CN110951680A - 一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞模型构建技术领域，公开了一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法，具体包括体外培养L6成肌细胞；细胞分化后，用DMSO处理收集细胞培养基，采用western‑blot分析，通过银染蛋白质组学分析、质谱分析候选蛋白的肽序列，估计蛋白质大小确定候选序列；通过多个数据库、数据集，验证AICAR对体外L6成肌细胞分泌CTSB水平的影响，确定AICAR处理后培养基中CTSB的水平变化；测量小鼠运动后体内CTSB水平，验证骨骼肌细胞运动模型的可行性，进行骨骼肌细胞模型的构建。本发明通过用化学物质AICAR处理细胞后构建骨骼肌细胞运动模型，研究其分泌蛋白对机体影响。

Description

一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法
技术领域
本发明属于细胞模型构建技术领域，尤其涉及一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：运动有益于人类健康，其中包括大脑功能。运动可以维持和改善认知能力。在啮齿动物中，运动会引起大脑神经递质、神经营养蛋白水平、神经元形态和血管的形成变化；同时使海马依赖性记忆和成人神经发生增强。在人类中，有氧能力、海马可塑性和记忆之间存在关系。然而，研究运动机制大部分在体内，目前在体外构建骨骼肌细胞运动模型研究较少，构建细胞运动模型对运动机制研究仍不清楚。骨骼肌在运动中起着举足轻重的作用，肌动蛋白可能会影响神经可塑性。肌肉中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)在控制能量稳态中用作诱导型共调节剂，其过表达增加了含有5的纤连蛋白III型结构域(FNDC5)的产生，其被切割并分泌为虹膜素，从而增加了海马的表达。运动可提高人体血浆中的鸢尾素。此外，肌肉中PGC-1α的过表达通过减少神经毒性犬尿氨酸进入大脑而具有抗抑郁样作用。此外，通过AMP活化蛋白激酶(AMPK)激动剂5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)处理L6成肌细胞，来模拟体外运动的效果。AICAR处理后，野生型雄鼠增强了空间记忆，但肌肉特异性AMPK突变小鼠却没有，这支持了骨骼肌与记忆之间的联系。通过体外构建小鼠L6成肌细胞模型，使用蛋白质组学和生化分析，发现成年雄性小鼠的运动中，分泌CTSB是一种血浆和腓肠肌中增加的肌动蛋白。CTSB处理神经细胞在体外可增强双肾上腺皮质激素(DCX)重组蛋白和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。CTSB敲除小鼠表现出空间记忆，成年海马神经发生，齿状颗粒细胞(GC)生理和海马P11水平缺陷。总体而言，CTSB可能在锻炼对大脑的有益作用中发挥重要作用。
运动是影响人类生活的重要因素，运动可以使大脑皮层神经细胞积极活动，进行记录和保存的过程。但当随着年龄增长和大脑疲劳时，其大脑皮层上脑细胞的活动就会受到抑制，甚至处于半休眠或休眠的状态。这时，外界进入大脑的任何信息都不可能得到有效的接收和反应。人在进行脑力活动时，脑细胞需要大量的氧气，所需能量都要由细胞来供给。体力劳动繁重或紧张时，其所需的氧气和养分都会成倍地增加，由于大脑本身并不能储备更多的能量，它需要机体内的其他组织细胞将能量源源不断地对它进行供给。
运动能提高人体各感觉器官机能，使大脑皮质的反应速度加快，视觉敏锐，听觉中枢兴奋集中，位觉、本体感觉的功能得到加强，因而使机体功能得到改善。通过模拟小鼠L6成肌细胞运动模型，对L6成肌细胞体外培养分泌的CTSB水平测量可以更简便、更直观地了解运动对机体生命活动机能影响。
新型骨骼肌细胞运动模型构建目前已经有了一定的研究成果，外构建骨骼肌细胞运动模型难度较大，细胞培养步骤多，细胞培养过程中极易污染，用化学物质AICAR处理细胞后，验证所需方法较多，尤其是蛋白检测方法复杂，但通过用化学物质AICAR处理细胞后构建骨骼肌细胞运动模型研究甚少，研究其分泌蛋白对机体影响未有。机体运动后血浆、腓肠肌中CTSB会增加，CTSB是一种穿过血脑屏障的肌动蛋白。跑步会诱发缺氧，从而可能会升高脑中CTSB水平，这可以促进神经碎片的清除和成人神经的形成，改善人体记忆力。通过体外培养L6成肌细胞，构建体外骨骼肌细胞运动模型，用100μMAICAR处理细胞，测量细胞内和细胞外CTSB水平变化，由于之前一直没有准确证据说明。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术中研究运动机制大部分在体内，目前在体外构建骨骼肌细胞运动模型研究较少，构建细胞运动模型对运动机制研究仍不清楚，AICAR处理细胞后，细胞分泌蛋白量增多还是减少；AICAR是一种化学物质，是否对细胞增殖有影响，对细胞是否有毒性。
(2)新型骨骼肌细胞运动模型构建目前已经有了一定的研究成果，但通过用化学物质AICAR处理细胞后构建骨骼肌细胞运动模型研究甚少，研究其分泌蛋白对机体影响未有。
解决上述技术问题的难度：L6成肌细胞、ANPC细胞在复苏、原代、传代过程中，细胞易污染，换液和显微镜下观察时也容易有细菌和真菌的污染；因此需要每隔24小时换液一次，无菌意识要强，每次实验前需要紫外杀菌半小时，通风十分钟后进行实验。
解决上述技术问题的意义：体外骨骼肌细胞培养是本实验关键之处，细胞生长状态良好，可以用AICAR处理细胞，收集其分泌的蛋白并进行检测，测量细胞内和细胞外CTSB水平变化。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法。
本发明是这样实现的，一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法，所述骨骼肌细胞模型的构建方法具体包括：
步骤一，复苏L6成肌细胞、ANPC细胞，进行L6成肌细胞、ANPC细胞体外原代、传代培养，并利用显微镜对培养过程中的细胞进行细胞形态学观察及分析；
步骤二，L6成肌细胞分化第8天，用100μMAICAR0.1％DMSO处理0、3、6、12小时后收集细胞培养基，采用western-blot分析，用100μM的AICAR处理的培养基中的CTSB蛋白水平增加；
步骤三，通过银染蛋白质组学分析、质谱分析候选蛋白的肽序列，估计蛋白质大小确定候选序列；
步骤四，通过QSPEC、分泌数据库、运动微阵数据集和AICAR处理的微阵数据集，选择具有细胞外功能的37kdaCTSB，验证AICAR对体外L6成肌细胞分泌CTSB水平的影响，确定AICAR处理后培养基中CTSB的水平变化；
步骤五，测量小鼠运动后体内CTSB水平，验证骨骼肌细胞运动模型的可行性，进行骨骼肌细胞模型的构建。
进一步，步骤一中，所述L6成肌细胞原代培养方法具体包括：
(1)准备1支15mL离心管，管中加9mL对应培养基，从-80℃液氮罐中取出L6成肌细胞，在37℃水浴锅中复苏小鼠L6成肌细胞1分钟左右，将细胞悬液转移离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；离心管加DMEM培养基1mL重悬细胞，用细胞计数仪计数；
(2)将浓度以1*105/mL密度接种于100mm培养皿中培养，培养皿中加1mL胎牛血清和9mLDMEM培养基，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养。
进一步，步骤一中，所述L6成肌细胞传代培养方法具体包括：
首先，水浴锅37℃预热配制好的完DMEM加10％牛血清的全培养基、PBS、胰酶，用10mL移液管吸取培养皿中培养基，加2mL胰酶消化细胞2分钟，加5mL培养基终止细胞消化；
其次，用移液枪轻轻吹打细胞，使贴壁细胞脱落；
然后，准备一支15mL离心管，细胞1000rpm离心5min，弃上清；
最后，按1:3比列传代新100mm培养皿中，每皿加10mL培养基，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养。
进一步，步骤一中，所述ANPC细胞的原代、传代培养方法具体包括：
将复苏的ANPC细胞接种于100mm培养皿中培养，加含有加1mL胎牛血清和9mLNeurobasal medium培养基，另外加200μLB27补充剂(1:50)，100μL L-谷氨酰胺(1：100)，20μLEGF(20ng/mL)，20μLbFGF(20ng/mL)和20μL肝素(20ng/mL)中生长，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养24小时后细胞进行换液，细胞扩增后进行传代，定时换液并观察细胞形态补加营养因子。
进一步，步骤二中，所述100μMAICAR处理细胞方法包括：
第一，配制75mMAICAR溶液：取一支15mL离心管，加入10mLDMSO，电子天平称取0.194gAICAR溶于DMSO中，用涡旋仪震荡混匀；
第二，AICAR溶液终浓度是100μM，用移液枪取13.3μL配制好的75mM AICAR溶液加入100mm培养皿中，用十字法将培养液轻轻混匀放置5％CO2、37℃培养箱培养；
第三，取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。
进一步，步骤二中，所述0.1％DMSO组处理细胞方法包括：
用移液枪取10μL加入100mm细胞培养皿中，取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。
进一步，所述CTSB蛋白水平测定方法具体包括：
1)蛋白制备：细胞采用TRIZOL法提取细胞内蛋白：培养细胞：首先收获细胞1.5×107/mL移入1.5ml离心管中，加入1mLTrizol，混匀，室温静置5min；加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置2min；4℃离心12000g，15min，取上清；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；4℃离心，12000g×10min，弃上清；加入1mL75％乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃，7500g，5min，弃上清；晾干：加入适量的DEPCH2O溶解即65℃促溶10-15min；
2)Bradford法测定蛋白质浓度：取50μLBSA溶液，用溶解蛋白样品的缓冲液稀释至200μL，终浓度为0.5mg/mL制备标准品；标准品用量0、3、6、12、24、36、48μL加标准稀释液补足到60μL，分别置于7个1.5mL离心管；取96孔板，样品孔每孔加20μL待测样品；每孔加入200μLG250染色液，室温放置5分钟；用酶标仪测定OD560-610nm波长的吸光度；根据标准曲线计算样品的蛋白浓度；
3)样品准备；先将5×上样缓冲液与裂解液按照1∶4的比例混匀，与样品、裂解液以2∶2∶1的体积比混合形成母液，再对倍稀释；加样前先100℃加热5min，然后以10000rpm/min、4℃离心10min，使蛋白样品充分变性；
4)SDS－PAGE电泳将凝胶玻璃板固定于电泳装置并放入电泳槽内，在槽内外加入1×SDS电泳缓冲液；对照孔加入蛋白Marker，其他孔加入等体积梯度浓度样品；加样完成后，接通电源，将电压调至110V，约90min电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部时停止；
5)湿转移：电泳结束后，取干净的电转槽，倒入转移缓冲液；将转印夹置于平面，依次平铺放上海绵、薄滤纸、切除多余部分的胶、在甲醇溶液中浸泡活化1min的PVDF膜、薄滤纸、海绵合成三明治结构放入装有冰盒的转移槽内，并将整个转移槽放入冰水混合物中，保持转膜过程中的低温，120V转膜1h；
6)封闭、抗体孵育及检测：将转膜后的PVDF膜放入抗体孵育盒中，加入适量的封闭液，在室温下孵育1h左右以封闭膜上剩余疏水结合位点。按照比例为1∶1000将1μL的抗体加到1mL封闭液中，4℃摇床过夜孵育；用PBST洗膜3次，每次10min以洗去未结合的抗体；按照比例为1∶10000将1μL的抗体加入到10mL的封闭液中，室温下孵育1h；用PBST洗膜3次，每次10min，另外一组则洗膜总时间为8h；将膜取出用显色液中A液与B液等比例混匀后浸润进行显影，分别曝光6s和21s及利用ImageJ和ImagequantTL两种图像处理软件读取灰度值检测蛋白表达量变化。
进一步，步骤三中，所述蛋白银染具体包括以下步骤：
a.凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放人盒中，加入100mL左右的固定液，摇床上缓缓摇动30min；
b.洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min；
c.凝胶氧化：弃双蒸水，加入100mL左右前处理液氧化30min；
d.洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min；
e.凝胶染色：弃双蒸水，加入100mL左右的染色液避光摇20min；
f.洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min；
g.凝胶显色：加入100mL显色液摇到看到清晰的条带为止；
h.终止：弃显色液，迅速加入终止液100mL左右，摇10min；
i.洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min；
j.凝胶拍照观察分析。
本发明的另一目的在于提供一种骨骼肌细胞模型的测定方法，所述骨骼肌细胞模型的测定方法具体包括：
(1)基于构建的骨骼肌细胞模型验证CTSB增强ANPC中的DCX和BDNF水平；
(2)构建的骨骼肌细胞模型，8天后，将细胞分化并在无血清培养基中饥饿3小时，并在指定的时间点用AICAR100μM孵育，western-blot分析AICAR处理细胞蛋白水平表达，通过ELISA测量细胞外蛋白水平。
进一步，所述ELISA法测量细胞外蛋白水平具体包括：
1)取L6成肌细胞，1000rpm/min离心5min，取上清待测；
2)进行L6浓度测定：梯度稀释L6细胞标准品，按100μL/孔分别加入梯度标准品和待测样品，封板膜封板后置于摇床上，摇床转动速度为140r/min，转动时间为45min；
3)甩去板孔内液体，200μL/孔洗涤液清洗5次，100μL/孔加入生物素化检测抗体，封板膜封板置于摇床上，摇床转动速度为140r/min，转动时间为30min；
4)洗涤液洗板，200μL/孔洗涤液清洗5次，加入链霉亲和素-HRP复合物100μL/孔，摇床上摇匀，摇床转动速度为140r/min，转动时间为30min；
5)再次使用洗涤液清洗板孔，200μL/孔洗涤液清洗5次，加入100μL TMB至每孔，4～8min后加入100μL/孔的终止液；
6)酶标仪检测波长450nm处光密度值，计算浓度以及细胞质量比浓度。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过用化学物质AICAR处理细胞后构建骨骼肌细胞运动模型，研究其分泌蛋白对机体影响，通过对L6成肌细胞体外培养，用AICAR处理后探究细胞培养基中CTSB水平变化；通过动态观察小鼠运动后测量其血浆和腓肠肌中CTSB水平，与体外培养L6成肌细胞用AICAR处理后CTSB水平进行对比，能够为进一步研究新型骨骼肌细胞运动模型分泌CTSB改善机体生命活动提供科学依据。
本发明模拟小鼠骨骼肌细胞运动模型，对L6成肌细胞体外培养基用AICAR处理比传统电刺激更便捷，可行性较强。本发明体外培养ANPCS细胞，验证CTSB处理神经细胞在体外可增强双肾上腺皮质激素(DCX)重组蛋白和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，为用于进一步基础研究和临床应用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的骨骼肌细胞模型的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的L6成肌细胞、ANPC细胞体外培养方法流程图。
图3是本发明实施例提供的确定AICAR处理后培养基中CTSB的水平变化方法流程图。
图4是本发明实施例提供的确定久坐和跑步后小鼠行为变化方法流程图。
图5是本发明实施例提供的运动后CTSB表达的验证方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1至图5所示，本发明实施例提供的骨骼肌细胞模型的构建方法具体包括：
S101，复苏L6成肌细胞、ANPC细胞，进行L6成肌细胞、ANPC细胞体外原代、传代培养，并利用显微镜对培养过程中的细胞进行细胞形态学观察及分析。
S102，L6成肌细胞分化第8天，用100μMAICAR0.1％DMSO处理0、3、6、12小时后收集细胞培养基，采用western-blot分析，用100μM的AICAR处理的培养基中的CTSB蛋白水平增加。
S103，通过银染蛋白质组学分析、质谱分析候选蛋白的肽序列，估计蛋白质大小确定候选序列。
S104，通过QSPEC、分泌数据库、运动微阵数据集和AICAR处理的微阵数据集，选择具有细胞外功能的37kdaCTSB，验证AICAR对体外L6成肌细胞分泌CTSB水平的影响，确定AICAR处理后培养基中CTSB的水平变化。
S105，测量小鼠运动后体内CTSB水平，验证骨骼肌细胞运动模型的可行性，进行骨骼肌细胞模型的构建。
步骤S101中，本发明实施例提供的L6成肌细胞原代培养方法具体包括：
(1)准备1支15mL离心管，管中加9mL对应培养基，从-80℃液氮罐中取出L6成肌细胞，在37℃水浴锅中复苏小鼠L6成肌细胞1分钟左右，将细胞悬液转移离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；离心管加DMEM培养基1mL重悬细胞，用细胞计数仪计数。
(2)将浓度以1*105/mL密度接种于100mm培养皿中培养，培养皿中加1mL胎牛血清和9mLDMEM培养基，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养。
步骤S101中，本发明实施例提供的L6成肌细胞传代培养方法具体包括：
首先，水浴锅37℃预热配制好的完DMEM加10％牛血清的全培养基、PBS、胰酶，用10mL移液管吸取培养皿中培养基，加2mL胰酶消化细胞2分钟，加5mL培养基终止细胞消化。
其次，用移液枪轻轻吹打细胞，使贴壁细胞脱落。
然后，准备一支15mL离心管，细胞1000rpm离心5min，弃上清。
最后，按1:3比列传代新100mm培养皿中，每皿加10mL培养基，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养。
步骤S101中，本发明实施例提供的ANPC细胞的原代、传代培养方法具体包括：
将复苏的ANPC细胞接种于100mm培养皿中培养，加含有加1mL胎牛血清和9mLNeurobasalmedium培养基，另外加200μLB27补充剂(1:50)，100μL L-谷氨酰胺(1：100)，20μLEGF(20ng/mL)，20μLbFGF(20ng/mL)和20μL肝素(20ng/mL)中生长，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养24小时后细胞进行换液，细胞扩增后进行传代，定时换液并观察细胞形态补加营养因子。
步骤S102中，本发明实施例提供的100μMAICAR处理细胞方法包括：
第一，配制75mMAICAR溶液：取一支15mL离心管，加入10mLDMSO，电子天平称取0.194gAICAR溶于DMSO中，用涡旋仪震荡混匀。
第二，AICAR溶液终浓度是100μM，用移液枪取13.3μL配制好的75mM AICAR溶液加入100mm培养皿中，用十字法将培养液轻轻混匀放置5％CO2、37℃培养箱培养。
第三，取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。
步骤S102中，本发明实施例提供的0.1％DMSO组处理细胞方法包括：
用移液枪取10μL加入100mm细胞培养皿中，取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。
本发明实施例提供的CTSB蛋白水平测定方法具体包括：
1)蛋白制备：细胞采用TRIZOL法提取细胞内蛋白：培养细胞：首先收获细胞1.5×107/mL移入1.5ml离心管中，加入1mLTrizol，混匀，室温静置5min；加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置2min；4℃离心12000g，15min，取上清；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；4℃离心，12000g×10min，弃上清；加入1mL75％乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃，7500g，5min，弃上清；晾干：加入适量的DEPCH2O溶解即65℃促溶10-15min。
2)Bradford法测定蛋白质浓度：取50μLBSA溶液，用溶解蛋白样品的缓冲液稀释至200μL，终浓度为0.5mg/mL制备标准品；标准品用量0、3、6、12、24、36、48μL加标准稀释液补足到60μL，分别置于7个1.5mL离心管；取96孔板，样品孔每孔加20μL待测样品；每孔加入200μLG250染色液，室温放置5分钟；用酶标仪测定OD560-610nm波长的吸光度；根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。
3)样品准备；先将5×上样缓冲液与裂解液按照1∶4的比例混匀，与样品、裂解液以2∶2∶1的体积比混合形成母液，再对倍稀释；加样前先100℃加热5min，然后以10000rpm/min、4℃离心10min，使蛋白样品充分变性。
4)SDS－PAGE电泳将凝胶玻璃板固定于电泳装置并放入电泳槽内，在槽内外加入1×SDS电泳缓冲液；对照孔加入蛋白Marker，其他孔加入等体积梯度浓度样品；加样完成后，接通电源，将电压调至110V，约90min电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部时停止。
5)湿转移：电泳结束后，取干净的电转槽，倒入转移缓冲液；将转印夹置于平面，依次平铺放上海绵、薄滤纸、切除多余部分的胶、在甲醇溶液中浸泡活化1min的PVDF膜、薄滤纸、海绵合成三明治结构放入装有冰盒的转移槽内，并将整个转移槽放入冰水混合物中，保持转膜过程中的低温，120V转膜1h。
6)封闭、抗体孵育及检测：将转膜后的PVDF膜放入抗体孵育盒中，加入适量的封闭液，在室温下孵育1h左右以封闭膜上剩余疏水结合位点。按照比例为1∶1000将1μL的抗体加到1mL封闭液中，4℃摇床过夜孵育；用PBST洗膜3次，每次10min以洗去未结合的抗体；按照比例为1∶10000将1μL的抗体加入到10mL的封闭液中，室温下孵育1h；用PBST洗膜3次，每次10min，另外一组则洗膜总时间为8h；将膜取出用显色液中A液与B液等比例混匀后浸润进行显影，分别曝光6s和21s及利用ImageJ和ImagequantTL两种图像处理软件读取灰度值检测蛋白表达量变化。
步骤S103中，本发明实施例提供的蛋白银染具体包括以下步骤：
a.凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放人盒中，加入100mL左右的固定液，摇床上缓缓摇动30min。
b.洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min。
c.凝胶氧化：弃双蒸水，加入100mL左右前处理液氧化30min。
d.洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min。
e.凝胶染色：弃双蒸水，加入100mL左右的染色液避光摇20min。
f.洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min。
g.凝胶显色：加入100mL显色液摇到看到清晰的条带为止。
h.终止：弃显色液，迅速加入终止液100mL左右，摇10min。
i.洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min。
j.凝胶拍照观察分析。
本发明实施例提供的骨骼肌细胞模型的测定方法具体包括：
(1)基于构建的骨骼肌细胞模型验证CTSB增强ANPC中的DCX和BDNF水平。
(2)构建的骨骼肌细胞模型，8天后，将细胞分化并在无血清培养基中饥饿3小时，并在指定的时间点用AICAR100μM孵育，western-blot分析AICAR处理细胞蛋白水平表达，通过ELISA测量细胞外蛋白水平。
本发明实施例提供的ELISA法测量细胞外蛋白水平具体包括：
1)取L6成肌细胞，1000rpm/min离心5min，取上清待测。
2)进行L6浓度测定：梯度稀释L6细胞标准品，按100μL/孔分别加入梯度标准品和待测样品，封板膜封板后置于摇床上，摇床转动速度为140r/min，转动时间为45min。
3)甩去板孔内液体，200μL/孔洗涤液清洗5次，100μL/孔加入生物素化检测抗体，封板膜封板置于摇床上，摇床转动速度为140r/min，转动时间为30min。
4)洗涤液洗板，200μL/孔洗涤液清洗5次，加入链霉亲和素-HRP复合物100μL/孔，摇床上摇匀，摇床转动速度为140r/min，转动时间为30min。
5)再次使用洗涤液清洗板孔，200μL/孔洗涤液清洗5次，加入100μL TMB至每孔，4～8min后加入100μL/孔的终止液。
6)酶标仪检测波长450nm处光密度值，计算浓度以及细胞质量比浓度。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：
1.1方法
1.1.1小鼠L6成肌细胞、ANPC细胞体外培养
实验对象：体外培养的L6成肌细胞
在无菌细胞房开展本实验，L6成肌细胞、ANPC细胞培养4周。
细胞培养技术方法：培养换好衣帽，消毒进细胞房，打开生物安全柜，紫外照射杀菌30分钟，通风10分钟使用。
(1)L6成肌细胞原代培养：首先准备1支15mL离心管，管中加9mL对应培养基，从-80℃液氮罐中取出L6成肌细胞，在37℃水浴锅中复苏小鼠L6成肌细胞1分钟左右，将细胞悬液转移离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。离心管加DMEM培养基1mL重悬细胞，用细胞计数仪计数。将浓度以1*105/mL密度接种于100mm培养皿中培养，培养皿中加1mL胎牛血清(FBS)和9mL DMEM培养基，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养。24小时后细胞进行换液，细胞在培养阶段，每天显微镜下观察细胞形态变化，并及时拍照；细胞换液过程中防止细胞污染。
(2)L6成肌细胞传代培养：水浴锅37℃预热配制好的完全培养基(DMEM+10％FBS)、PBS、胰酶，用10mL移液管吸取培养皿中培养基，加2mL胰酶消化细胞2分钟，加5mL培养基终止细胞消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使贴壁细胞脱落。准备一支15mL离心管，细胞1000rpm离心5min，弃上清。按1：3比列传代新100mm培养皿中，每皿加10mL培养基，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养。24小时后细胞进行换液，细胞在培养阶段，每天显微镜下观察细胞形态变化，并及时拍照；细胞换液过程中防止细胞污染。
(3)ANPC(小鼠海马神经元细胞)复苏、培养方法同L6成肌细胞，接种于100mm培养皿中培养，加含有加1mL胎牛血清(FBS)和9mLNeurobasal medium培养基，另外加200μLB27补充剂(1：50)，100μLL-谷氨酰胺(1：100)，20μLEGF(20ng/mL)，20μLbFGF(20ng/mL)和20μL肝素(20ng/mL)中生长，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养24小时后细胞进行换液，细胞扩增后进行传代，定时换液并观察细胞形态补加营养因子。
1.1.2AICAR处理小鼠体外L6成肌细胞，测CTSB的水平
实验对象：L6成肌细胞
实验设计：对照实验
通过1.1.1培养的小鼠L6成肌细胞体外条件培养基分为：加AICAR处理组、加0.1％DMSO处理组；并分别测定条件培养基中CTSB含量。L6成肌细胞分化第8天，用100μMAICAR0.1％DMSO处理0、3、6、12小时后收集细胞培养基，采用western-blot分析，AICAR(100μM)处理的培养基中的CTSB蛋白水平增加。银染蛋白质组学分析、质谱分析候选蛋白的肽序列，估计蛋白质大小确定候选序列。通过QSPEC、分泌数据库、运动微阵数据集(GSD2234)和AICAR处理的微阵数据集，来选择具有细胞外功能的37kdaCTSB，来验证AICAR对体外L6成肌细胞分泌CTSB水平的影响。
100μMAICAR处理细胞方法如下：
(1)配制75mMAICAR溶液：取一支15mL离心管，加入10mLDMSO，电子天平称取0.194gAICAR溶于DMSO中，用涡旋仪震荡混匀。
(2)AICAR溶液终浓度是100μM，用移液枪取13.3μL配制好的75mM AICAR溶液加入100mm培养皿中，用十字法将培养液轻轻混匀放置5％CO2、37℃培养箱培养。
(3)取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。
0.1％DMSO组处理细胞方法如下：用移液枪取10μL加入100mm细胞培养皿中，取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。
CTSB蛋白水平测定技术如下：
(1)蛋白制备：细胞采用TRIZOL法提取细胞内蛋白：培养细胞：首先收获细胞1.5×107/mL移入1.5ml离心管中，加入1mLTrizol，混匀，室温静置5min；加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置2min。4℃离心12000g，15min，取上清。
加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g×10min，弃上清。加入1mL75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g，5min，弃上清。晾干：加入适量的DEPCH2O溶解(65℃促溶10-15min)。
(2)Bradford法测定蛋白质浓度：取50μLBSA溶液，用溶解蛋白样品的缓冲液稀释至200μL，终浓度为0.5mg/mL制备标准品；标准品用量0、3、6、12、24、36、48μL加标准稀释液补足到60μL，分别置于7个1.5mL离心管；取96孔板，样品孔每孔加20μL待测样品；每孔加入200μLG250染色液，室温放置5分钟；用酶标仪测定OD(560-610nm)波长的吸光度；根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。
(3)样品准备；先将5×上样缓冲液与裂解液按照1∶4的比例混匀，与样品、裂解液以2∶2∶1的体积比混合形成母液，再对倍稀释。加样前先100℃加热5min，然后以10000rpm/min、4℃离心10min，使蛋白样品充分变性。
(4)SDS－PAGE电泳将凝胶玻璃板固定于电泳装置并放入电泳槽内，在槽内外加入1×SDS电泳缓冲液。对照孔加入蛋白Marker，其他孔加入等体积梯度浓度样品。加样完成后，接通电源，由于使用的是连续不分层的预制胶，故将电压调至110V，约90min电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部时停止。
(5)湿转移：电泳结束后，取干净的电转槽，倒入转移缓冲液。将转印夹置于平面，依次平铺放上海绵、薄滤纸、胶(切除多余部分)、PVDF膜(甲醇溶液中浸泡活化1min)、薄滤纸、海绵合成三明治结构放入装有冰盒的转移槽内，并将整个转移槽放入冰水混合物中，保持转膜过程中的低温，120V转膜1h。
(6)封闭、抗体孵育及检测：将转膜后的PVDF膜放入抗体孵育盒中，加入适量的封闭液，在室温下孵育1h左右以封闭膜上剩余疏水结合位点。按照比例为1∶1000将1μL的抗体加到1mL封闭液中，4℃摇床过夜孵育。用PBST洗膜3次，每次10min以洗去未结合的抗体；根据抗体说明书按照比例为1∶10000将1μL的抗体加入到10mL的封闭液中，室温下孵育1h。用PBST洗膜3次，每次10min，另外一组则洗膜总时间为8h。将膜取出用显色液中A液与B液等比例混匀后浸润进行显影，分别曝光6s和21s及利用ImageJ和ImagequantTL两种图像处理软件读取灰度值检测蛋白表达量变化。
蛋白银染步骤：
(1)凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放人盒中，加入100mL左右的固定液，摇床上缓缓摇动30min；
(2)洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min；
(3)凝胶氧化：弃双蒸水，加入100mL左右前处理液氧化30min；
(4)洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min；
(5)凝胶染色：弃双蒸水，加入100mL左右的染色液避光摇20min；
(6)洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min；
(7)凝胶显色：加入100mL显色液摇到看到清晰的条带为止；
(8)终止：弃显色液，迅速加入终止液100mL左右，摇10min；
(9)洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min。
(10)凝胶拍照观察分析。
1.1.3确定久坐和跑步后小鼠的行为变化
实验动物：4周野生型小鼠和CTSBKO小鼠(WT：野生型小鼠WT-S：久坐，WT-R跑步；KO：敲除CTSB基因小鼠，KO-S：久坐；KO：跑步)
实验设计：对照实验(每组n＝7–9只)
通过1.1.2得出AICAR处理体外培养的L6细胞后对其分泌CTSB水平影响，因此通过测量小鼠运动后体内CTSB水平，来验证骨骼肌细胞运动模型的可行性。将小鼠分为两组分别是：久坐组和跑步组。25℃，给足够水和食物喂养小鼠。分别测量在第14天和第30天跑步水平，测量腓肠肌中CTSB水平。跑步后，腓肠肌CTSB蛋白水平升高。运动后情绪相关行为、空间记忆、成人神经也会受影响。
情绪行为检测：强迫游泳测试被用来测试抑郁症的行为(每组n＝7–9)，与KO小鼠相比，WT-R的不动时间减少，运动时间较多，较为活跃。空间记忆检测：在莫里斯水迷宫中对两组小鼠小鼠(每组n＝7–9)进行了训练，分别在24小时和48小时之后进行了探测试验，以评估空间记忆的保持力。在24h和48h时，WT-R组均较所有其他象限更喜欢平台象限。WT-S组在24h表现出靶标偏爱，但在48h则没有。KO组没有表现出目标偏好。相对比4组小鼠，在KO小鼠中，未成熟的成年海马DCX+C型细胞减少，证明成人海马神经形成与运动有一定的关系，与其他组相比，WT-R组中的D型细胞有所增加。
1.1.4验证CTSB增强ANPC中的DCX和BDNF水平
实验对象：培养的ANPC细胞
实验设计：对照试验
通过1.1.3验证体外构建骨骼肌细胞运动模型，用AICAR处理细胞后和小鼠运动后体内CTSB水平变化差异不大。因此构建新型细胞模型，外加CTSB处理后，对海马神经细胞影响，进而对大脑影响，和改善记忆力有关。CTSB处理神经细胞在体外可增强双肾上腺皮质激素(DCX)重组蛋白和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。因此实验分为：外源CTSB处理海马祖细胞组、加蒸馏水处理海马祖细胞组。跑步会增加海马CTSBmRNA和成人神经发生。将外源CTSB应用于不同剂量处理海马祖细胞24小时，提取细胞中mRNA。
外源CTSB(rCTSB)处理海马祖细胞组方法如下：用rCTSB(100ng/ml)处理后，DCXmRNA和BdnfmRNA表达分别增加，rCTSB48小时后DCXmRNA表达升高。此外，与对照相比，24小时的rCTSB增加了BDNFmRNA的表达。在ANPC中，给予rCTSB(10和100ng/ml)24小时可增加DCX和BDNF水平。
细胞中mRNA提取技术：
(1)生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的退火：在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。
(2)65℃加热10min。加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20×SSC于RNA中轻轻混匀，室温放置，逐渐冷却平衡至室温，此步操作一般需10min。
(3)亲和素顺磁磁珠(SA-PMPS)的冲洗：将SA-PMPS轻晃开后，放入磁性分离架中，使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒)，小心去除上清(不用离心方法)用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，漂洗3次。将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5×SSC中。杂交体的生成及漂洗。将已经褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针，全部加到用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次管中；轻轻混匀，室温放置10min。每隔2分钟轻轻混匀一次。
(4)用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。
(5)用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。
(6)洗涤收集mRNA：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中，用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并(约0.25ml)。在洗脱液中加入0.1体积的NaAC，1体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，12000g离心10min，75％乙醇洗沉淀，真空干燥。
(7)提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260，280nm比色，要求A.OD260％/OD280％不小于2.0及40μg所提样品在OD260％的值为1。
(8)提取mRNA质量的电泳检测，在1％的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。
1.1.5运动后CTSB表达的验证
实验对象：运动后小鼠和L6成肌细胞
实验设计：对照实验
验证CTSB是可能影响大脑的候选肌动蛋白，研究了分化成肌细胞中CTSB表达。8天后，将细胞分化并在无血清培养基中饥饿3小时，并在指定的时间点用AICAR(100μM)孵育。因此，通过ELISA测量细胞外蛋白水平。在100μM AICAR处理后6小时和12小时，CTSB在分化的L6成肌细胞中显着增加。此外，对运行了3、14或30天的小鼠(每组n＝6～8)的血浆样品CTSB进行分析显示，其水平发生变化。与对照组相比，血浆CTSB在14天和30天后分别升高。发现表明，跑步会导致骨骼肌CTSB分泌。
ELISA法测量细胞外蛋白水平技术：
(1)取L6成肌细胞，1000rpm/min离心5min，取上清待测。
(2)根据L6RapidELISAKit(Biosensis公司，澳大利亚)说明书进行L6浓度测定：梯度稀释L6细胞标准品，按100μL/孔分别加入梯度标准品和待测样品，封板膜封板后置于摇床上(140r/min，45min)。
(3)甩去板孔内液体，200μL/孔洗涤液清洗5次，100μL/孔加入生物素化检测抗体，封板膜封板置于摇床上(140r/min，30min)。
(4)洗涤液洗板(200μL/孔，5次)，加入链霉亲和素-HRP复合物(100μL/孔)，摇床上摇匀(140r/min，30min)。
(5)再次使用洗涤液清洗板孔(200μL/孔，共5次)，加入100μLTMB至每孔，4～8min后加入终止液(100μL/孔)。
(6)酶标仪检测波长450nm处光密度值。计算浓度以及细胞质量比浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，所述骨骼肌细胞模型的构建方法包括以下步骤：
步骤一，复苏L6成肌细胞、ANPC细胞，进行L6成肌细胞、ANPC细胞体外原代、传代培养，并利用显微镜对培养过程中的细胞进行细胞形态学观察及分析；
步骤二，L6成肌细胞分化第8天，用100μMAICAR 0.1％DMSO处理0、3、6、12小时后收集细胞培养基，采用western-blot分析，用100μM的AICAR处理的培养基中的CTSB蛋白水平增加；
步骤三，通过银染蛋白质组学分析、质谱分析候选蛋白的肽序列，估计蛋白质大小确定候选序列；
步骤四，通过QSPEC、分泌数据库、运动微阵数据集和AICAR处理的微阵数据集，选择具有细胞外功能的37kda CTSB，验证AICAR对体外L6成肌细胞分泌CTSB水平的影响，确定AICAR处理后培养基中CTSB的水平变化；
步骤五，测量小鼠运动后体内CTSB水平，验证骨骼肌细胞运动模型的可行性，进行骨骼肌细胞模型的构建。
2.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述L6成肌细胞原代培养方法具体包括：
(1)准备1支15mL离心管，管中加9mL对应培养基，从-80℃液氮罐中取出L6成肌细胞，在37℃水浴锅中复苏小鼠L6成肌细胞1分钟左右，将细胞悬液转移离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；离心管加DMEM培养基1mL重悬细胞，用细胞计数仪计数；
(2)将浓度以1*105/mL密度接种于100mm培养皿中培养，培养皿中加1mL胎牛血清和9mLDMEM培养基，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养。
3.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述L6成肌细胞传代培养方法具体包括：
首先，水浴锅37℃预热配制好的完DMEM加10％牛血清的全培养基、PBS、胰酶，用10mL移液管吸取培养皿中培养基，加2mL胰酶消化细胞2分钟，加5mL培养基终止细胞消化；
其次，用移液枪轻轻吹打细胞，使贴壁细胞脱落；
然后，准备一支15mL离心管，细胞1000rpm离心5min，弃上清；
最后，按1:3比列传代新100mm培养皿中，每皿加10mL培养基，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养。
4.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述ANPC细胞的原代、传代培养方法具体包括：将复苏的ANPC细胞接种于100mm培养皿中培养，加含有加1mL胎牛血清和9mLNeurobasal medium培养基，另外加200μLB27补充剂，100μL L-谷氨酰胺，20μL EGF，20μLbFGF和20μL肝素中生长，细胞放置在5％CO2、37℃培养箱培养24小时后细胞进行换液，细胞扩增后进行传代，定时换液并观察细胞形态补加营养因子。
5.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述100μMAICAR处理细胞方法包括：
第一步，配制75mM AICAR溶液：取一支15mL离心管，加入10mL DMSO，电子天平称取0.194gAICAR溶于DMSO中，用涡旋仪震荡混匀；
第二步，AICAR溶液终浓度是100μM，用移液枪取13.3μL配制好的75mM AICAR溶液加入100mm培养皿中，用十字法将培养液混匀放置5％CO2、37℃培养箱培养；
第三步，取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。
6.如权利要求5所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，所述CTSB蛋白水平测定方法具体包括：
1)蛋白制备：细胞采用TRIZOL法提取细胞内蛋白：培养细胞：首先收获细胞1.5×107/mL移入1.5ml离心管中，加入1mL Trizol，混匀，室温静置5min；加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置2min；4℃离心12000g，15min，取上清；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；4℃离心，12000g×10min，弃上清；加入1mL75％乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃，7500g，5min，弃上清；晾干：加入适量的DEPC H2O溶解即65℃促溶10-15min；
2)Bradford法测定蛋白质浓度：取50μL BSA溶液，用溶解蛋白样品的缓冲液稀释至200μL，终浓度为0.5mg/mL制备标准品；标准品用量0、3、6、12、24、36、48μL加标准稀释液补足到60μL，分别置于7个1.5mL离心管；取96孔板，样品孔每孔加20μL待测样品；每孔加入200μLG250染色液，室温放置5分钟；用酶标仪测定OD560-610 nm波长的吸光度；根据标准曲线计算样品的蛋白浓度；
3)样品准备；先将5×上样缓冲液与裂解液按照1∶4的比例混匀，与样品、裂解液以2∶2∶1的体积比混合形成母液，再对倍稀释；加样前先100℃加热5min，然后以10000rpm/min、4℃离心10min，使蛋白样品充分变性；
4)SDS－PAGE电泳将凝胶玻璃板固定于电泳装置并放入电泳槽内，在槽内外加入1×SDS电泳缓冲液；对照孔加入蛋白Marker，其他孔加入等体积梯度浓度样品；加样完成后，接通电源，将电压调至110V，90min电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部时停止；
5)湿转移：电泳结束后，取电转槽，倒入转移缓冲液；将转印夹置于平面，依次平铺放上海绵、薄滤纸、切除多余部分的胶、在甲醇溶液中浸泡活化1min的PVDF膜、薄滤纸、海绵合成三明治结构放入装有冰盒的转移槽内，并将整个转移槽放入冰水混合物中，保持转膜过程中的低温，120V转膜1h；
6)封闭、抗体孵育及检测：将转膜后的PVDF膜放入抗体孵育盒中，加入适量的封闭液，在室温下孵育1h以封闭膜上剩余疏水结合位点。按照比例为1∶1000将1μL的抗体加到1mL封闭液中，4℃摇床过夜孵育；用PBST洗膜3次，每次10min以洗去未结合的抗体；按照比例为1∶10000将1μL的抗体加入到10mL的封闭液中，室温下孵育1h；用PBST洗膜3次，每次10min，另外一组则洗膜总时间为8h；将膜取出用显色液中A液与B液等比例混匀后浸润进行显影，分别曝光6s和21s及利用Image J和ImagequantTL两种图像处理软件读取灰度值检测蛋白表达量变化。
7.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述0.1％DMSO组处理细胞方法包括：
用移液枪取10μL加入100mm细胞培养皿中，取5支1.5mL离心管每支收取0、3、6、12、24小时细胞培养基1mL，测其CTSB蛋白水平。
8.如权利要求1所述的骨骼肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述蛋白银染具体包括以下步骤：
(1)凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放人盒中，加入100mL的固定液，摇床上摇动30min；
(2)洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min；
(3)凝胶氧化：弃双蒸水，加入100mL前处理液氧化30min；
(4)洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min；
(5)凝胶染色：弃双蒸水，加入100mL的染色液避光摇20min；
(6)洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min；
(7)凝胶显色：加入100mL显色液摇到看到条带为止；
(8)终止：弃显色液，加入终止液100mL，摇10min；
(9)洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min；
(10)凝胶拍照观察分析。
9.一种如权利要求1所述骨骼肌细胞模型构建方法使用的骨骼肌细胞模型测定方法，其特征在于，所述骨骼肌细胞模型的测定方法具体包括：
(1)基于构建的骨骼肌细胞模型验证CTSB增强ANPC中的DCX和BDNF水平；
(2)构建的骨骼肌细胞模型，8天后，将细胞分化并在无血清培养基中饥饿3小时，并在指定的时间点用AICAR 100μM孵育，western-blot分析AICAR处理细胞蛋白水平表达，通过ELISA测量细胞外蛋白水平。
10.如权利要求9所述的骨骼肌细胞模型的测定方法，其特征在于，所述ELISA法测量细胞外蛋白水平具体包括：
1)取L6成肌细胞，1000rpm/min离心5min，取上清待测；
2)进行L6浓度测定：梯度稀释L6细胞标准品，按100μL/孔分别加入梯度标准品和待测样品，封板膜封板后置于摇床上，摇床转动速度为140r/min，转动时间为45min；
3)甩去板孔内液体，200μL/孔洗涤液清洗5次，100μL/孔加入生物素化检测抗体，封板膜封板置于摇床上，摇床转动速度为140r/min，转动时间为30min；
4)洗涤液洗板，200μL/孔洗涤液清洗5次，加入链霉亲和素-HRP复合物100μL/孔，摇床上摇匀，摇床转动速度为140r/min，转动时间为30min；
5)再次使用洗涤液清洗板孔，200μL/孔洗涤液清洗5次，加入100μL TMB至每孔，4～8min后加入100μL/孔的终止液；
6)酶标仪检测波长450nm处光密度值，计算浓度以及细胞质量比浓度。
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