CN105838672B - 用于眼部的干细胞诱导培养液、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明提供一种用于眼部的干细胞诱导培养液，其包含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)，所述血管内皮细胞生长因子(VEGF)的含量为0.5‑2.5ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量为0.25‑0.4ng/ml，所述表皮生长因子(EGF)的含量为0.5‑2.0ng/ml。本发明采用人眼眶脂肪来源的干细胞(ASCs)体外条件培养液对角膜损伤的再生修复发挥着重要的增强作用。

Description

用于眼部的干细胞诱导培养液、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于眼部的干细胞诱导培养液、其制备方法及其应用。
背景技术
角膜外伤是眼科临床常见疾病，严重时甚至可以致盲。正常的角膜上皮化过程是通过角膜缘上皮基底层干细胞的再生分化完成的。角膜损伤导致角膜上皮缺损，继发的炎症反应会影响干细胞增生和迁移，形成血管翳，加重角膜水肿与瘢痕化，角膜浑浊影响透光，甚至造成角膜溃疡。角膜移植目前仍是临床角膜盲唯一可靠有效的治疗手段。角膜供体一般来源于角膜捐献者，一方面捐献者数量有限，另一方面同种异体角膜移植仍然存在术后免疫反应，甚至出现供体排斥而致手术失败。
干细胞再生医学研究的兴起为角膜损伤的修复提供了新的治疗途径，其基本方法是将体外培养扩增的自体正常组织细胞，例如角膜缘干细胞、结膜上皮细胞、口腔黏膜细胞等，吸附于一种生物相容性良好并可被机体降解吸收的生物支架，植入机体角膜部位，在支架材料逐步降解过程中，细胞继续增殖并分泌基质，最终形成相应组织，达到促进角膜上皮再生，修复角膜缺损并重现视力功能的目的。
脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)是存在于脂肪组织中的一群具有多向分化潜能的成体干细胞，在体外能够自我更新、不断增殖，而且可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞及神经细胞等多种类型的细胞。因具有来源丰富、易于培养、多向分化等特点，ASCs在组织创伤修复领域具有良好的应用前景和科研价值。而ASCs在体外培养过程中，会分泌多种生物活性因子，通过旁分泌机制，促进组织创伤的修复。因此，ASCs的条件培养液也具有广阔的临床应用前景。
眼部整形手术是我国整形外科领域开展最广泛的手术，术中通常会去除部分多余的眼眶脂肪。这种手术切除的眼眶脂肪通常被视为“废物”而丢弃。医学研究认为，在胚胎发育过程中，皮下脂肪与内脏脂肪发生于中胚层。而眼眶脂肪则不同，是与眼周组织(包括角膜、结膜、眼球、眼外肌肉与骨骼)一起从外胚层发育而来的。因此，本发明研究人员通过研究发现，眼眶脂肪来源的ASCs在体外培养分化过程中，其分泌的各种细胞因子和生长因子可能会对角膜上皮细胞的生长和修复起到重要作用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种用于眼部的干细胞诱导培养液，能有效促进角膜损伤的再生修复。
本发明再一目的在于提供该干细胞诱导培养液的制备方法。
本发明还一目的在于提供该干细胞诱导培养液在用于角膜损伤的再生修复中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供一种用于眼部的干细胞诱导培养液，其包含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)，所述血管内皮细胞生长因子(VEGF)的含量为0.5-2.5ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量为0.25-0.4ng/ml，所述表皮生长因子(EGF)的含量为0.5-2.0ng/ml。
其中，优选的为，所述血管内皮细胞生长因子(VEGF)的含量为1.0-2.0ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量为0.3-0.4ng/ml，所述表皮生长因子(EGF)的含量为1.0-2.0ng/ml。
本发明所述用于眼部的干细胞诱导培养液采用将组织细胞进行ASCs分离培养而成。
本发明所述的组织细胞，包括但不限于眼眶脂肪细胞、眼周的其他部位的组织细胞(例如角膜缘干细胞、结膜细胞等)；也不局限于眼眶来源的脂肪细胞，可以是身体其它部位的脂肪细胞，例如腹部，大腿，上肢等。
组织细胞的来源包括人在内的哺乳类动物的组织细胞。
所述用于眼部的干细胞诱导培养液可采用如下方法制备：
1)先将脂肪组织去除血管、筋膜等无用组织后，制成糊状，加入胶原酶消化处理；
2)然后加入培养基进行中和处理，离心；
3)弃去上清液后加入细胞培养液进行培养；
4)再在细胞融合至80～90％时进行消化传代，待第二代细胞生长至融合状态时，采用无血清的低糖DMEM培养液最后培养48小时而成。
为了实现本发明的另一目的，本发明所述用于眼部的干细胞诱导培养液的制备方法，包括如下步骤：
1)先将脂肪组织去除血管、筋膜等无用组织后，制成糊状，加入胶原酶消化处理；
2)然后加入培养基进行中和处理，离心；
3)弃去上清液后加入细胞培养液进行培养；
4)再在细胞融合至80-90％时进行消化传代，待第二代细胞生长至融合状态时，采用无血清的低糖DMEM培养液最后培养48小时而成。
其中，步骤1)中，所述组织细胞可先采用无菌PBS冲洗2-4遍，然后用无菌眼科剪剔除血管、筋膜等组织。
所述胶原酶为I型胶原酶，A型胶原酶或复合型胶原酶，浓度范围为0.05-0.5％，与组织细胞的体积比范围1-2∶1。
所述消化处理采用在37℃恒温摇床中振荡消化1-20h，振荡速率为150-250r/min。
步骤2)中所述培养基为同体积含有10％FBS的低糖DMEM培养基。
所述离心处理的速率为1500-2000r/min，处理时间为5-10min。
步骤3)中所述细胞培养液为含有10％-20％胎牛血清(FBS)或小牛血清(CBS)的低糖DMEM培养基、F12细胞培养液，或低糖DMEM与F12混合培养液(1∶1)，或干细胞专用培养液，无抗生素，培养条件为处于5％CO2中，温度设定为37℃。
培养过程中可采用每3天换液1次。
步骤4)中所述消化传代采用0.25％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)进行消化，传代接种量为以细胞密度5×105/ml接种培养。
本发明采用人眼眶脂肪来源的ASCs体外条件培养液，经研究发现包含多种细胞因子，比如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)，其具有对角膜损伤的再生修复发挥着重要的诱导作用。
本发明用于的干细胞诱导培养液在制备治疗眼角膜损伤或结膜损伤或其他眼表损伤的药物中应用。
经实验验证，可以早期促进角膜上皮层的再生修复，重建正常眼表面，防止了病情进一步恶化。术后5天证实ASCs条件培养液处理组的兔眼角膜表面荧光素染色阳性面积较对照组(正常无血清细胞培养液)明显缩小。术后7天免疫组化测定证实实验组角膜缘血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性蛋白表达也低于对照组，未见新生血管侵入角膜，患眼视力有明显提高。为早期临床治疗角膜损伤提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明碱烧伤后兔角膜实验组与对照组大体变化观察对照图片；
图2为本发明实验组(①)与对照组(②)兔角膜荧光素钠染色对照图；
图3为本发明实验组与对照组兔角膜HE染色(×100)对照图；
图4为本发明实验组与对照组兔角膜VEGF免疫组化染色(×200)对照图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。
实施例1
本实施例利用人眼眶脂肪组织，体外分离培养ASCs，获得本发明的细胞培养液。
然后用氢氧化钠(NaOH)溶液制造了兔角膜化学烧伤模型，以条件培养液作为滴眼液处理兔角膜化学伤，观察对角膜炎症水肿及溃疡的修复治疗效果。
1材料与方法
1.1主要仪器与试剂
胎牛血清(FBS，Gibco公司，美国)，低糖DMEM培养基(HyClone公司，美国)，I型胶原酶(Worthington，美国)，兔抗血管内皮生长因子(VEGF，AbCam，美国)，速眠新II注射液(敦化市圣达动物药品有限公司，吉林)，盐酸丙美卡因滴眼液(Alcon，比利时)，荧光素钠检测试纸(天津晶明新技术开发有限公司)，0.22μm滤器(Merck Millipore，爱尔兰)，裂隙灯显微镜(苏州六六眼科医疗器械有限公司)。
1.2人ASCs培养液的获取
1.2.1脂肪组织来源
所用脂肪组织来自上海市第十人民医院整形外科6例行重睑成形手术的患者，均为健康女性，年龄20～50岁。脂肪获取量平均为1.2-1.5毫升/例。
1.2.2人ASCs的分离培养
本实施例的ASCs分离培养方法如下：将手术切取的脂肪组织用无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冲洗3遍，用无菌眼科剪剔除血管、筋膜等组织后，将脂肪组织剪成糊状，加入同体积0.1％I型胶原酶混合后置于50ml离心管中。放入37℃恒温摇床中振荡(150r/min)消化1h。取出离心管后，加入同体积含有10％FBS的低糖DMEM培养基中和，离心(1500r/min)5min。弃去上清液，加入适量细胞培养液(含有10％FBS的低糖DMEM培养基，无抗生素)，混匀后加入无菌培养皿，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。48小时后首次换液，去除未贴壁细胞，此后每3天换液1次，待细胞融合至80-90％时进行消化传代。在传代中用0.25％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)消化，经吹打、离心后，以细胞密度5×105/ml接种在培养皿内，置于细胞培养箱内培养。
1.2.3人ASCs细胞培养液的制备
原代细胞传至第2代后，每3天半量换液一次，待细胞生长至融合状态时，更换为无血清的低糖DMEM培养液。48小时后收集换液后的培养液，经过直径0.22μm滤器过滤，置于无菌50ml离心管，4℃冰箱保存。培养液一经开启使用，2周内使用完毕。
1.2.4细胞培养液中生长因子的测定
应用酶联免疫分析法(ELISA)测定条件培养液中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)含量。首先用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体。包被单抗的微孔中加入相应抗原，经过结合、洗涤后加入酶标抗抗体，洗涤后用显色剂显色。颜色的深浅和样品中的生长因子含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。并以单纯无血清培养液作为对照。
本实施例人眼眶脂肪组织来源的ASCs体外培养液包含的VEGF、bFGF与EGF的含量均明显高于对照组培养液，浓度分别为(1.457±0.82)ng/ml、(0.254±0.088)ng/ml和(1.085±0.506)ng/ml。而对照组培养液的上述因子浓度接近为0值。
实施例2
本实施例采用氢氧化钠(NaOH)溶液制造兔角膜化学烧伤模型。以实施例1培养液作为滴眼液处理兔角膜化学伤，观察对角膜炎症水肿及溃疡的修复治疗效果。
1兔角膜碱烧伤模型的制备
1.1实验动物健康纯种新西兰大白兔由上海市第十人民医院动物实验中心提供的，4月龄，共6只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg，无眼疾。
1.2制作兔角膜碱烧伤模型
实验兔经全身麻醉后(速眠新1mg/kg肌肉注射)，盐酸丙美卡因滴眼。眼睑撑开器开睑，棉签吸除结膜囊多余液体。将直径10mm形滤纸浸泡于1mol/L的NaOH溶液中1min，用镊子将浸泡后滤纸贴于兔角膜中央表面30秒。取下滤纸后，用50ml生理盐水溶液(0.9％氯化钠)快速冲洗角膜及结膜囊内多余的NaOH。如角膜中央区直径10mm范围内变为白色圆形浑浊区，不可透见虹膜，则为兔角膜碱烧伤造模成功。
1实验动物的分组处理
采用自身对照原则，兔的左眼设为实验组，右眼为对照组。实验组角膜碱烧伤造模后即刻用实施例1的ASCs条件培养液滴眼，每次0.3ml，2次/天，连续7天。
对照组用0.3ml未经培养过细胞的培养液(含有10％FBS的低糖DMEM培养基，无抗生素)滴眼，2次/天，连续7天。
2观察指标
2.1大体观察
术后每天滴药前检查角膜浑浊程度、角巩膜缘新生血管的情况，并拍照记录。
2.2角膜上皮荧光素钠染色
术后5天角膜经荧光素钠染色，在裂隙灯显微镜钴蓝色光照射下照相，比较角膜上皮缺损面积。
2.3角膜组织学检测
术后7天经兔耳缘静脉空气栓塞处死全部实验动物。无菌条件下摘除兔双侧眼球，沿角巩膜缘外1mm剪下角膜和部分球结膜，PBS溶液冲洗后固定于4％多聚甲醛溶液。常规脱水包埋，垂直于角膜切片(5μm)，苏木素-伊红(HE)染色后置于光学显微镜下观察。
2.4免疫组化法检测兔缺损角膜VEGF的表达
免疫组织化学染色采用Power Vision TM二步法免疫组化检测系统。具体方法如下：①切片常规脱蜡至水；②3％H2O2室温浸泡10min，阻断内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，每次5min；③热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，电炉加热至沸腾1.5min。冷却后蒸馏水洗涤2次，每次5min；④滴加1∶500稀释的一抗(兔IgG)，4℃过夜。PBS(pH7.2～7.6)洗涤3次，每次5min；⑤滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，20min，PBS冲洗3次，每次5min；⑥DBA显色：使用DBA显色试剂盒(AR1022)。室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；⑦苏木素轻度复染。梯度酒精脱水，透明，封片。免疫组化染色结果在普通光学显微镜下观察，观察阳性细胞及新生血管情况。
3结果
3.1兔角膜碱烧伤术后大体观察
碱烧伤术后即刻，可见兔角膜中央一圆形白色浑浊区域，不能透见虹膜，局部球结膜充血。术后2天实验组兔角膜表面白色浑浊均匀分散，水肿程度较对照组轻，角膜缘未见长入刷状毛细血管；术后4天实验组兔角膜浑浊程度减轻，可透见瞳孔轮廓，睑结膜和球结膜未见明显充血水肿。对照组术后4天内全角膜浑浊不清，角膜缘出现新生血管，球结膜和结膜穹窿毛细血管充血肿胀。术后6天实验组兔角膜较对照组浑浊范围缩小，角膜透明度增高，瞳孔明显清晰，可见虹膜纹理。对照组兔角膜不透明，角膜缘仍有水肿充血，如图1所示。
3.2兔角膜碱烧伤术后荧光素钠染色
碱烧伤术后5天行兔角膜荧光素钠染色检测。裂隙灯显微镜检查发现实验组的角膜上皮缺损范围局限，荧光素钠染色阳性(黄染区域)的上皮缺损面积明显缩小，边界清楚。对照组可见大范围连续黄色染色区域，边界不清，缺损面积较大，角膜明显水肿，如图2所示。
3.3碱烧伤术后兔角膜HE染色
术后7天兔角膜组织HE染色，镜下可见实验组角膜上皮细胞连续相间，基质层纤维组织排列整齐，未见明显炎症细胞浸润和血管增生，后弹力层和内皮细胞层完整。对照组角膜基质全层松散，纤维组织间隙较大，后弹力层脱离，如图3所示。
3.4碱烧伤术后兔角膜VEGF染色
碱烧伤术后7天兔角膜标本切片后行VEGF免疫组织化学染色。实验组镜下可见角膜中央和角巩膜缘前1/2基质层的新生血管内皮细胞及炎症细胞胞质浅棕黄色染色，VEGF表达轻度阳性；新生血管数量增多且血管管腔增大，周围错杂排列的胶原纤维深至基质层后1/3。对照组可见角巩膜缘前1/2基质层炎症细胞数量增多，胞质染深棕黄色，胶原纤维粗大且排列无序，VEGF阳性表达率明显高于实验组，如图4所示。
4.结论
角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层组织构成。其中，角膜上皮是一种非角化鳞状上皮，厚约50μm～90μm，有4～6层细胞，排列规整。完整的角膜上皮形成隔离外界环境和角膜基质之间的天然屏障。角膜上皮细胞代谢旺盛，细胞更新每天可达到总数的1/7。凋亡细胞通过角膜缘干细胞不断分化增殖予以补充。当角膜损伤波及角膜缘，破坏干细胞达到一定程度，将造成无足够的角膜上皮细胞补充来源，此时周边结膜上皮发生向心性生长、角膜血管化和上皮复发性糜烂，导致持续性上皮缺损、基质新生血管化和无菌溃疡等严重眼角膜疾病。
在研究过程中，发现兔角膜化学碱烧伤导致角膜上皮缺损。本发明采用人眼眶脂肪来源的ASCs体外条件培养液进行临床治疗，结果发现可以早期促进角膜上皮层的再生修复，重建正常眼表面，防止了病情进一步恶化。术后5天证实ASCs培养液处理组的兔眼角膜表面荧光素染色阳性面积较对照组(正常细胞培养液)明显缩小。术后7天免疫组化测定证实实验组角膜缘血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性蛋白表达也低于对照组，未见新生血管侵入角膜，患眼视力有明显提高。从而为早期临床治疗角膜损伤提供了新的思路。
ASCs在体外培养过程中能够分泌多种生长因子，通过旁分泌机制对细胞的分化增殖与创伤修复等具有重要作用。鉴于眼眶脂肪与眼表角膜、结膜等组织都来源于外胚层的发生发育，因此推测眼眶脂肪来源的ASCs分泌的细胞因子可能对角膜损伤的再生修复发挥着重要的诱导作用。实验结果证实细胞条件培养液中的一些细胞因子，例如VEGF、bFGF和EGF含量明显增高，能够增强角膜上皮细胞的增殖、促进角膜损伤的再生修复。因此，相较于单一应用的商品化生产的细胞生长因子，ASCs条件培养液更具有临床应用前景。总之，本实施例为ASCs条件培养液治疗角膜损伤等眼表疾病提供了新的方法与技术，有望将来开发一种新的眼科用药或治疗方法。
本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (4)

1.一种用于眼部角膜上皮细胞的生长和修复的干细胞诱导培养液，其特征在于，其包含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子，所述血管内皮细胞生长因子的含量为1.0-2.0ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的含量为0.3-0.4ng/ml，所述表皮生长因子的含量为1.0-2.0ng/ml；其采用如下方法制备：
1)先将脂肪组织去除血管、筋膜等无用组织后，制成糊状，加入胶原酶消化处理，所述胶原酶为I型胶原酶，A型胶原酶或复合型胶原酶，浓度范围为0.05-0.5％，与组织细胞的体积比范围1-2∶1；所述组织细胞为眼眶脂肪细胞；组织细胞的来源包括人在内的哺乳类动物的组织细胞；
2)然后加入培养基进行中和处理，离心；
3)弃去上清液后加入含有10％FBS的低糖DMEM培养基的细胞培养液进行培养；
4)再在细胞融合至80-90％时进行消化传代，待第二代细胞生长至融合状态时，采用无血清的低糖DMEM培养液最后培养48小时而成。
2.制备权利要求1所述的用于眼部角膜上皮细胞的生长和修复的干细胞诱导培养液的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)先将脂肪组织去除血管、筋膜等无用组织后，制成糊状，加入胶原酶消化处理，所述胶原酶为I型胶原酶，A型胶原酶或复合型胶原酶，浓度范围为0.05-0.5％，与组织细胞的体积比范围1-2∶1；所述组织细胞为眼眶脂肪细胞；组织细胞的来源包括人在内的哺乳类动物的组织细胞；
2)然后加入培养基进行中和处理，离心；
3)弃去上清液后加入含有10％FBS的低糖DMEM培养基的细胞培养液进行培养；
4)再在细胞融合至80-90％时进行消化传代，待第二代细胞生长至融合状态时，采用无血清的低糖DMEM培养液最后培养48小时而成。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述脂肪组织先用无菌磷酸盐缓冲液冲洗2-4遍，再去除血管、筋膜等无用组织。
4.权利要求1所述干细胞诱导培养液在制备治疗眼角膜损伤的药物中应用。
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