CN105087482A - 一种细胞培养基质及其应用与使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种细胞培养基质及其应用与使用方法。本发明提供的细胞培养基质，包括胶原蛋白膜和培养液。本发明利用胶原蛋白膜作为载体，配合有效的培养液，促进了hUC-MSCs向角膜上皮细胞的分化。实验表明，将hUC-MSCs接种于胶原蛋白膜后以本发明所述的培养液诱导7天后hUC-MSCs分化率可达32％。而不采用胶原蛋白膜为载体的诱导的分化率仅为9.54％。说明采用胶原蛋白膜能够显著提高hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率。

Description

一种细胞培养基质及其应用与使用方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种细胞培养基质及其应用与使用方法。

背景技术

健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件，结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的主要来源。多种致病因素，如：眼外伤、手术创伤、炎症、药物毒性均可造成角膜缘损伤，造成角膜缘干细胞功能障碍，导致上皮细胞缺失，从而导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险。因此，通过体外培养获得大量用于角膜修复的上皮细胞这一难题亟待解决。临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘干细胞作为角膜上皮修复的种子细胞取得了良好疗效。但是，自体角膜缘干细胞体外连续培养所要求的培养液成分复杂，细胞不稳定易分化，细胞不能持续扩增，细胞表型发生改变，所以每次移植都要在患者或其家属的正常角膜上取下部分角膜缘组织进行体外培养，操作繁琐，且给患者带来二次痛苦，并且有研究者发现当取供眼角膜缘组织大于三分之二时，将造成健眼的眼表疾病和视力不可逆的下降，使得大多数患者难以接受。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。

脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等优点，并且，脐带间充质干细胞不受任何伦理及法理限制，因而吸引了众多的研究者。但是，体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化十分困难。

细胞固定化技术可较好地保护细胞，提高细胞对机械和化学环境所造成压力的耐受性，实现细胞高密度培养,提高目的产物产率。用膜作为固定化的载体具有系统稳定、操作简便、经济廉价等优点。对动物细胞培养来说，膜载体的生物毒性、生物相容性对细胞本身的作用是不容忽视的问题，因为这直接影响到细胞的生长、增殖、代谢及最终蛋白的分泌；从操作工艺角度考虑，载体材料的耐热性也是不得不考虑的问题；另外，载体的价格及使用成本，对载体的最终使用具有决定性意义。

因此，利用有机膜材料，建立体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的有效方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养基质及其应用与使用方法。本发明提供的细胞培养基质能够用于脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化，且能够具有较高的分化率。

本发明提供的细胞培养基质，包括胶原蛋白膜和培养液；

其中，培养液包括基础培养基、表皮生长因子和胰岛素。

本发明将胶原蛋白作为膜载体，具有良好的生物相容性，其能够使细胞在相对稳定的环境中生长和分化。实验表明，采用胶原蛋白膜为载体诱导hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率可达32％，而未采用胶原蛋白膜为载体进行诱导的对比例分化效率仅为9.54％。说明采用胶原蛋白膜能够显著提高hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率。

并且，本发明提供的培养液中添加了表皮生长因子和胰岛素。其中，表皮生长因子(EGF)能够促进表皮细胞的分裂，胰岛素能够促进细胞对葡萄糖、氨基酸的代谢，提高细胞的生长状态。本发明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素，从而提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率。实验表明，添加表皮生长因子和胰岛素的实验组hUC-MSCs向角膜上皮细胞的分化率可达32％。说明通过添加EGF和胰岛素能够显著提高hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率。

在本发明的实施例中，胶原蛋白膜中胶原蛋白的浓度为3g/L～12g/L。

在一些实施例中，胶原蛋白膜中胶原蛋白的浓度为9g/L。

在本发明的实施例中，胶原蛋白膜中胶原蛋白的含量为98.47％，所述胶原蛋白的分子量为330.3kDa、263.64kDa、118.47kDa、109.64kDa。

其中分子量为330.3kDa的胶原蛋白的质量分数为4.84％；分子量为263.64kDa的胶原蛋白的质量分数为48.37％；分子量为118.47kDa的胶原蛋白的质量分数为35.21％；分子量为109.64kDa的胶原蛋白的质量分数为10.05％；

本发明采用的胶原蛋白膜可为自制也可经商业途径购得，本发明对此不作限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。

本发明采用的胶原蛋白为I型胶原。

在本发明的实施例中，胶原蛋白为鱼胶原蛋白。

鱼来源胶原蛋白取材方便，材料廉价。并且，鱼类不存在牛、羊、猪等哺乳动物具有的疯牛病、口蹄疫等人畜共患疾病的风险，安全性高。

本发明采用的胶原蛋白中不含有色氨酸和胱氨酸，甘氨酸的质量分数为33.4％，羟脯氨酸的质量分数为10.03％，羟脯氨酸与脯氨酸之比为0.77，羟脯氨酸含量高于羟赖氨酸含量。

本发明实施例中，胶原蛋白的制备方法包括：

步骤1：鱼皮经碱处理、盐洗、无水乙醇浸泡、酸处理后滤除残渣，获得滤液；

步骤2：将滤液离心弃沉淀后以胃蛋白酶酶解，经盐析、透析、冻干制得胶原蛋白；透析截留分子量为100kDa。

本发明实施例中，胶原蛋白膜的制备方法包括：以醋酸为溶剂，将胶原蛋白与戊二醛交联后烘干，经碱处理后以水冲洗，获得胶原蛋白膜。

胶原蛋白膜在进行细胞培养或诱导分化前需以乙醇浸泡后再以培养基浸泡。

在本发明的实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为(5～25)：(5000～25000)。

作为优选，表皮生长因子与胰岛素的质量比为2:3000～3:2000。

优选的，表皮生长因子与胰岛素的质量比为1:1000。

在本发明的实施例中，表皮生长因子的含量为5ng/mL～25μg/mL；胰岛素的含量为5ng/mL～25μg/mL。

作为优选，表皮生长因子的含量为5ng/mL；胰岛素的含量为5μg/mL。

作为优选，表皮生长因子的含量为10ng/mL；胰岛素的含量为10μg/mL。

作为优选，表皮生长因子的含量为10ng/mL；胰岛素的含量为15μg/mL。

作为优选，表皮生长因子的含量为15ng/mL；胰岛素的含量为10μg/mL。

作为优选，表皮生长因子的含量为25ng/mL；胰岛素的含量为25μg/mL。

在本发明的实施例中，基础培养液为人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为(50～60):(44～50)。

作为优选，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为55:45。

本发明所用的人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。其中，人干细胞无血清培养基适宜培养干细胞，本发明采用的人干细胞无血清培养基为LonzaUltraCULTURE^TM。角朊细胞无血清培养基适宜培养上皮细胞，本发明采用的角朊细胞无血清培养基为KSFM培养液。本发明采用的基础培养液皆不含有异源血清，降低了动物源血清给人体带来的风险。

在本发明的实施例中，本发明提供的培养基中还包括青霉素和链霉素。

在一些实施例中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为100U/mL。

本发明提供的培养基质在诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化中的应用。

本发明还提供了诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，包括：以胶原蛋白膜为载体接种脐带间充质干细胞，经孵育后以培养液诱导；培养液包括基础培养基、表皮生长因子和胰岛素。

在一些实施例中，接种的hUC-MSCs细胞为第3～第5代细胞。

在一些实施例中，接种的密度为3×10⁵个/ml。

在一些实施例中，孵育的时间为2h，条件为5％CO₂、37℃、湿度95％。

在一些实施例中，培养液诱导的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％，每2～3天全量更换培养液，共诱导7天。

在一些实施例中，脐带间充质干细胞的原代分离方法为组织块培养法；

具体的，hUC-MSCs的原代分离方法包括以下步骤：

步骤1：将脐带用含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次，以体积分数为75％的乙醇水溶液浸泡1min～2min后，去除脐带外膜和血管；

步骤2：以人干细胞无血清培养液培养，培养条件为5％CO₂、37℃、湿度95％；第5～7天半量换培养基，继续培养12～14天后全量换液去掉组织块，收集细胞传代培养。

本发明提供的细胞培养基质，包括胶原蛋白膜和培养液。本发明利用胶原蛋白膜作为载体，配合有效的培养液，促进了hUC-MSCs向角膜上皮细胞的分化。实验表明，将hUC-MSCs接种于胶原蛋白膜后以本发明所述的培养液诱导7天后hUC-MSCs分化率可达32％。而不采用胶原蛋白膜为载体的诱导的分化率仅为15.75％。说明采用胶原蛋白膜能够显著提高hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率。

附图说明

图1示光镜下的hUC-MSCs的细胞形态(100×)；

图2示光镜下诱导7天后的细胞形态(100×)。

具体实施方式

本发明提供了一种细胞培养基质及其应用与使用方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，胶原蛋白的制备方法为：

(1)、罗非鱼清洗去鳞取皮，去除附着鱼肉和鳍，获得罗非鱼皮，切成2cm×2cm小块。放入0.1mol/L的NaOH溶液中，料液比1:10(w/v)连续搅拌(80rpm)，水温控制在4℃以下，每隔4h更换一次碱液，重复4次，再用去离子水反复清洗至pH6.5～7。

(2)、将碱处理后的鱼皮放入4％浓度的NaCl溶液中，料液比1:10(w/v)，连续搅拌(80rpm)，水温控制在4℃以下，每隔4h更换一次盐液，重复4次，再用去离子水反复清洗，将NaCl清洗干净。将盐洗后的鱼皮放入无水乙醇浸泡，料液比1:5，4h后，更换无水乙醇，再用去离子水将乙醇反复清洗干净。

(3)、将鱼皮捣碎放入0.5mol/L的乙酸溶液中，料液比1:20(w/v)，搅拌(60rpm)6h后，用40目纱网过滤，去除残渣。取滤液用冷冻高速离心机离心，4℃，8000g，20min。取上清液获得酸溶性分离胶原ASC(acid－solublecollagen)。将ASC胶液加入NaOH，将胶液调pH至5.5，再加入0.3％的胃蛋白酶，在4℃条件下连续搅拌48h，再用NaOH调至pH值6.5，即获得胃蛋白酶水解胶原PSC(pepsine－solublecollagen)，在PSC溶液里加入NaCl至终端浓度为4％，静置4h，然后低温4℃条件下离心10000g，30min，取沉淀的胶原。

(4)、将盐析胶原加入纯水，料液比1:4，搅拌(80rpm)，将胶原重新溶解，装入透析袋中透析，透析袋截留分子量为100KD，透析外液为磷酸盐缓冲液(85％/15MNa₂HPO₄，15％1/15MKH₂PO₄，pH7.5)，在4℃条件下透析3天，每12h换透析外液一次，将经透析纯化的胶液用－60℃冷冻干燥机冻干。制得纯胶原冻干粉。

经高效液相色谱仪检测，本发明采用的胶原蛋白中不含有色氨酸和胱氨酸，甘氨酸的质量分数为33.4％，羟脯氨酸的质量分数为10.03％，羟脯氨酸与脯氨酸之比为0.77，羟脯氨酸含量高于羟赖氨酸含量。

经SDS-PAGE电泳测定，胶原蛋白膜中胶原蛋白的含量为98.47％，所述胶原蛋白的分子量为330.3kDa、263.64kDa、118.47kDa、109.64kDa。其中分子量为330.3kDa的胶原蛋白的质量分数为4.84％；分子量为263.64kDa的胶原蛋白的质量分数为48.37％；分子量为118.47kDa的胶原蛋白的质量分数为35.21％；分子量为109.64kDa的胶原蛋白的质量分数为10.05％；

经FT－IR红外光谱测定胶原蛋白包括[α1]和[α2]肽链组成的三维螺旋结构，α、β螺旋，折叠及由3个氨基酸构成一个氢键闭合的螺旋环，并且未发现混乱结结构，说明胶原结构完整。

经变性温度测定，胶原ASC玻璃转化温度(Tg)为26.80℃，热溶解温度(Tm)为42.98℃；PSC玻璃转化温度(Tg)为28.20℃，热溶解温度(Tm)为42.21℃。

经等电点测定，胶原PSC的等电点在6.8～7.01范围，ASC在6.9～7.03范围。

大鼠Ⅰ型胶原酶联免疫分析结果表明，用酶切除胶原蛋白端肽的酶溶性胶原(PSC)，在大鼠血清Ⅰ型胶原的含量比酸溶性胶原低46.5％。

经电镜扫描，胶原纤维的明暗交替排列，首尾相随，平行排列。胶原分子为右手螺旋，3股肽链为左螺旋，左上角图呈现不同层胶原纤维的排列方向。

胶原蛋白膜的制备方法为：

将60mg～240mg胶原蛋白溶于20mL的醋酸溶液中,搅拌溶解,移入60mm的培养皿中静置于4℃冰箱中至脱除气泡为止。向溶液中加入0.5g/L戊二醛,再置入4℃冰箱中交联24h。将此培养皿放入50℃烘干箱中烘干48h后取出,56g/LNaOH溶液中浸泡30min,取出薄膜,蒸馏水冲洗干净制得胶原蛋白膜。

制备出的胶原蛋白膜色微黄,较透明,柔韧性好,可随意修剪成任何形状。因经过戊二醛的交联,所以强度也有所加强。

胶原蛋白膜在进行细胞培养或诱导分化前需以乙醇浸泡后再以培养基浸泡。具体为：将胶原蛋白膜先泡入乙醇溶液中24h,再以培养液浸泡24h后用于细胞的接种。

脐带间充质干细胞的分离培养方法为：

将脐带(乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性)置于含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS中漂洗2次，加入预冷的75％酒精，浸泡1-2min，期间不停翻动脐带；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用组织剪将脐带剪成2mm左右的小段，每段用眼科剪纵向开，用血管钳去除脐带内三根血管(两条动脉，一条静脉)，同时去除脐带外膜；将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm3大小的组织块，取适量放入直径为10cm的无菌培养皿中，覆盖70％培养皿的底面积。加入LONZA人干细胞无血清培养液(LonzaUltraCULTURE^TM)，5％CO₂、37℃、湿度为95％的CO₂培养箱中培养。第5天～7天半量换培养基，继续培养12天～14天左右全量换液去掉组织块同时收集细胞传代培养，获得hUC-MSCs细胞。

经电镜观察(如图1)，传递3～5代的hUC-MSCs生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。

取第3代对数生长期细胞，细胞分离液消化，流式细胞术检测表面抗原CD105、CD45、CD34、CD31、CD40、CD29、CD44、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析6000～8000个细胞。结果显示，第3代hUC-MSCs高表达CD105、CD44和CD29，低表达或不表达HLA-DR、CD31、CD45、CD40和CD34等标记物，符合干细胞特性。

本发明实施例中用于角膜上皮细胞鉴定的抗体为AE1和AE5，它们都是细胞角蛋白抗体。AE1可以识别相对分子质量分别为56500、50000、48000和40000的酸性细胞角蛋白,能与角膜上皮细胞的一种相对分子质量为48000的酸性角蛋白发生反应,与波形蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白等丝状蛋白无交叉反应。AE5能够与角膜上皮细胞的角蛋白K3(相对分子质量为64000)特异性结合,与人、兔、牛的角膜上皮细胞有反应,而与皮肤上皮细胞无交叉反应。细胞角蛋白K3是分化状态较高的角膜上皮细胞的标志蛋白。因此,如果细胞AE1和AE5的免疫组化染色阳性时,那么这种细胞为角膜上皮细胞。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：

培养液：含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(LonzaUltraCULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素。

选取增殖对数期3-5代hUC-MSC，调整浓度为3×10⁵/ml接种到3g/L胶原蛋白膜上,每组薄膜接种细胞悬液0.5mL,每组设立6个样本。小心将负载细胞的薄膜移至6孔板中。标准环境下孵育,2h后小心加入2mL培养液继续培养。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后收集细胞进行细胞涂片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见较多AE1抗体DAB着色细胞,，呈散在分布，而且细胞着色较淡。AE5抗体淡着色。

实施例2:

培养液：含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(LonzaUltraCULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素。

选取增殖对数期3-5代hUC-MSC，调整浓度为3×10⁵/ml接种到6g/L胶原蛋白膜上,每组薄膜接种细胞悬液0.5mL,每组设立3个样本。小心将负载细胞的薄膜移至6孔板中,5％CO₂、37℃、湿度95％孵育,2h后小心加入2mL培养液继续培养。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后见在细胞集落中爬出上皮样细胞，贴壁生长，增殖迅速，逐渐呈集落式生长。收集细胞进行细胞涂片。经光镜放大100倍检测(图2)，可生长胞体多为扁平，呈多角型或不规则形态生长，表现出典型的上皮细胞形态。按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见较多AE1抗体DAB着色细胞,，呈散在分布，而且细胞着色较深。AE5抗体淡着色。

实施例3:

培养液：含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(LonzaUltraCULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)10ug/ml胰岛素。

选取增殖对数期3-5代hUC-MSC，调整浓度为3×10⁵/ml接种到9g/L胶原蛋白膜上,每组薄膜接种细胞悬液0.5mL,每组设立3个样本。小心将负载细胞的薄膜移至6孔板中,标准环境下孵育,2h后小心加入2mL培养液继续培养。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后收集细胞进行细胞涂片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见大量AE1抗体DAB着色细胞,，而且细胞着色很深。AE5抗体淡着色。

实施例4:

培养液：含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(LonzaUltraCULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素。

选取增殖对数期3-5代hUC-MSC，调整浓度为3×10⁵/ml接种到12g/L胶原蛋白膜上,每组薄膜接种细胞悬液0.5mL,每组设立3个样本。小心将负载细胞的薄膜移至6孔板中,标准环境下孵育,2h后小心加入2mL培养液继续培养。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后收集细胞进行细胞涂片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见较多AE1抗体DAB着色细胞,，而且细胞着色较深。AE5抗体淡着色。

对比例1：

培养液：含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(LonzaUltraCULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素。

选取增殖对数期3-5代hUC-MSC，调整浓度为1.5×10⁵个/孔接种到六孔板中。每孔加入2.5ml培养液继续培养。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后收集细胞进行细胞涂片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见少量AE1抗体DAB着色细胞,，而且细胞着色较淡。AE5抗体淡着色。

实施例5

对实施例1～4及对比例1～2所得细胞经免疫组化检测后，对AE1、AE5染色的细胞进行计数，计算出两组的分化率进行比较。每组取样5次，分别检测后统计数据。

诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％。

统计结果如表1：

表1各组细胞分化率

注：同列肩标不同字母表示具有显著性差异(p<0.01)

实验表明，诱导7天后，脐带间充质干细胞呈分化趋势，细胞呈散在分布，经检测，hUC-MSCs分化为角膜上皮细胞的分化率可达32％；采用本发明提供培养基但不采用胶原蛋白为载体的的对比例中hUC-MSCs的分化率为9.54％。可见，本发明提供的方法能够将hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率提高2倍以上，该效果具有显著性差异(p<0.01)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细胞培养基质，其特征在于，包括胶原蛋白膜和培养液；

所述培养液包括基础培养基、表皮生长因子和胰岛素。

2.根据权利要求1所述的细胞培养基质，其特征在于，所述胶原蛋白膜中胶原蛋白的浓度为3g/L～12g/L。

3.根据权利要求1所述的细胞培养基质，其特征在于，所述胶原蛋白膜中胶原蛋白为I型胶原。

4.根据权利要求1所述的培养基质，其特征在于，所述胶原蛋白膜中胶原蛋白的含量为98.47％，所述胶原蛋白的分子量为330.3kDa、263.64kDa、118.47kDa、109.64kDa。

5.根据权利要求1所述的细胞培养基质，其特征在于，所述表皮生长因子与胰岛素的质量比为(5～25)：(5000～25000)。

6.根据权利要求1所述的培养基质，其特征在于，所述表皮生长因子的含量为5ng/mL～25ng/mL；所述胰岛素的含量为5μg/mL～25μg/mL。

7.根据权利要求1所述的培养基质，其特征在于，所述基础培养基为人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基，所述人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为(50～60):(44～50)。

8.根据权利要求1～7任一项所述的培养基质，其特征在于，还包括青霉素和链霉素。

9.如权利要求1～8任一项所述的培养基质在诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化中的应用。

10.诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，其特征在于，包括：以胶原蛋白膜为载体接种脐带间充质干细胞，经孵育后以培养液诱导；所述培养液包括基础培养基、表皮生长因子和胰岛素。