CN101503672A - 一种细胞因子的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞因子的组合物。本发明还涉及该细胞因子组合物的医药用途。本发明提供的一种细胞因子的组合物是干细胞培养液。本发明的优点在于：与目前流行的各种重组细胞因子制剂相比，细胞因子种类更加丰富，细胞因子活性更加接近天然状态，是一种具有巨大开发潜力的生物制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞因子的组合物。本发明还涉及该细胞因子组合物的医药用途。
背景技术
胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，主要来自囊胚期的内细胞团。目前，已经建立了多株人类以及哺乳动物的胚胎干细胞系，并且公众可以获得这些干细胞系，例如美国政府资助在威斯康辛大学建立了国家级的干细胞库，储存有NIH注册的21株人胚胎干细胞，可以为科研工作者和非盈利性机构提供良好的人胚胎干细胞系(http://www.wicell.org/index.php？option＝com oscommerce&Itemid＝130)。而胚胎干细胞的常规培养也具有一套公知的操作流程，在许多知名的干细胞中心如威斯康辛干细胞库的网站上都有相应的操作手册对外提供(http://www.wicell.org/index.php？option＝com content&task＝section&id＝9&Itemid＝200)。
研究发现胚胎干细胞在生长过程中能产生许多丰富的细胞生长因子，包括血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，这些细胞因子参与了创伤愈合的过程。有关生长因子在创伤修复过程中的模式有人提出几点设想[1]：①蛋白生长因子应该直接调节正常创伤修复的许多关键步骤，包括炎性细胞趋向性迁移，成纤维细胞、角化细胞和血管内皮细胞的分裂增殖，新生血管的形成，细胞间质成分的合成和降解。②创伤愈合的周围环境应该含有蛋白生长因子，在释放全过程中含量应该变化，生长因子的作用受到抑制时，创伤修复则遇到障碍。③慢性创伤的周围环境含有较低的生长因子活性。④生长因子应该促进慢性创伤的愈合。
PDGF是在寻求血清中促细胞增值因子的过程中被发现的(Ross et al.，1974)[2].，包括PDGFA和PDGFB两种异构体，作用包括促增值，存活，迁移，细胞外基质的沉积，组织重构。血管的发生靠内皮细胞的发芽、分支、削枝来实现的。收缩间充质细胞包绕这些原始的血管。两种主要的血管外细胞是血管平滑肌细胞和血管外膜细胞。他们分泌抑制因子抑制内皮细胞的过度增殖。在PDGFB/PDGFBR基因敲除的小鼠常在出生前死于血管包被不全的出血。血管内皮细胞分泌PDGFB；血管平滑肌、血管外膜细胞表达PDGFBR，PDGFB诱导血管平滑肌、血管外膜细胞迁移到新生的血管外。从而促进血管的正常发育。
VEGF家族因子的显著特征是对于内皮细胞的专一性。VEGF不是一种蛋白，而是由许多由不同长度和氨基酸种类的多肽构成的混合物。1983年被作为血管通透性因子而被发现[3]。VEGF被看为是一种血管发生的动态调节因子。Kirchner等[4]报道局部运用VEGF能缩短糖尿病小鼠溃疡愈合的时间将近50％。Galeano等[5]也指出运用VEGF基因治疗对与糖尿病引起的创伤愈合障碍是一种很有前途的方法。
表皮生长因子(EGF)是Cohen在研究神经生长因子的过程中发现的，研究发现人的EGF同小鼠EGF一样能促进各种组织来源的上皮细胞的增殖活性。表皮生长因子家族主要包括下列成员：EGF、TGF-α、HB-EGF、amphiregulin双调蛋白，epiregulin，betacellulin，neuregulins、epigen，其主要与四种受体结合，EGFR/ErbB1，HER2/ErbB2，HER3/ErbB3，和HER4/ErbB4，所有的EGFR合成后都以膜锚定的方式固定在膜表面，在蛋白酶的作用下酶解为活性方式[6]。有趣的是酶解后，跨膜结构域仍能刺激临近细胞的生长，说明无论是跨膜结构域还是可溶性的形式在创伤愈合过程中都发挥着作用。
FGF家族目前认为由22个成员构成[7]。FGF的特征在于其能与肝素以及肝素类结合，增加其对热以及蛋白酶的稳定性，同时对于其发挥受体激活的活性也是必须的。FGF主要作为多种细胞的有丝分裂原活性，同时也能调节某些细胞的迁移和分化，在某些极端情况下还能支持细胞存活的活性[8]-[9]。按等电点不同分为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。bFGF的生物学活性远大于aFGF。bFGF是动物和人体组织中存在的一种微量蛋白，对多种中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛生物学活性，是一种多功能细胞因子[10]。bFGF可趋化血管内膜的各类细胞，并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂、胶原酶和蛋白水解酶等；这些酶类通过促使血管基底膜降解和刺激内膜各类细胞增殖与迁移，诱导血管内皮细胞长入胶原基质中形成管腔并促进神经元及新生血管共同生长[11]。
方培耀等[12]研究发现，创面愈合延迟与生长因子及其受体低表达有一定的关系。
目前，大多数细胞因子的产品采用基因工程的方法制备[15]-[18]，因子成分种类单一。
发明内容
本发明提供的一种细胞因子的组合物是干细胞培养液。
本发明人通过研究发现，干细胞在培养过程中，能分泌各种细胞因子，这些细胞因子进入到培养液中。以往培养胚胎干细胞后的培养基被丢弃，本研究所创造性的对胚胎干细胞在生长过程中释放的细胞因子加以利用，变废为宝，节约了资源，为细胞因子用于临床治疗提供了一种具有巨大开发潜能的药物。
根据本发明的实施例，收集到干细胞培养液中细胞因子PDGF、VEGF、EGF、bFGF平均含量依次为207.4±88.7pg/ml、206.2±9.6pg/ml、245.9±78.4pg/ml、33.6±5.3pg/ml。
上述细胞因子组合物的制备方法是：每24小时收集一次胚胎干细胞培养液，并观察胚胎干细胞培养状态，收集6天。将每天收集的培养液混合即可。收集到的细胞因子组合物最好于—80℃下储存。
本发明还提供了该细胞因子的组合物的医药用途，即用于制备促进创伤愈合的药物。
根据本发明的实施例，上述获得的细胞因子组合物，可以用于制备促进创伤愈合的药物。
药物理想的剂型为喷雾剂。
本发明的优点在于：与目前流行的各种重组细胞因子制剂相比，细胞因子种类更加丰富，细胞因子活性更加接近天然状态，是一种具有巨大开发潜力的生物制剂。
具体实施方式
实施例
1.Feeder细胞的准备：
病原学检测合格的人成纤维细胞经过丝裂霉素C处理后以3×104/cm2密度接种6孔板，37℃、5％CO2培养，24小时-72小时后用于接种ES细胞。培养液使用D/F-12培养基。成纤维细胞株按通用的方法获得。
2.ES细胞的培养：
病原学检测合格的ES细胞采用按文献19—21中公开的方法获得人胚胎干细胞株，以40-60clone/孔的密度接种在Feeder上，37℃、5％CO2培养，每7天传代一次，每隔24小时换液一次，收集每天的培养液，储存于4℃，最后将收集的液体混合，储存于—80℃。
3.培养液细胞因子含量的检测与储存
将6天收集的液体混合，作为一个批号的产品，取混合液0.5ml，用ELISA试剂盒检测生长因子的含量，其余收集的液体经过0.25μm滤器过滤后分装，并储存于4℃冰箱保存。
稳定性检测结果发现：30天后，在-20℃、4℃、和25℃细胞因子的平均含量分别为：PDGF，191.4±35.1pg/ml、160.9±23.0pg/ml、149.2±41.4pg/ml；VEGF，146.1±43.5pg/ml、116.3±20.2pg/ml、112.5±29.6pg/ml；EGF，226.2±37.7pg/ml、169.9±63.4pg/ml、161.1±29.5pg/ml；bFGF，37.0±16.9pg/ml、27.4±7.0pg/ml、23.9±6.7pg/ml；提示在-20℃条件下细胞因子的稳定性最好，当储存温度提高时，因子含量逐渐降低的趋势，但经过统计学分析，P>0.05，故认为在30天内，细胞因子的含量不受储存条件的影响。
为观察胚胎干细胞分泌的这些生长因子对于创伤愈合的影响，在20只家兔背部制作两排直径1.5cm的圆形创面(左、右各3个创面)，左侧使用冰冻干燥法浓缩干燥的胚胎干细胞培养液粉末(内含氨苄青霉素粉末)治疗，右侧使用氨苄青霉素粉末治疗作为对照，对两组创口愈合的时间进行t检验，结果发现，胚胎干细胞培养液浓缩粉末治疗组平均愈合天数为12天，氨苄青霉素粉末对照组为14天，两组比较t<0.05，有统计学差异，胚胎干细胞培养液浓缩粉末能加速创伤的愈合。
参考文献：
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Claims (4)
1、一种细胞因子的组合物是干细胞培养液，其中含有细胞因子PDGF、VEGF、EGF、bFGF。
2、根据权利要求1所述的细胞因子组合物，其特征在于干细胞培养液中细胞因子PDGF、VEGF、EGF、bFGF平均含量依次为207.4±88.7pg/ml、206.2±9.6pg/ml、245.9±78.4pg/ml、33.6±5.3pg/ml。
3、根据权利要求1或2所述的细胞因子组合物，其特征在于所说的培养液是接种后6天内的培养液。
4、权利要求1至3之一所述的细胞因子组合物用于制备促进创伤愈合的药物。
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