CN107142242B - 一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞的体外培养领域，具体是一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，采用胰酶联合胶原酶及中性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁获得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。本发明建立了一套分离、培养及鉴定裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得可供科学研究的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞，从而为进一步深入研究裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞在低氧的生理情况下的功能变化提供了可能。

Description

一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及细胞的体外培养领域，具体地说，是一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法。

背景技术

裸鼹鼠是一种分布于东非部分地区的挖掘类啮齿目动物，在分类学上属于哺乳纲、啮齿目、豪猪亚目、滨鼠科、异头鼠亚科、裸鼹鼠属、裸鼹鼠种。裸鼹鼠终生在黑暗的地下生活，能够适应低氧、高二氧化碳浓度的环境。裸鼹鼠耐低氧的特性引起了科学家的广泛关注。骨骼肌是低氧研究的重要对象，骨骼肌作为运动器官，对于氧气浓度高度敏感。

从骨骼肌中分离获得的具有自我更新和分化形成肌纤维能力的肌卫星细胞(muscle satellite cells)在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌细胞(skeletalmyoblasts，SkMs)。来源于骨骼肌的成肌细胞具有取材方便、免疫源性低、植入后容易与宿主的肌纤维融合、体外培养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、转染外源基因的成肌细胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点。因此，成肌细胞被广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。获得纯度较高的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞对于裸鼹鼠的耐低氧机制的研究是十分必要的。

相关分离培养方法尚未在裸鼹鼠中建立。现有的其他物种成肌细胞分离的方法中，消化步骤采用的胰酶和胶原蛋白酶浓度不是裸鼹鼠细胞分离最佳浓度。SkMs是位于骨骼肌纤维膜与基底膜之间的组织干细胞。当骨骼肌受损伤时，可被启动形成新的骨骼肌纤维。一般来讲，肌肉来源的动物越老，分离肌肉细胞所需要的时间越长，而且单个核前体细胞的产量也越低。

由此可见，裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞原代分离纯度不高，不利于通过该细胞对裸鼹鼠进行耐低氧等方面的研究，以至于国外尚未见裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞低氧方面研究的报道。为了研究裸鼹鼠骨骼肌在裸鼹鼠耐低氧等方面发挥的作用，分离纯化、体外培养出较纯度的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，采用胰酶联合胶原酶及中性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁获得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。

本发明的第一方面，提供一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

A、将裸鼹鼠新生鼠骨骼肌，去掉筋膜、脂肪、皮肤等组织，用预冷的洗涤液冲洗数次后，剪碎备用；所述洗涤液的组成为：PBS溶液，加入0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

B、加入每克肌肉1mL组织消化液，33-37℃消化30min，5min摇一次；所述组织消化液的组成为：D-Hanks溶液，0.05％-0.2％(W/V)中性蛋白酶，0.05％-0.2％(W/V)IV型胶原酶，0.1％-0.25％(W/V)I型胶原酶，0.08％-0.25％(W/V)胰酶，0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；

C、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

D、细胞悬液经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞，采用培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33-37℃、3-5％CO₂环境中培养0.5-2h后，重复一次；所述培养基的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗；

E、取细胞培养液及未贴壁的细胞，加入新的培养皿中，在33-37℃、3-5％CO₂、10-15％O₂的环境中继续培养16-36小时，此后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。

其中，步骤A具体还包括：将裸鼹鼠新生鼠窒息处死后，置于75％乙醇中浸泡5min，在超净台中尽快剥取骨骼肌，去掉筋膜、脂肪、皮肤等组织，用预冷的洗涤液冲洗数次，将肌肉剪成碎糜状，移入青霉素小瓶备用。

在本发明的一个优选实施例中，步骤A中，所述洗涤液的组成为：PBS溶液，加入0.01％(W/V)Dnase I、1％(V/V)PS双抗。

在本发明的一个优选实施例中，步骤B中，所述组织消化液的组成为：D-Hanks溶液，0.2％(W/V)胰酶，0.2％(W/V)I型胶原酶，0.1％(W/V)中性蛋白酶，0.1％(W/V)IV型胶原酶，0.01％(W/V)Dnase I。本发明采用胰酶联合胶原酶、中性蛋白酶消化的方法，由于骨骼肌成肌细胞连接紧密，抵抗酶消化的能力较强，故采取多种酶混合消化，发挥叠加作用，使肌肉组织充分分解、消化。

在本发明的一个优选实施例中，步骤C中，所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、10％(V/V)FBS、1％(V/V)PS双抗、0.01％(W/V)Dnase I。

在本发明的一个优选实施例中，步骤D中，所述细胞筛为200目细胞筛。

在本发明的一个优选实施例中，步骤D中，100g离心5min收集细胞。

在本发明的一个优选实施例中，步骤D中，所述培养基的组成为：低糖DMEM培养基、10％(V/V)FBS、1％(V/V)PS双抗。

在本发明的一个优选实施例中，步骤D中，在35℃、5％CO₂的环境中培养40分钟后换液，重复一次。

在本发明的一个优选实施例中，步骤E中，在35℃、5％CO₂、12％O₂的环境中培养24小时，此后隔天换液一次。

在细胞分离过程中，由于酶的作用，细胞受损释放出DNA，与细胞外基质形成DNA蛋白复合物，聚集细胞成团。因此，本发明在细胞分离全程溶液都加入了DnaseI，防止细胞聚团。

本发明优点在于：

1、本发明的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法在已有的其他物种成肌细胞分离方法上作了重要改进，首次成功分离了裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。以新生裸鼹鼠骨骼肌作为细胞提取的组织来源，采取多种混合酶消化，简便快捷地分离裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。差速贴壁的时间也是成功分离骨骼肌成肌细胞的关键，成纤维细胞贴壁时间短，将细胞悬液短时贴壁，除去裸鼹鼠肌肉成纤维细胞。

2、本发明建立了一套分离、培养及鉴定裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的、可供科学研究的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞，从而为进一步深入研究裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞在低氧的生理情况下的功能变化提供了可能。

附图说明

图1为倒置显微镜观察原代培养的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞图；

图2为免疫荧光染色法在荧光显微镜下鉴定裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

以下实施例所使用的主要材料及来源分别如下：

裸鼹鼠(第二军医大学实验动物中心)；

胰酶(Gibco)；胶原蛋白酶(Solarbio)；中性蛋白酶(Solarbio)；DMEM低糖培养基(Gibco)；FBS(Gibco)；DNase I(Solarbio)；双抗(Gibco)；desimin抗体(Proteintech)

组织洗涤液(PBS溶液，加入0.01％Dnase I、1％PS双抗)

消化液(D-Hanks溶液，0.2％胰酶，0.2％I型胶原酶，0.1％中性蛋白酶，0.1％IV型胶原酶，0.01％Dnase I)

抑制液(低糖DMEM培养基、10％FBS、1％PS双抗、0.01％Dnase I)

培养基(低糖DMEM培养基、10％FBS、1％PS双抗)

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1 裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞分离培养方法

(1)将5只新生裸鼹鼠窒息处死后，置于75％乙醇中浸泡5min，在超净台中尽快取下骨骼肌组织，在预冷的洗涤液冲洗至清亮后将肺组织剪成1mm³小块，移入一个青霉素小瓶。

(2)加入5mL组织消化液，37℃消化30min，5min摇一次；所述组织消化液的组成为：中性蛋白酶0.2％，IV型胶原酶0.2％，I型胶原酶0.1％，胰酶0.1％，Dnase I0.01％。

(3)移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：90％低糖DMEM培养基、10％FBS、1％PS双抗、0.01％Dnase I；

(4)细胞悬液经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞，采用培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在35℃、5％CO₂环境中培养2h后，取细胞培养液及未贴壁的细胞，加入新的培养皿中，在35℃、5％CO₂、12％O₂的环境中培养，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。所述培养基的组成为：90％低糖DMEM培养基、10％FBS、1％PS双抗。

实施例2 实施例1的骨骼肌成肌细胞的细胞鉴定及纯度与活力评估

1、细胞鉴定

DESMIN免疫荧光染色鉴定

结蛋白(desmin)是肌细胞内细胞骨架中间丝的构成成分之一，它是最早表达的肌源性标志蛋白。用免疫细胞化学染色方法检测细胞有无desmin表达是目前所知的鉴定骨骼肌成肌细胞的最佳方法。

待骨骼肌成肌细胞爬片达理想密度，4％(W/V)多聚甲醛固定样本10min；PBS洗5min，0.1％(V/V)Triton X-100处理10min，增加细胞膜的通透性；山羊血清封闭1h；孵育一抗(desmin用含0.1％(V/V)Triton X-100的PBS1：1000稀释)稀释，4℃过夜；另外用PBS代替一抗作阴性对照；PBS洗3遍，每次10min，孵育二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L))(用含0.1％(V/V)Triton X-100的PBS 1：200稀释)4℃过夜或37℃避光1h；加入DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)室温3min-5min染核PBS洗3次，10min/次。抗淬灭剂封片。-20℃避光保存，直到荧光显微镜观察成像。

免疫荧光细胞化学染色可见desmin经荧光二抗显色后，呈绿色颗粒状分布于胞浆中，细胞核被DAPI染成蓝色(见图1)。

2、裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞活力评估

台盼蓝染色评估细胞的活力：取对数生长期细胞，调整细胞密度为10⁴/mL.接种于96孔培养板，每孔180μL，培养24h后加0.4％(W/V)台盼蓝，每孔20μL。用细胞全自动计数仪计数，拒染的为活细胞，计算活细胞的百分比，以判断细胞存活状况。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将裸鼹鼠新生鼠骨骼肌，去掉筋膜、脂肪、皮肤等组织，用预冷的洗涤液冲洗数次后，剪碎备用；所述洗涤液的组成为：PBS溶液，0.5％-2％(V/V)PS双抗，0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

B、加入每克肌肉1mL组织消化液，33-37℃消化30min，5min摇一次；所述组织消化液的组成为：D-Hanks溶液，0.2％(W/V)中性蛋白酶，0.2％(W/V)IV型胶原酶，0.1％(W/V)I型胶原酶，0.1％(W/V)胰酶，0.01％(W/V)Dnase I；

C、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

D、细胞悬液经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞，采用培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33-37℃、3-5％CO₂环境中培养0.5-2h后，重复一次；所述培养基的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗；

E、取细胞培养液及未贴壁的细胞，加入新的培养皿中，在33-37℃、3-5％CO₂、10-15％O₂的环境中继续培养16-36小时，此后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。

2.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤A中，所述洗涤液的组成为：PBS溶液，加入0.01％(W/V)Dnase I、1％(V/V)PS双抗。

3.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤C中，所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、10％(V/V)FBS、1％(V/V)PS双抗、0.01％(W/V)Dnase I。

4.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤D中，所述细胞筛为200目细胞筛。

5.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤D中，100g离心5min收集细胞。

6.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤D中，所述培养基的组成为：低糖DMEM培养基、10％(V/V)FBS、1％(V/V)PS双抗。

7.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤D中，在35℃、5％CO₂的环境中培养40分钟后换液，重复一次。

8.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤E中，在35℃、5％CO₂、12％O₂的环境中培养24小时，此后隔天换液一次。

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