CN110317847A - 一种动物组织来源的提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种动物组织来源提取物及其制备方法和用途。该方法包括以下步骤：(1)将动物组织匀浆；(2)在步骤(1)获得的匀浆组织中加入低浓度的胰蛋白酶水溶液，制成混合液，在不添加任何培养基的情况下置于厌氧培养箱孵育；(3)将步骤(2)孵育后的混合液离心后，收集上清液，同时保留沉积的组织物；(4)在步骤(3)获得的沉积的组织物中加入高浓度的胰蛋白酶水溶液，然后搅拌，离心，收集上清液；(5)将步骤(3)和步骤(4)收集的上清液合并。采用本发明的方法能够以高提取率制备提取物，并且所获得的提取物性能稳定。

Description

一种动物组织来源的提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种从动物组织制备提取物的方法、该方法制备的提取物以及其用途。
背景技术
动物提取物是以动物体、部分动物体组织或者脏器为原料，经提取加工而制得的稳定的浓集物。以前一般称之为生化制品或生化原料药。其主要成分类别有：氨基酸、肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质、核酸及其衍生物，主要可以用于食品、生物制药、保健、医疗、美容等等。
动物提取物的原料常常是由屠宰场供应的，这些动物组织和器官的收集、贮存和运输等都是确保提取物的质量、效能和安全性的重要因素。在大多数情况下，制取它们需要经过压翻、冷冻、解冻和提取等过程。
目前，动物组织来源的提取物通常采用酶解法的方式来制备。例如，中国专利CN105420325B公开了采用胰蛋白酶进行一步酶解法制备胎盘多肽的方法。CN101773522B公开了利用两步酶解法来制备猪肠黏膜提取物，其先采用胰蛋白酶对猪肠黏膜进行酶解，然后再对酶解产物采用木瓜蛋白酶酶解。
然而，采用以上方法制备的提取物存在稳定性不高、提取率较低、酶源无法灭活、携带热原体、保存条件苛刻、使用单一等缺陷。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种提取率高且稳定、应用广泛的动物组织来源提取物的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种动物组织来源的提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将动物组织匀浆；
(2)在步骤(1)获得的匀浆组织中加入低浓度的胰蛋白酶水溶液，制成混合液，在不添加任何培养基的情况下置于厌氧培养箱孵育；
(3)将步骤(2)孵育后的混合液离心后，收集上清液，同时保留沉积的组织物；
(4)在步骤(3)获得的沉积的组织物中加入高浓度的胰蛋白酶水溶液，然后搅拌，离心，收集上清液；
(5)将步骤(3)和步骤(4)收集的上清液合并。
优选地，所述动物为哺乳动物；优选地，所述哺乳动物选自牛、羊、猪、兔、马、水貂、鲸鱼等。
优选地，所述动物组织选自胚胎、脐带和胎盘。
优选地，在步骤(1)中，匀浆前将动物组织用水清洁；优选地，清洁后的动物组织用碘伏浸泡，优选浸泡1-5分钟，取出后用酒精脱碘，优选体积比为60％-90％酒精；优选地，脱碘后的动物组织用水冲洗，优选地，冲洗1-5次；优选地，将冲洗后的动物组织机械匀浆；更优选地，匀浆前将动物组织用水清洁后，在碘伏内浸泡1min后取出用体积比为75％的酒精脱碘，用水冲洗3次，并在无菌条件下机械匀浆；优选地，所述水是灭菌纯水。
优选地，在步骤(2)中，低浓度的胰蛋白酶水溶液为1.0-4.0g/L的胰蛋白酶水溶液，更优选地，在步骤(1)获得的匀浆组织中加入1～50倍体积的水和1～5倍体积的1.0-4.0g/L的胰蛋白酶水溶液，优选2.5g/L的胰蛋白酶水溶液，制成混合液；优选地，匀浆组织：水：胰蛋白酶水溶液的体积比为：1:20:2、1:30:3或1:40:4；优选地，将所述混合液置于厌氧培养箱中于35℃～45℃下孵育24～72小时；更优选地，在步骤(1)获得的匀浆组织中加入30倍体积的水和3倍体积的2.5g/L的胰蛋白酶水溶液，制成混合液，将所述混合液在不添加任何培养基的情况下置于厌氧培养箱中于40℃下孵育35小时；优选地，所述水是灭菌纯水。
优选地，在步骤(3)中，将步骤(2)孵育后的混合液以3000～10000r/min离心10～20min后，收集上清液2～8℃保存；优选地，以4000r/min、6000r/min或8000r/min离心；优选地，离心10、15或20min；更优选地，将步骤(2)孵育后的混合液以6000r/min离心15min后，收集上清液2℃保存。
优选地，在步骤(4)中，高浓度的胰蛋白酶水溶液为20-30g/L的胰蛋白酶水溶液，更优选地，在步骤(3)获得的沉积的组织物中加入1～5倍体积的20-30g/L的胰蛋白酶水溶液，优选25g/L的胰蛋白酶水溶液；优选地，沉积组织物和胰蛋白酶水溶液的体积比为1:2、1:3或1:4；优选地，搅拌24～72小时后，加入同等体积的水混匀后，以3000～10000r/min离心10～20min；优选地，以4000r/min、6000r/min或8000r/min离心；优选地，离心10、15或20min；收集上清液2～8℃保存；更优选地，在步骤(3)获得的沉积组织物中加入3倍体积的25g/L的胰蛋白酶水溶液，然后搅拌36小时后，加入同等体积的水混匀后，以6000r/min离心15min，收集上清液8℃保存；优选地，所述水是灭菌纯水。
进一步优选地，所述制备方法还包括步骤(6)：将步骤(5)合并后的上清液中的微生物和胰蛋白酶灭活，收集灭活后的上清液；优选地，在60℃-90℃水浴锅中灭活10-30分钟；更优选地，在60℃水浴锅中灭活30分钟。
进一步优选地，所述制备方法还包括步骤(7)：将步骤(6)灭活后的上清液过滤除菌；优选地，将灭活后的上清液依次通过孔径为120μm、70μm、25μm、100nm、50nm、20nm的滤器去除病原体，过滤条件为进口压力0.3～1.0MPa，温度为2～8℃，收集过滤液；优选地，过滤条件为：进口压力0.3MPa，温度为2℃；优选地，过滤条件为：进口压力0.6MPa，温度为8℃；优选地，过滤条件为进口压力0.9MPa，温度为8℃。
进一步优选地，所述制备方法还包括(8)提取物的超滤，优选地，为了保证滤膜的通过率和完整性，提高收集率，施加正负压力进行超滤；更优选地，将步骤(7)收集的过滤液，施加正负压力分别过50000道尔顿和5000道尔顿分子量的滤膜，小于50000道尔顿大于5000道尔顿为细胞因子，小于5000道尔顿为复合多肽，分别收集过滤液，过滤条件为：进口压力0.3～1.0MPa，出口压力-0.3～-1.0MPa，温度为2～8℃，低温保存；优选地，过滤条件为：进口压力0.3MPa，出口压力-0.3MPa，温度为2℃；优选地，过滤条件为：进口压力0.6MPa，出口压力-0.6MPa，温度为8℃；优选地，过滤条件为：进口压力0.9MPa，出口压力-0.9MPa，温度为2℃。
进一步优选地，所述制备方法还包括(9)提取物的冻干保存：将步骤(8)获得的过滤液在2～8小时内，冷冻到-40℃～-50℃，真空干燥；优选地，将过滤液分装置于西林瓶中冷冻干燥；优选地，在3小时内，冷冻到-50℃；优选地，在5小时内，冷冻到-45℃；优选地，在7小时内，冷冻到-40℃；优选地，真空干燥后，使温度上升到常温，长期常温保存备用。
本发明还提供一种由上述方法制备的动物组织来源提取物。
本发明的动物组织来源提取物可用于制备护肤品、生物材料、细胞培养液或细胞培养基等生物制品，在生物制药、医疗保健、医疗美容等领域具有广泛的用途。
本发明通过将动物组织先用低浓度胰蛋白酶酶解，随后进行饥饿刺激培养，然后再采用高浓度胰蛋白酶对经过饥饿刺激的动物组织进行酶解这种两步酶解法来制备提取物。与现有技术相比，本发明具有以下的优点和效果：(1)提取物稳定；(2)提取率增加；(3)提取物无病原体；(4)提取物无制热原；(5)可以多种方法保存。常温液态和低温液态保存，常温或低温保存冻干粉；(6)提取物的应用广泛。
附图说明
图1为常规培养的贴壁的间充质细胞的实验细胞图。
图2为常规培养的贴壁的间充质细胞的对照细胞图。
图3为采用本发明提取物替换培养基后培养的实验细胞图。
图4为未采用本发明提取物替换培养基后培养的对照细胞图。
图5为采用常规方法和本发明方法提取的脐带提取物的加速试验图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
实施例1鼠胚胎组织来源提取物的制备
本发明鼠胚胎组织来源提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)动物组织的处理：取经检验检疫后的健康小鼠，脱颈椎处死怀孕小鼠，剖腹取出鼠胚胎，用灭菌纯水清洁鼠胚胎后，在碘伏内浸泡2min后取出用体积比75％的酒精脱碘，用灭菌纯水冲洗3次，并在无菌条件下机械式匀浆。
(2)提取物的富集：在步骤(1)获得的匀浆组织加入20倍体积的灭菌纯水和2倍体积的2.5g/L的胰蛋白酶水溶液，制成混合液，将所述混合液在不添加任何培养基的情况下置于厌氧培养箱中于35℃下孵育72小时，进行饥饿刺激。
(3)提取物的澄清分离：将步骤(2)孵育后的混合液以4000r/min离心20min后，收集上清液2℃保存。同时保留沉积的组织物。
(4)提取物的酶解：在步骤(3)获得的沉积的组织物中加入2倍体积的25g/L的胰蛋白酶水溶液，然后置于搅拌器中搅拌72小时后，加入同等体积的灭菌纯水混匀后，以4000r/min离心20min，收集上清液2℃保存。
(5)合并上清液：将步骤(3)和步骤(4)收集的上清液合并。
(6)微生物和胰蛋白酶灭活：将步骤(5)合并后的上清液在60℃水浴锅中灭活30分钟，收集灭活后的上清液。
(7)提取物的过滤除菌：将步骤(6)灭活后的上清液依次通过孔径为120μm、70μm、25μm、100nm、50nm、20nm的滤器去除病原体，过滤条件为：进口压力0.3MPa，温度为2℃，收集过滤液。
(8)提取物的超滤：将步骤(7)收集的过滤液，施加正负压力分别过50000道尔顿和5000道尔顿分子量的滤膜，小于50000道尔顿大于5000道尔顿为细胞因子，小于5000道尔顿为复合多肽，分别收集过滤液，过滤条件为：进口压力0.3MPa，出口压力-0.3MPa，温度为2℃，低温保存。
(9)提取物的冻干保存：将步骤(8)获得的过滤液分装置于西林瓶中，在3小时内，冷冻到-50℃，抽真空干燥后，使温度上升到常温即可长期常温保存备用。
实施例2牛脐带组织提取物的制备
本发明牛脐带组织来源提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)动物组织的处理：取经检验检疫后的健康母牛自然分娩后的离体脐带组织，用丝线将脐带两头扎紧后，浸泡于生理盐水里中，4℃下运回实验室，用灭菌纯水清洁脐带组织后，用无菌手术剪刀去除脐带两头后，碘伏内浸泡1min后取出用体积比75％的酒精脱碘，用灭菌纯水冲洗3次，并在无菌条件下机械式匀浆。
(2)提取物的富集：在步骤(1)获得的匀浆组织加入30倍体积的灭菌纯水和3倍体积的2.5g/L的胰蛋白酶水溶液，制成混合液，将所述混合液在不添加任何培养基的情况下置于厌氧培养箱中于40℃下孵育35小时，进行饥饿刺激。
(3)提取物的澄清分离：将步骤(2)孵育后的混合液以6000r/min离心15min后，收集上清液8℃保存。同时保留沉积的组织物。
(4)提取物的酶解：在步骤(3)获得的沉积的组织物中加入3倍体积的25g/L的胰蛋白酶水溶液，然后置于搅拌器中搅拌36小时后，加入同等体积的灭菌纯水混匀后，以6000r/min离心15min，收集上清液8℃保存。
(5)合并上清液：将步骤(3)和步骤(4)收集的上清液合并。
(6)微生物和胰蛋白酶灭活：将步骤(5)合并后的上清液在60℃水浴锅中灭活30分钟，收集灭活后的上清液。
(7)提取物的过滤除菌：将步骤(6)灭活后的上清液，依次通过孔径为120μm、70μm、25μm、100nm、50nm、20nm的滤器去除病原体，过滤条件为：进口压力0.6MPa，温度为8℃，收集过滤液。
(8)提取物的超滤：将步骤(7)收集的过滤液，施加正负压力分别过50000道尔顿和5000道尔顿分子量的滤膜，小于50000道尔顿大于5000道尔顿为细胞因子，小于5000道尔顿为复合多肽，分别收集过滤液，过滤条件为：进口压力0.6MPa，出口压力-0.6MPa，温度为8℃，低温保存。
(9)提取物的冻干保存：将步骤(8)获得的过滤液分装置于西林瓶中，在5小时内，冷冻到-45℃，抽真空干燥后，使温度上升到常温即可长期常温保存备用。
实施例3兔胎盘组织提取物的制备
本发明兔胎盘组织来源提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)动物组织的处理：取经检验检疫后的健康兔，洁净房自然分娩后，收集胎盘组织，用灭菌纯水清洁后，将胎盘组织用无菌剪刀在无菌条件下，剪切成大小1cm3的块，转移到碘伏内浸泡2min后取出用体积比75％的酒精脱碘，用灭菌纯水冲洗3次，并在无菌条件下机械式匀浆。
(2)提取物的富集：在步骤(1)获得的匀浆组织加入40倍体积的灭菌纯水和4倍体积的2.5g/L的胰蛋白酶水溶液，制成混合液，将所述混合液在不添加任何培养基的情况下置于厌氧培养箱中于45℃下孵育24小时，饥饿刺激。
(3)提取物的澄清分离：将步骤(2)孵育后的混合液以8000r/min离心10min后，收集上清液8℃保存。同时保留沉积的组织物。
(4)提取物的酶解：在步骤(3)获得的沉积的组织物中加入4倍体积的25g/L的胰蛋白酶水溶液，然后置于搅拌器中，搅拌24小时后，加入同等体积的灭菌纯水混匀后，以8000r/min离心10min，收集上清液2℃保存。
(5)合并上清液：将步骤(3)和步骤(4)收集的上清液合并。
(6)微生物和胰蛋白酶灭活：将步骤(5)合并后的上清液在60℃水浴锅中灭活30分钟，收集灭活后的上清液。
(7)提取物的过滤除菌：将步骤(6)灭活后的上清液依次通过孔径为120μm、70μm、25μm、100nm、50nm、20nm的滤器去除病原体，过滤条件为进口压力0.9MPa，温度为8℃，收集过滤液。
(8)提取物的超滤：将步骤(7)收集的过滤液，施加正负压力分别过50000道尔顿和5000道尔顿分子量的滤膜，小于50000道尔顿大于5000道尔顿为细胞因子，小于5000道尔顿为复合多肽，分别收集过滤液，过滤条件为：进口压力0.9MPa，出口压力-0.9MPa，温度为2℃，低温保存。
(9)提取物的冻干保存：将步骤(8)获得的过滤液分装置于西林瓶中，在7小时内，冷冻到-40℃，抽真空干燥后，使温度上升到常温即可长期常温保存备用。
实施例4常规法制备鼠胚胎组织来源的提取物
常规法制备鼠胚胎组织来源提取物的方法如下：
(1)动物组织的处理：取经检验检疫后的健康小鼠，脱颈椎处死怀孕小鼠，剖腹取出鼠胚胎，用灭菌纯水清洁鼠胚胎后，在碘伏内浸泡2min后取出用体积比75％的酒精脱碘，用灭菌纯水冲洗3次，并在无菌条件下机械式匀浆。
(2)提取物的酶解：在步骤(1)获得的匀浆组织中加入同等体积的10g/L的胰蛋白酶水溶液，常温6个小时后，以4000r/min离心20min，收集上清液2℃保存。
(3)微生物和胰蛋白酶灭活：将步骤(2)收集的上清液在60℃水浴锅中灭活30分钟，收集灭活后的上清液。
(4)提取物的过滤除菌：将步骤(3)灭活后的上清液，依次通过孔径为120μm、70μm、25μm、100nm、50nm、20nm的滤器去除病原体，过滤条件为进口压力0.3MPa，温度为2℃，收集过滤液。
(5)提取物的超滤：将步骤4)收集的过滤液，施加正负压力分别过50000道尔顿和5000道尔顿分子量的滤膜，小于50000道尔顿大于5000道尔顿为细胞因子，小于5000道尔顿为复合多肽，分别收集过滤液，过滤条件为：进口压力0.3MPa，出口压力-0.3MPa，温度为2℃，低温保存。
(6)提取物的冻干保存：将步骤(5)获得的过滤液分装置于西林瓶中，在3小时内，冷冻到-50℃，抽真空干燥后，使温度上升到常温即可长期常温保存备用。
实施例5提取率测定
采用实施例1-4提取物冻干保存后的重量计算提取率。提取率的计算公式如下：
C＝A÷(A+B)×100
其中：
A：有效收集的提取物冻干后的重量
B：无效收集的废弃物冻干后的重量
C：提取率
实施例1-4提取物的提取率见表1。
表1
实验案例 提取率
实施例1 64.3％
实施例2 65.6％
实施例3 63.6％
实施例4 43.7％
由上述提取率可见，实施例4采用常规法的提取率不到50％，而实施例1-3采用本发明方法的提取率均在60％以上，采用本发明的提取方法获得的提取物明显多于常规法。
实施例6提取物中活性成分的检测
使用胶体金技术和酶联免疫吸附(ELISA)法检测实施例1制备的鼠胚胎组织来源的提取物中的活性成分。
注：由于胶体金技术缺陷，灵敏度不高，故检测结果和ELISA结果不完全一致。
由以上实验可见，采用本发明方法制备的提取物包含多种活性成分。
实施例7提取物的应用
间充质细胞培养的应用：
取长满瓶的间充质细胞，按照常规方式1:2分瓶传代(即将1瓶细胞瓶内的原代细胞分成2等分，接种到2个细胞瓶内进行传代培养)，置于温度为37℃、5％二氧化碳的恒温恒湿的培养箱中，同一批次传代获得两组细胞，分为实验细胞和对照细胞，待细胞贴壁后拍照记录(参见图1和图2)，其中，图1为实验细胞贴壁后照片，图2为对照细胞贴壁后照片。分别加入培养基，其中，实验细胞采用以下培养基：DMEM/F12 8ml+实施例1提取物4ml；对照细胞采用培养基：DMEM/F12 10ml；置于温度为37℃、5％二氧化碳的恒温恒湿培养箱中培养3天后，拍照对比观察(参见图3和图4)，其中，图3为实验细胞加入培养基培养后的图，图4对照细胞加入培养基培养后的图。结果显示：使用本发明提取物的培养基培养的细胞增殖显著，图3细胞增殖约85％，胞体成梭形类纤维样。图4细胞几乎停止增殖，胞体宽大扁平，呈衰老分化状态样生长。实验细胞在数量和形态(参见图3)上都优于对照细胞(参见图4)。
实施例8脐带提取物加速试验
根据生物制品稳定性研究技术指导原则，加速和强制条件试验可以用于了解产品在短期偏离保存条件和极端情况下产品的稳定性情况。
分别将实施例2制备的脐带提取物和常规方法制备的脐带提取物进行加速试验。其中，常规方法制备脐带提取物的方法如下：
(1)脐带组织的处理：取经检验检疫后的健康母牛自然分娩后的离体脐带组织，用丝线将脐带两头扎紧后，浸泡于生理盐水里中，4℃下运回实验室，用灭菌纯水清洁脐带组织后，用无菌手术剪刀去除脐带两头后，碘伏内浸泡1min后取出用体积比75％的酒精脱碘，用灭菌纯水冲洗3次，并在无菌条件下机械式匀浆。
(2)提取物的酶解：在步骤(1)获得的匀浆组织物中加入3倍体积的10g/L的胰蛋白酶水溶液，然后置于搅拌器中搅拌36小时后，加入同等体积的灭菌纯水混匀后，以6000r/min离心15min，收集上清液8℃保存。
(3)微生物和胰蛋白酶灭活：将步骤(2)收集的上清液在60℃水浴锅中灭活30分钟，收集灭活后的上清液。
(4)提取物的过滤除菌：将步骤(3)灭活后的上清液，依次通过孔径为120μm、70μm、25μm、100nm、50nm、20nm的滤器去除病原体，过滤条件为进口压力0.6MPa，温度为8℃，收集过滤液。
(5)提取物的超滤：将步骤(4)收集的过滤液，施加正负压力分别过50000道尔顿和5000道尔顿分子量的滤膜，小于50000道尔顿大于5000道尔顿为细胞因子，小于5000道尔顿为复合多肽，分别收集过滤液，过滤条件为：进口压力0.6MPa，出口压力-0.6MPa，温度为8℃，低温保存。
(6)提取物的冻干保存：将步骤(5)获得的过滤液分装置于西林瓶中，在5小时内，冷冻到-45℃，抽真空干燥后，使温度上升到常温即可长期常温保存备用。
试验条件为40℃，相对湿度75％，并在15天的试验时间内进行多次的反复冻融。图5为加速试验结果图。a瓶为常规方法制备的脐带提取物进行加速试验后的结果，b瓶为实施例2制备的脐带提取物进行加速试验后的结果。图5中，a瓶样品虽澄清，但有大量絮状物产生，而b瓶样品澄清且无絮状物产生。由此可知，采用本发明方法制备的提取物稳定性更高。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (11)

1.一种动物组织来源的提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将动物组织匀浆；
(2)在步骤(1)获得的匀浆组织中加入低浓度的胰蛋白酶水溶液，制成混合液，在不添加任何培养基的情况下置于厌氧培养箱孵育；
(3)将步骤(2)孵育后的混合液离心后，收集上清液，同时保留沉积的组织物；
(4)在步骤(3)获得的沉积的组织物中加入高浓度的胰蛋白酶水溶液，然后搅拌，离心，收集上清液；
(5)将步骤(3)和步骤(4)收集的上清液合并；
优选地，所述动物为哺乳类动物；优选地，所述哺乳动物选自牛、羊、猪、兔、马、水貂、鲸鱼等；
优选地，所述动物组织选自胚胎、脐带和胎盘。
2.权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，匀浆前将动物组织用水清洁；优选地，清洁后的动物组织用碘伏浸泡，优选浸泡1-5分钟，取出后用酒精脱碘，优选体积比为60％-90％酒精；优选地，脱碘后的动物组织用水冲洗，优选地，冲洗1-5次；优选地，将冲洗后的动物组织机械匀浆；更优选地，匀浆前将动物组织用水清洁后，在碘伏内浸泡1min后取出用体积比为75％的酒精脱碘，用水冲洗3次，并在无菌条件下机械匀浆；优选地，所述水是灭菌纯水。
3.权利要求1或2所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，在步骤(1)获得的匀浆组织中加入1～50倍体积的水和1～5倍体积的1.0-4.0g/L的胰蛋白酶水溶液，优选2.5g/L的胰蛋白酶水溶液，制成混合液；优选地，匀浆组织：水：胰蛋白酶水溶液的体积比为：1:20:2、1:30:3或1:40:4；优选地，将所述混合液置于厌氧培养箱中于35℃～45℃下孵育24～72小时；更优选地，在步骤(1)获得的匀浆组织中加入30倍体积的水和3倍体积的2.5g/L的胰蛋白酶水溶液，制成混合液，将所述混合液在不添加任何培养基的情况下置于厌氧培养箱中于40℃下孵育35小时；优选地，所述水是灭菌纯水。
4.权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，将步骤(2)孵育后的混合液以3000～10000r/min离心10～20min后，收集上清液2～8℃保存；优选地，以4000r/min、6000r/min或8000r/min离心；优选地，离心10、15或20min；更优选地，将步骤(2)孵育后的混合液以6000r/min离心15min后，收集上清液2℃保存。
5.权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，将步骤(3)获得的沉积的组织物中加入1～5倍体积的20-30g/L的胰蛋白酶水溶液，优选25g/L的胰蛋白酶水溶液；优选地，沉积的组织物和胰蛋白酶水溶液的体积比为1:2、1:3或1:4；优选地，搅拌24～72小时后，加入同等体积的水混匀后，以3000～10000r/min离心10～20min；优选地，以4000r/min、6000r/min或8000r/min离心；优选地，离心10、15或20min；收集上清液2～8℃保存；更优选地，在步骤(3)获得的沉积组织物中加入3倍体积的25g/L的胰蛋白酶水溶液，然后搅拌36小时后，加入同等体积的水混匀后，以6000r/min离心15min，收集上清液8℃保存；优选地，所述水是灭菌纯水。
6.权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括步骤(6)：将步骤(5)合并后的上清液中的微生物和胰蛋白酶灭活，收集灭活后的上清液；优选地，在60℃-90℃水浴锅中灭活10-30分钟；更优选地，在60℃水浴锅中灭活30分钟。
7.权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括步骤(7)：将步骤(6)灭活后的上清液过滤除菌；优选地，灭活后的上清液依次通过孔径为120μm、70μm、25μm、100nm、50nm、20nm的滤器去除病原体，过滤条件为进口压力0.3～1.0MPa，温度为2～8℃，收集过滤液；优选地，过滤条件为：进口压力0.3MPa，温度为2℃；优选地，过滤条件为:进口压力0.6MPa，温度为8℃；优选地，过滤条件为进口压力0.9MPa，温度为8℃。
8.权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括步骤(8)：提取物的超滤；优选地，施加正负压力进行超滤；更优选地，将步骤(7)收集的过滤液，施加正负压力分别过50000道尔顿和5000道尔顿分子量的滤膜，分别收集过滤液，过滤条件为：进口压力0.3～1.0MPa，出口压力-0.3～-1.0MPa，温度为2～8℃，低温保存；优选地，过滤条件为：进口压力0.3MPa，出口压力-0.3MPa，温度为2℃；优选地，过滤条件为：进口压力0.6MPa，出口压力-0.6MPa，温度为8℃；优选地，过滤条件为：进口压力0.9MPa，出口压力-0.9MPa，温度为2℃。
9.权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括步骤(9)：将步骤(8)获得的过滤液在2～8小时内，冷冻到-40℃～-50℃，真空干燥；优选地，将过滤液分装置于西林瓶中冷冻干燥；优选地，在3小时内，冷冻到-50℃；优选地，在5小时内，冷冻到-45℃；优选地，在7小时内，冷冻到-40℃；优选地，真空干燥后，使温度上升到常温，长期常温保存备用。
10.权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备的动物组织来源提取物。
11.权利要求10所述的动物组织来源提取物在制备护肤品、生物材料、细胞培养液或细胞培养基中的用途。
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