CN117050929A - 一种奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法。本发明提供的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，包括以下步骤：取奶牛瘤胃组织，将瘤胃内容物用生理盐水冲洗干净后，将瘤胃组织钝性分离，取上皮组织备用；将瘤胃上皮组织用含抗生素的PBS缓冲液Ⅰ和II进行清洗，然后将上皮组织剪成0.25cm2的小块；使用胰蛋白酶‑EDTA消化液将瘤胃上皮组织小块在3‑5℃下冷消化18‑24h；将细胞消化液过滤、离心并洗涤，弃上清之后，细胞沉淀为瘤胃上皮细胞沉淀；将瘤胃上皮细胞沉淀用完全培养基重悬纯化后，然后于37℃和5％CO2的细胞培养箱中静置培养。该方法操作简便、省力、经济，且对实验要求不高，可获得纯度高、活性强、可冻存的瘤胃上皮细胞。
Description
技术领域
本发明属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着社会经济的发展，人们消费水平日益提高，对牛奶制品的需求日益旺盛。瘤胃作为奶牛体内最大的消化器官，在动物饲料消化代谢、营养吸收、养分沉积、免疫屏障等生理功能上发挥着重要作用。然而，在饲养过程中，因饲料配比、饲养方式的改变等因素，会影响奶牛瘤胃内容物的消化、瘤胃组织形态及瘤胃的健康发育，进而影响生产性能的发挥。瘤胃上皮养分吸收与运输、挥发性脂肪酸代谢、对瘤胃壁的保护发挥着有着重要的生理作用，而目前，国内外各大细胞库还没有瘤胃上皮细胞系，瘤胃上皮细胞的原代培养是获取瘤胃上皮细胞唯一的方法。
中国专利CN202110411660.9和CN201711144970.9涉及到的原代奶牛瘤胃上皮细胞的分离培养方法采用的是多次消化法进行，虽然胰蛋白酶在37℃的酶活性最好，但处理的时间超过30min对细胞有毒性作用，对细胞的数量和纯度有一定的影响，并且成本较大，过程比较复杂、繁琐，需要大量的人力和物力。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法。该方法操作简便、省力、经济，且对实验要求不高，可获得纯度高、活性强、可冻存的瘤胃上皮细胞。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
(1)取奶牛瘤胃组织，将瘤胃内容物用生理盐水冲洗干净后，将瘤胃组织钝性分离，取上皮组织备用；
(2)将瘤胃上皮组织用含抗生素的PBS缓冲液Ⅰ和II进行清洗，然后将上皮组织剪成0.25cm2的小块；
(3)使用胰蛋白酶-EDTA消化液将瘤胃上皮组织小块在3-5℃下冷消化18-24h；
(4)将细胞消化液过滤、离心并洗涤，弃上清之后，细胞沉淀为瘤胃上皮细胞沉淀；
(5)将瘤胃上皮细胞沉淀用完全培养基重悬纯化后，然后于37℃和5％CO2的细胞培养箱中静置培养。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
本发明使用冷消化法进行细胞消化，冷消化法仅需要消化1次，胎牛血清终止消化1次，组织清洗仅需要1次，操作过程简单方便；而常用的多次消化法的次数需要4-7次，胎牛血清终止消化需要3-6次，组织清洗需要4-7次，且每次消化需要37℃条件进行振荡(中国专利CN202011533329.6，CN201710363364.X，CN201810811345.3，CN201711144970.9)，操作过程复杂繁琐。
本发明中冷消化在温度为3-5℃和时间为18-24h的条件下进行，在4℃条件下，胰酶浸透瘤胃组织，虽然酶活性降低，但对细胞的作用缓和，损伤更小，同时增加作用时间，可以取得更好的消化效果。冷消化法分离的奶牛瘤胃上皮第2d贴壁，呈铺路石状；第3d开始铺层，细胞活力纯度及活性较高，可冻存。
本发明提供的一种奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，将消化方式和消化条件的改变，不仅减少了组织消化过程中的繁琐，且减少了人力物力的投入。该方法操作简单，减少细胞污染的可能性，相对细胞活性损伤较轻，且对实验要求不高，可获得纯度高、活性强和可以冻存的原代瘤胃上皮细胞。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1制备的奶牛瘤胃上皮细胞不同培养时间下的显微镜图(倍数200×)；
图2为实施例1制备的奶牛瘤胃上皮细胞中CK18、DAPI、Merge的免疫荧光图(倍数200×)；
图3为实施例1制备的奶牛瘤胃上皮细胞中E-钙粘蛋白(E-Cadherin)、DAPI、Merge的免疫荧光图(倍数200×)；
图4为奶牛瘤胃上皮细胞生长曲线；
图5为复苏的奶牛瘤胃上皮细胞生长图(倍数200×)；
图6为复苏的奶牛瘤胃上皮细胞生长曲线。
具体实施方式
本发明的第一种典型实施方式，一种奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
(1)取奶牛瘤胃组织，将瘤胃内容物用生理盐水冲洗干净后，将瘤胃组织钝性分离，取上皮组织备用；
(2)将瘤胃上皮组织用含抗生素的PBS缓冲液Ⅰ和II进行清洗，然后将上皮组织剪成0.25cm2的小块；
(3)使用胰蛋白酶-EDTA消化液将瘤胃上皮组织小块在3-5℃下冷消化18-24h；
(4)将细胞消化液过滤、离心并洗涤，弃上清之后，细胞沉淀为瘤胃上皮细胞沉淀；
(5)将瘤胃上皮细胞沉淀用完全培养基重悬纯化后，然后于37℃和5％CO2的细胞培养箱中静置培养。
在3-5℃条件下，胰酶浸透瘤胃组织，虽然酶活性降低，但对细胞的作用缓和，损伤更小。同时增加作用时间至18-24h，可以取得更好的消化效果。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(2)中所述PBS缓冲液Ⅰ的pH值为7.2-7.4，其中含有2500U/mL青霉素、2500U/mL链霉素。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(2)中所述PBS缓冲液ⅠI的pH值为7.2-7.4，其中含有5000U/mL庆大霉素、12.5μg/mL两性霉素B。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(2)中所述清洗具体为37℃恒温震荡摇床，用含抗生素的PBS缓冲液Ⅰ清洗2次，含抗生素的PBS缓冲液Ⅱ清洗1次，每次30min。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(3)中胰蛋白酶-EDTA消化液和瘤胃上皮组织小块的体积比为3-4:1，胰蛋白酶-EDTA消化液的pH值为7.2-7.4，胰蛋白酶-EDTA消化液为含胰蛋白酶0.5％、酚红0.2mg/mL、EDTA-Na2 0.23mg/mL的PBS缓冲液。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(4)所述过滤使用的筛网为100目和300目细胞筛。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(4)所述离心为1000r/min离心6min。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(4)所述洗涤所用溶液为含抗生素的PBS缓冲液Ⅳ，pH值为7.2-7.4，含有200μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(5)中所述完全培养基的组成成分包括DMEM低糖培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤(5)中于37℃和5％CO2的细胞培养箱中静置培养6h后，收集细胞悬液于新的培养瓶中，放置37℃和5％ CO2培养箱中培养。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
取奶牛瘤胃组织，将瘤胃内容物用生理盐水冲洗干净后，将瘤胃组织进行钝性分离，取上皮组织备用。
配置pH为7.2-7.4，含有2500U/mL青霉素和2500U/mL链霉素的PBS缓冲液I。配置pH为7.2-7.4，含有5000U/mL庆大霉素、12.5μg/mL两性霉素B的PBS缓冲液II。在37℃恒温震荡摇床上将瘤胃上皮组织用PBS缓冲液Ⅰ清洗2次，每次30min，再用PBS缓冲液II进行30min清洗1次，清洗完成将上皮组织剪成0.25cm2的小块。
配置胰蛋白酶-EDTA消化液，胰蛋白酶-EDTA消化液的消化液的pH为7.2-7.4，含有胰蛋白酶0.5％、酚红0.2mg/mL、EDTA-Na2 0.23mg/mL，溶剂为PBS缓冲液。使用胰蛋白酶-EDTA消化液将瘤胃上皮组织小块在3-5℃下冷消化18-24h，胰蛋白酶-EDTA消化液和瘤胃上皮组织小块的体积比为3:1。
配置含抗生素的PBS缓冲液Ⅳ，pH值为7.2-7.4，含有200μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素。将细胞消化液使用100目和300目细胞筛过滤，1000r/min离心6min，并使用PBS缓冲液IV洗涤，弃上清之后，得到细胞沉淀为瘤胃上皮细胞沉淀。
配置含有DMEM低糖培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素的完全培养基。将瘤胃上皮细胞沉淀用完全培养基重悬纯化后，然后于37℃和5％CO2的细胞培养箱中静置培养6h后，收集细胞悬液于新的培养瓶中，放置37℃和5％ CO2培养箱中培养。
在光学显微镜下观察细胞生长情况，如图1所示，发现瘤胃上皮细胞培养2d贴壁，呈铺路石状；第3d开始铺层。
实施例2
将实施例1中获得的奶牛瘤胃上皮细胞进行免疫荧光鉴定，具体操作如下：
(1)调整细胞钠浓度为1×106个/mL，接种于24孔细胞爬片，带细胞涨至60-70％时，弃去培养液，PBS缓冲液洗涤3次，每次3min；
(2)用4％多聚甲醛固定30min后，弃去固定液，PBS洗涤3次，每次3-5min；
(3)用0.1％ Triton X-100室温孵育细胞10min后，PBS洗涤3次，每次3-5min；
(4)10％BSA室温封闭30min后，加入CK18一抗(1∶100)和E-钙黏蛋白一抗(1∶100)，于4℃孵育过夜；
(5)PBS洗涤3次后，加入相应的荧光二抗(1∶500)，于室温避光孵育1h；
(6)PBS洗涤3次后，用DAPI染色液复染3-5min；
(7)PBS洗涤3次后，用抗荧光猝灭剂封片，并镜检。
CK18和E-Cadherin是上皮细胞特有的标志蛋白。在荧光显微镜下观察发现(如图2和3所示)，CK18和E-Cadherin呈阳性，则证明实施例1获得的细胞为瘤胃上皮细胞。
实施例3
将实施例1中获得的奶牛瘤胃上皮细胞进行生长曲线的测定，具体操作如下：
(1)调整细胞钠浓度为1×106个/mL，接种于96孔，每孔100μL，；
(2)每天固定时间添加CCK-8，孵育4h后，测定OD值，连续11d，然后综合数据绘制细胞生长曲线；
如图4所示，细胞生长曲线呈“S”型，于第4d进入对数增长期，于第7、8d进入平台期，与细胞生长的显微图像相一致。
实施例4
将实施例1中获得的奶牛瘤胃上皮细胞进行细胞的冻存-复苏，具体操作如下：
(1)用全血清冻存液(血清∶DMSO＝9∶1)吹打细胞沉淀，充分混匀后，转移悬液于冻存管中，冻存温度程序：4℃，10min；-20℃，30min；-80℃，过夜；液氮，永久保存；
(2)一个月之后，取出冻存细胞，转移冻存细胞悬液，加完全培养基，稀释DMSO的浓度，于1000r/min离心10min，去上清；
(3)加入完全培养基轻轻吹打细胞沉淀，混匀后，于37℃和5％CO2的细胞培养箱中静置培养6h后，收集细胞悬液于离心管，使用台盼蓝进行细胞计数，调整细胞浓度为1×106个/mL，每孔100μL，接种于96孔板，进行放置37℃，5％ CO2培养箱中培养，用于细胞生长曲线的测定；每孔2mL，接种于6孔板，，用于观察细胞生长状态；进行放置37℃和5％ CO2培养箱中培养。
如图5所示，使用光学显微镜观察，复苏后细胞第2d开始贴壁，第4d开始铺层。如图6所示，第4d进入对数生长期，其9d之后进入平台期。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取奶牛瘤胃组织，将瘤胃内容物用生理盐水冲洗干净后，将瘤胃组织钝性分离，取上皮组织备用；
(2)将瘤胃上皮组织用含抗生素的PBS缓冲液Ⅰ和II进行清洗，然后将上皮组织剪成0.25cm2的小块；
(3)使用胰蛋白酶-EDTA消化液将瘤胃上皮组织小块在3-5℃下冷消化18-24h；
(4)将细胞消化液过滤、离心并洗涤，弃上清之后，细胞沉淀为瘤胃上皮细胞沉淀；
(5)将瘤胃上皮细胞沉淀用完全培养基重悬纯化后，然后于37℃和5％CO2的细胞培养箱中静置培养。
2.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PBS缓冲液Ⅰ的pH值为7.2-7.4，其中含有2500U/mL青霉素、2500U/mL链霉素。
3.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PBS缓冲液ⅠI的pH值为7.2-7.4，其中含有5000U/mL庆大霉素、12.5μg/mL两性霉素B。
4.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(2)中所述清洗具体为37℃恒温震荡摇床，用含抗生素的PBS缓冲液Ⅰ清洗2次，含抗生素的PBS缓冲液Ⅱ清洗1次，每次30min。
5.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(3)中胰蛋白酶-EDTA消化液和瘤胃上皮组织小块的体积比为3-4:1，胰蛋白酶-EDTA消化液的pH值为7.2-7.4，胰蛋白酶-EDTA消化液为含胰蛋白酶0.5％、酚红0.2mg/mL、EDTA-Na2 0.23mg/mL的PBS缓冲液。
6.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(4)所述过滤使用的筛网为100目和300目细胞筛。
7.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(4)所述离心为1000r/min离心6min。
8.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(4)所述洗涤所用溶液为含抗生素的PBS缓冲液Ⅳ，pH值为7.2-7.4，含有200μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
9.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(5)中所述完全培养基的组成成分包括DMEM低糖培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素。
10.如权利要求1所述的奶牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法，其特征在于，步骤(5)中于37℃和5％CO2的细胞培养箱中静置培养6h后，收集细胞悬液于新的培养瓶中，放置37℃和5％CO2培养箱中培养。
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