CN105176912B - 一种培养基及其应用、制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基及其应用、制备方法。该培养基包括角膜上皮细胞培养上清液和角膜基质。本发明提供的培养基明显提高了hUC‑MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的几率。

Description

一种培养基及其应用、制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基及其应用、制备方法。

背景技术

角膜病是一种常见的致盲性眼病，患病率较高，且治疗较困难。目前对角膜性致盲的复明，较为有效的方法是进行同种异体角膜移植，但是角膜移植手术通常由于严重的免疫排斥反应而失败，且适合的供体组织十分短缺。临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘干细胞作为角膜上皮修复的种子细胞取得了良好疗效。角膜缘干细胞同其它干细胞一样具有分化程度低、细胞周期长、高度增殖潜能、自我更新能力和应激增殖等特征，并且研究发现体外培养的角膜缘干细胞可能会失去部分抗原性，有利于临床移植。

尽管大量研究证实角膜缘干细胞可作为种子细胞分化为角膜上皮细胞，但细胞来源的有限性使其应用受到限制。也有研究表明，通过建立角膜上皮细胞系(cornealepithelial cell line)能够长期稳定地为不同研究目的提供所需的细胞，如上皮的增殖、分化、眼科用药的测试、角膜疾病新的治疗方法的开发等等。角膜上皮的研究使人们对角膜的生理、病理特点和角膜疾病有了更深入的了解；但由于分化后的角膜上皮细胞体外生长的生命周期很短，获得的细胞数量少，花费较高，限制了角膜组织的研究和组织工程化角膜的构建。因此如何改进体外培养技术，培养出分裂增殖能力强、能不断分裂生长的角膜上皮细胞，以补充细胞的不断更新，成为获得角膜上皮种子细胞的首要任务。

近年来研究表明，间充质干细胞在体外不同条件诱导下可以定向分化为脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞等，这类细胞相对来源充足、取材方便、易于培养，且免疫原性低，可作为组织工程良好的种子细胞来源。自Mitchell等首次自脐带中成功地分离出脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)并证实其多分化潜能后，对脐带组织来源间充质干细胞的研究引起了广泛关注，越来越多的研究集中到该领域中。从hUC-MSCs被发现至今，中外学者已经进行相当多的研究，其具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等特点吸引了众多的研究者。从脐带中分离提取间充质干细胞的重要意义在于，脐带作为分娩废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法理限制。但是hUC-MSCs在体外能否有效地分化为角膜上皮细胞，仍是学术界的一大研究热点。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种培养基及其应用、制备方法。该培养基明显提高了hUC-MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的几率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种培养基，包括角膜上皮细胞培养上清液和角膜基质。

在本发明中，研究发现角膜上皮细胞培养上清液和角膜基质中含有多种促hUC-MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的细胞因子和有效成分，从而可大大提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的几率。

作为优选，角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液的体积比为1：(10～20)。

优选地，角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液的体积比为1：10。

作为优选，培养基还包括人间充质干细胞完全培养基。

作为优选，人间充质干细胞完全培养基的配方为：80～120U/mL青霉素，80～120U/mL链霉素，45％～75％角朊细胞无血清培养基的培养液，5～25ng/mL表皮生长因子(EGF)，5～25μg/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。

在本发明提供的一些实施例中，人间充质干细胞完全培养基的配方为：100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，45％角朊细胞无血清培养基的培养液，15ng/mL表皮生长因子(EGF)，15μg/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。

作为优选，人间充质干细胞完全培养基与角膜上皮细胞培养上清液混合制得混合培养基，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量至少为25％。

优选地，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量为50％～75％。

更优选地，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量为75％。

本发明还提供了该培养基在诱导人间充质干细胞分化为角膜上皮细胞中的应用。

本发明还提供了该培养基的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：待角膜上皮细胞达80％～90％融合，酶解，获得细胞悬液；

步骤2：取细胞悬液接种，培养，收集角膜上皮细胞培养上清液；

步骤3：取角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液混合，获得培养基。

作为优选，角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液的体积比为1：(10～20)。

优选地，角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液的体积比为1：10。

作为优选，步骤3为将人间充质干细胞完全培养基与角膜上皮细胞培养上清液混合制得混合培养基，取角膜基质与混合培养基混合，获得培养基。

作为优选，人间充质干细胞完全培养基的配方为：80～120U/mL青霉素，80～120U/mL链霉素，体积分数为45％～75％角朊细胞无血清培养基的培养液，5～25ng/mL表皮生长因子(EGF)，5～25μg/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。

在本发明提供的一些实施例中，人间充质干细胞完全培养基的配方为：100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，体积分数为45％角朊细胞无血清培养基的培养液，15ng/mL表皮生长因子(EGF)，15μg/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。

作为优选，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量至少为25％。

优选地，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量为50％～75％。

更优选地，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量为75％。

作为优选，步骤2中培养的时间为24～72h。

优选地，步骤2中培养的时间为48h。

作为优选，步骤2中培养采用的培养基为角膜上皮细胞培养基，其配方为：80～120U/mL青霉素，80～120U/mL链霉素，5％～20％胎牛血清，余量为DMEM/F12培养基。

在本发明提供的一些实施例中，步骤2中培养采用的培养基为角膜上皮细胞培养基，其配方为：100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，10％胎牛血清，余量为DMEM/F12培养基。

本发明提供了一种培养基及其应用、制备方法。该培养基包括角膜上皮细胞培养上清液和角膜基质。本发明至少具有如下优势：

(1)本发明提供的培养基明显提高了hUC-MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的几率。

(2)脐带作为分娩废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法理限制。

(3)hUC-MSCs分离提取操作简单方便、易于培养，且免疫原性低，可作为眼角膜损伤修复的良好种子细胞来源。

附图说明

图1示不同的培养基对hUC-MSCs培养的诱导分化率检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种培养基及其应用、制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的培养基及其应用、制备方法中所用细胞、试剂、仪器等均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1～12培养基的制备

培养基的制备方法如下：

(1)无菌条件下分离提取新西兰大白兔眼角膜上皮细胞，接种于25cm²细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养，48h细胞贴壁后首次换液，以后隔天换液，每天倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。角膜上皮细胞培养基为100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，DMEM/F12培养基，10％胎牛血清。

(2)待(1)中细胞达80％-90％融合时，0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化收集细胞，调整细胞密度为1×10⁹个/L，接种于新的25cm²的培养瓶中，置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养。角膜上皮细胞培养基同步骤(1)。

(3)分别收集(2)中细胞培养特定时间段(见表1)的培养液至离心管，2000rpm/min离心10min，无菌条件下取上清液，经0.22μm滤器过滤，过滤后的上清液经镜检不含角膜上皮细胞。-20℃冰箱保存备用。

(4)将(3)中收集的上清液与人间充质干细胞完全培养基按照不同比例混匀(见表1)，制备混合培养基。其中，人间充质干细胞完全培养基成分包括：100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为45％角朊细胞无血清培养基的培养液，15ng/mL表皮生长因子(EGF)，15μg/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。

(5)无菌条件下摘取兔眼角膜基质约1cm²，将基质片剪成1mm×1mm的组织块。

(6)把上述组织块与(4)中的混合培养基按体积比1：10混合，制备成本发明的培养基。

实施例1～12的培养基制备条件如下表所示：

表1实施例1～12的培养基制备条件

实施例13定向分化试验

定向分化试验操作步骤如下：

(1)hUC-MSCs培养分为对照组和实验组。将消毒好的18mm×18mm盖玻片放入六孔板中，将制备好的密度为5×10⁴个/mL的hUC-MSCs悬液加入六孔板，每孔2mL，置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养，24h首次换液，以后每2d全量换液，倒置相差显微镜下每天观察细胞生长情况。

其中，实验组采用实施例1～12的培养基培养hUC-MSCs；对照组采用人间充质干细胞完全培养基培养hUC-MSCs作为对比例。

(2)细胞培养7d后，取出孔内盖玻片进行免疫荧光检测CK12的表达。具体步骤如下：

固定：吸去培养基，PBS轻轻漂洗3次，加4％多聚甲醛常温下固定15min。

洗涤：吸去多聚甲醛，加PBS后置于脱色摇床上轻轻漂洗，重复3次，5min/次。

透膜：以含0.3％TritonX-100的PBS室温下通透化处理30min。

封闭：以5％兔血清室温下封闭1h。

一抗孵育：加羊抗人CK12(1:150)，4℃孵育过夜。

洗涤：加PBS摇床上漂洗5次，每次5min。

二抗孵育：加兔抗人IgG-FITC，室温下避光孵育30min。

洗涤：加PBS摇床上避光漂洗5次，每次5min。

染核：滴加DAPI工作液1滴于盖玻片上，室温下避光作用20min。

防淬灭：滴加抗荧光淬灭剂于盖玻片上。

封片：将盖玻片细胞面倒扣于载玻片上，周边涂指甲油封片。

保存：4℃避光保存，3d内荧光显微镜下观察拍照。

研究结果表明，对照组和各个实验组均有细胞胞浆见绿色荧光，即CK12表达阳性。但对照组显绿色荧光的细胞数明显少于各实验组。

(3)对染色的细胞进行计数，计算出两组的分化率进行比较，诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％。实验结果见表2、图1：

表2诱导分化率检测结果

注：与对照组相比，**P<0.01，*P<0.05。

诱导分化率统计分析表明，本发明提供的培养基实验组的诱导分化率高于对照组，各实验组与对照组均有显著性差异(p<0.05)。尤其是实施例7(含75％、培养48h上清液的培养基实验组)的诱导分化率明显高于其它各组，与其它各组均有显著性差异(p<0.01)。可见，本发明提供的培养基可有效促进hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的培养基，其特征在于，由角膜上皮细胞培养上清液、角膜基质和人间充质干细胞完全培养基组成；

所述人间充质干细胞完全培养基与所述角膜上皮细胞培养上清液混合制得混合培养基，所述角膜上皮细胞培养上清液在所述混合培养基中的体积百分含量为75％；

所述角膜上皮细胞培养上清液的制备方法为：待角膜上皮细胞达80％～90％融合，酶解，获得细胞悬液；取细胞悬液接种，培养，收集角膜上皮细胞培养上清液；所述培养的时间为48h；所述培养采用的培养基为角膜上皮细胞培养基，其配方为：80～120U/mL青霉素，80～120U/mL链霉素，5％～20％胎牛血清，余量为DMEM/F12培养基；

所述角膜基质与所述角膜上皮细胞培养上清液的体积比为1：10；

所述人间充质干细胞完全培养基的配方为：80～120U/mL青霉素，80～120U/mL链霉素，45％～75％角朊细胞无血清培养基的培养液，5～25ng/mL表皮生长因子，5～25μg/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。

2.如权利要求1所述培养基在诱导人间充质干细胞分化为角膜上皮细胞中的应用。

3.如权利要求1所述培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：待角膜上皮细胞达80％～90％融合，酶解，获得细胞悬液；

步骤2：取所述细胞悬液接种，培养，收集角膜上皮细胞培养上清液；

步骤3：将人间充质干细胞完全培养基与角膜上皮细胞培养上清液混合制得混合培养基，取角膜基质与混合培养基混合，获得培养基。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中培养的时间为48h。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中培养采用的培养基为角膜上皮细胞培养基，其配方为：80～120U/mL青霉素，80～120U/mL链霉素，5％～20％胎牛血清，余量为DMEM/F12培养基。