMCC NO.45145，本发明从Angptl3敲除的小鼠中提取原代足细胞，慢病毒转染制备永生化的Angptl3敲除的鼠足细胞系，使用Nephrin和WT‑1抗体进行了足细胞的验证，永生化的足细胞可以稳定传30代以上，为研究在肾病综合征中Angptl3基因表达缺失对足细胞保护提供了理想和稳定的细胞系。该细胞系以进行永生化处理，能大量培养传代，培养要求相对较为简单，能够短时间内获得大量的实验用细胞，总体实验周期较短，适合推广。

Description

一种Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系及其应用
技术领域
本发明属于生物和医疗技术领域，具体涉及一种Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系及其应用。
背景技术
肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是一组具有类似临床表现，不同病因及病理病变的肾小球疾病构成的临床综合征。可由多种病因引起，分为原发性、继发性和遗传性三大类。许多疾病可引起肾小球毛细血管滤过膜的损伤，导致肾病综合征。肾病综合征发展到后期往往演变为尿毒症，使肾病综合征的危害威胁生命。
Angptl3是一种分泌性糖蛋白，正常情况下主要在肝脏表达，发生肾病综合征时在足细胞中表达增高。研究表明Angptl3是导致肾病综合征的一个很重要的靶点，敲除Angptl3或降低Angptl3的表达可以在很大程度上保护足细胞，减少蛋白尿。
既往对Angptl3的体外研究需要向足细胞中转染质粒来降低其表达，或者从Angptl3敲除的小鼠中直接提取原代足细胞进行培养。但是上述两种方法均有弊端，质粒转染率低，降低Angptl3的表达程度有限；从Angptl3基因敲除的小鼠中直接提取原代足细胞培养周期长，失败率高，并且原代足细胞生长周期有限，需要反复提取。
以上缺点严重影响了对Angptl3的体外研究，需要一种新的Angptl3的体外研究的细胞。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系，其保藏号为：CGMCC NO.45145。
本发明的第二方面，提供前述Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系的子代细胞系。
前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系，能够表达Nephrin蛋白和WT-1蛋白。能够稳定增殖和传代。
本发明第三方面，提供前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系的用途，为制备肾病综合征细胞模型或制备肾病综合征动物模型。
本发明第四方面，提供前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系的用途，为制备肾病综合征诊断产品。
本发明第五方面，提供前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系的用途，为开发肾病综合征相关的生物工程产品。
本发明第六方面，提供前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系的用途，为开发Angptl3缺失相关疾病的生物工程产品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从Angptl3敲除的小鼠中提取原代足细胞，慢病毒转染制备永生化的Angptl3敲除的鼠足细胞系，使用Nephrin和WT-1抗体进行了足细胞的验证，永生化的足细胞可以稳定传30代以上，为研究在肾病综合征中Angptl3基因表达缺失对足细胞保护提供了理想和稳定的细胞系。该细胞系以进行永生化处理，能大量培养传代，培养要求相对较为简单，能够短时间内获得大量的实验用细胞，总体实验周期较短，适合推广。
本发明细胞株保藏信息如下：
细胞株名称：Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系
保藏号为：CGMCC NO.45145
保藏日期：2022.3.31
保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1小鼠肾脏足细胞。(左图100x；右图200x)
图2永生化小鼠肾脏足细胞。(100x)
图3Nephrin抗体免疫荧光染色(由上至下依次为Nephrin、DAPI和Merge)。(100x)
图4WT-1抗体免疫荧光染色(由上至下依次为WT-1、DAPI和Merge)。(100x)
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
本发明的细胞系用于非诊断或治疗目的。可以用于基础研究。
本发明的一实施例提供Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系，其保藏号为：CGMCCNO.45145。
细胞永生化是指体外培养的细胞经过外界影响而具有无限增殖的能力的状态。
所述鼠永生化足细胞系能够传代30代以上。
鼠的Angptl3的Genbank号为NC_000070。
本发明的一实施例提供前述Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系的子代细胞系。
前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系，能够表达Nephrin蛋白和WT-1蛋白。能够稳定增殖和传代。
鼠的Nephrin蛋白的Genbank号为NC_000073。
鼠的WT-1蛋白的Genbank号为NC000068。
前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系，不表达Angptl3基因。
本发明的一实施例提供前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系的用途，为制备肾病综合征细胞模型或制备肾病综合征动物模型。
本发明的一实施例提供前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系的用途，为制备肾病综合征诊断产品。
本发明的一实施例提供前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系的用途，为开发肾病综合征相关的生物工程产品。
本发明的一实施例提供前述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或子代细胞系的用途，为开发Angptl3缺失相关疾病的生物工程产品。
肾病综合征主要表现为大量尿蛋白、高度水肿、高血脂症和低蛋白血症，以及其他代谢紊乱和伴随症状等。
肾病综合征包括原发性、继发性和遗传性三大类。
原发性肾病综合征，包括原发性肾小球肾病急、慢性肾小球肾炎和急进性肾炎等。
继发性肾病综合征的原因为：感染、药物、毒素及过敏、肿瘤、系统性红斑狼疮、过敏性紫癜淀粉样变及糖尿病等。
实施例1
1、小鼠肾脏足细胞分离及培养
1.1实验材料
高糖DMEM、DMEM/F12培养基、FBS(Gibco)；ITS-X、鼠尾胶原(Sigma公司)；青霉素-链霉素(上海碧云天)；CO2培养箱(上海博讯)。
1.2实验步骤
1)制备KI-3T3培养基：KI培养基成分有DMEM/F12培养基，含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)10mmol/L，ITS-X(含转铁蛋白0.55g/L，亚硒酸钠67mg/L，胰岛素1g/L)青霉素105U/L链霉素100g/L，3T3培养基成分有DMEM培养基(高糖型)，含200g/L胎牛血清，HEPES10mmol/L，谷氨酸钠2mmol/L，丙酮酸钠2mmol/L，青霉素105U/L，链霉素100mg/L。KI培养基和3T3培养基1∶1体积比混合，即为KI-3T3培养基。
2)差异过滤法分离肾小球：本课题组2001年从美国突变小鼠区域资源中心(MMRRC)引进了Angpt13基因敲除小鼠。取8周左右的Angptl3敲除小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下，取出双肾，置于预冷的细胞培养基。去除肾包膜，剪碎肾皮质。在200\150\80um筛网上，10ml注射器针芯轻轻碾压肾皮质，不时用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗，收集筛悬液，在300目筛网上一次性过滤细胞悬液，收集300目筛网上的肾小球，在倒置显微镜下观察肾小球形态。
3)种植肾小球：KI-3T3培养基重悬肾小球，以适当密度种植在铺有鼠尾胶原10cm2塑料培养皿中，37℃，CO2恒温培养箱孵育。
1.3实验结果
Angptl3敲除的小鼠肾脏足细胞如图1所示。图1是放大100倍的从肾小球中爬出来的原代Angptl3敲除的足细胞，结果表明，细胞形态清晰、完整。
2、小鼠肾脏足细胞永生化
2.1实验材料
Puromycin、Polybrene(Sigma公司)；0.25％胰酶(上海碧云天)；CO2培养箱(上海博讯)。
2.2实验步骤
1、当图1所示的原代小鼠肾脏足细胞体外培养10天后，用PBS清洗细胞3次(pH值为7.3±0.1)，用0.25％胰酶培养箱中消化3分钟，用KI-3T3完全培养基终止消化，然后把细胞悬液通过40uM细胞筛过滤，细胞悬液经1200rpm离心5min，最后用KI-3T3完全培养基重悬细胞沉淀并将其铺于鼠尾胶原包被的6cm培养皿中；
2、当上述细胞生长至50％融合时，用慢病毒pGMLV-SV40T-PURO和pLV[Exp]-Puro-EF1A＞hTERT MOI＝80(含5ug/mL Polybrene增强慢病毒感染效率)37℃、5％CO2培养箱中感染上述细胞过夜；载体信息如下表所示：
载体基本信息
载体ID VB200000-1037dhh
载体名称 pLV[E×p]-Puro-EF1A＞hTERT[NM_198253.2]
载体大小 11894bp
病毒基因组大小 8419bp
载体类型 哺乳动物基因表达慢病毒载体
启动子 EF1A
ORF hTERT[NM_198253.2]
筛选标记 Puro
质粒拷贝数 High
载体抗性 Ampicillin
克隆宿主 Stbl3(或其他适用菌株)
3、慢病毒感染细胞第二天后换液，然后再持续培养4天，每2天继续换液；
4、将细胞完全培养中分别添加1ug/mL Puromycin，持续培养96h；
5、当细胞生长融合时，后续对细胞进行常规传代培养，
获得永生化后的第一代细胞，进行保藏，纯化，去除杂细胞。对永生化后的细胞进行保藏(CGMCC NO.45145)。
2.3实验结果
Angptl3敲除的永生化小鼠肾脏足细胞可多次传代，且细胞状态佳。如图2所示，为第五代永生化细胞。
3免疫荧光染色鉴定
3.1实验结果
(1)待永生化小鼠肾脏足细胞生长至80％融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4％多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
(2)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
(3)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4％BSA封闭细胞30min；
(4)按1：100的比例稀释Nephrin抗体(北京博奥森Nephrin bs-4866R)和WT-1抗体(北京博奥森bs-6983R)，然后将其放在4℃冰箱中孵育过夜；
(5)PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀释抗FITC二抗，37℃条件下放置2h；
(6)用PBS冲洗3次，每次10min，倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
Nephrin抗体免疫荧光染色结果如图3，Nephrin为足细胞的关键蛋白，免疫荧光染色结果提示Nephrin表达。
WT-1抗体免疫荧光染色如图4所示，WT-1为足细胞标志蛋白，免疫荧光染色结果提示WT-1表达。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系，其保藏号为：CGMCC NO. 45145。
2.如权利要求1所述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系的子代细胞系。
3.如权利要求1所述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或如权利要求2所述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系的子代细胞系，不表达Angptl3基因。
4.如权利要求1所述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或权利要求2所述的子代细胞系的用途，为制备肾病综合征细胞模型或制备肾病综合征动物模型。
5.如权利要求1所述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或权利要求2所述的子代细胞系的用途，为筛选和/或评价肾病综合征治疗药物。
6.如权利要求1所述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或权利要求2所述的子代细胞系的用途，为开发肾病综合征相关的生物工程产品。
7.如权利要求1所述的Angptl3敲除的鼠永生化足细胞系或权利要求2所述的子代细胞系的用途，为开发Angptl3缺失相关疾病的生物工程产品。
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Angptl3基因敲除小鼠肾脏形态功能分析;刘俊朝等;中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编;257-258 *

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