CN114107173A - 一种血管化胰岛微器官及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血管化胰岛微器官及其构建方法。该血管化胰岛微器官由MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞共培养而成，其为球状细胞团，且边缘有微管组织，能够生成调节胰腺β细胞增殖和功能性血管生成因子。该血管化胰岛微器官能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养和微器官构建技术领域，具体涉及一种血管化胰岛微器官及其构建方法。
背景技术
糖尿病是由遗传因素和环境因素长期共同作用导致的一种慢性、全身性代谢疾病。糖尿病是目前威胁中国人民以及全世界人民健康的重要慢性杀手之一，大部分患者从患病初期就饱受病痛折磨，并且最终会因糖尿病并发症失去生命。近年来，胰岛移植作为新兴的糖尿病治疗方法取得了一定的成功。目前对于1型糖尿病以及2型糖尿病胰岛功能衰竭的理想治疗方案只有胰岛移植。但供体胰岛的严重不足极大限制了这种方法的普及。如何打破供体的局限，获得可用于移植的功能性胰岛β细胞，一直是糖尿病治疗领域的巨大挑战。近年来，研究者们发现了胰岛类器官可能模拟胰岛分泌胰岛素这一重要功能来治疗糖尿病。胰岛类器官可通过诱导干细胞或者共培养胰腺中多种细胞得到的具有胰岛功能的器官样结构，它更接近动物及人体的分子细胞环境，在体外培养后，可以移植到人体内，起到治疗作用。
Ⅰ型糖尿病约占儿童期各型糖尿病总数的90％，是危害儿童健康的重大儿科内分泌疾病，我国近年发病率为2/10万～5/10万，5岁以下儿童发病率年平均增速5％～34％，发病呈现低龄化趋势。我们希望再生医学与免疫屏蔽相结合，通过用实验室产生的人类胰岛样细胞簇替代受损细胞，这些细胞簇可以按需产生正常量的胰岛素，从而在领域内产生真正的改变。
目前在胰岛类器官培育中还存在的一个关键问题就是尚无法建立完善的血管网络，移植后因胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足，严重影响长期疗效。人胰岛中存在十分丰富的血管网络，它们是胰岛氧气和营养物质运输、血糖感知、激素分泌的重要途径，是胰岛调控血糖稳态的关键。另外，目前的胰岛类器官虽然在体外具备糖刺激的胰岛素分泌能力，但是其响应机制尚不成熟，在移植后建立完善的血运后，才逐渐继续成熟，具备完善的血糖响应机制。
因此，目前存在的问题是亟需研究开发一种能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制的新型胰岛类器官及其构建方法。
发明内容
本发明的目的在于为解决现有技术中存在的缺陷，提供一种血管化胰岛微器官及其构建方法。该血管化胰岛微器官能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制。
为此，本发明第一方面提供了一种血管化胰岛微器官，其由MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞共培养而成，其为球状细胞团，且边缘有微管组织，能够生成调节胰腺β细胞增殖和功能性血管生成因子。
本发明第二方面提供了一种用于培养血管化胰岛微器官的凝胶组合物，其由Collagen I、基质凝胶和DMEM(high glucose)混合而成。
在本发明的一些实施例中，在所述凝胶组合物中，Collagen I与基质凝胶和DMEM(high glucose)的质量比为(1-2.5):(1-2.5):(2-5)。
本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述的血管化胰岛微器官的培养方法，其包括：
步骤A，在低温下配制凝胶组合物，并将其转移到孔板中，孵育，获得基质凝胶床；
步骤B，分别独立地培养MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞，直至达到目标细胞覆盖度，分别获得各细胞的初级培养物；
步骤C，分别独立地对各细胞的初级培养物进行消化处理，直至达到目标分离度标，获得各细胞消化后的初级培养物；
步骤D，分别独立地用经预冷的中和剂处理各细胞消化后的初级培养物以中和胰酶，收集细胞悬液，离心处理，除去上清液，将所获得的沉淀重悬于DMEM中，离心处理，除去上清液，分别获得各细胞的单细胞沉淀；
步骤E，分别独立地将各细胞的单细胞沉淀重悬于DMEM中，并进行细胞计数；
步骤F，混合MIN6单细胞、MS1单细胞和MSCs单细胞，获得细胞混合物；
步骤G，对细胞混合物进行离心处理，并去除上清液，获得细胞悬浮液；
步骤H，将细胞悬浮液接种到基质凝胶床上，孵育，并观察细胞形成3D结构，孵育完成后获得血管化胰岛微器官；
其中，所述凝胶组合物为本发明第二方面所述的凝胶组合物。
根据本发明方法，在步骤F中，所述细胞混合物中MIN6单细胞与MS1单细胞和MSCs单细胞的细胞个数比为10:(5-7):(2-3)。
在本发明的一些实施例中，在步骤A中，所述低温为0-8℃，优选为0-4℃。
本发明中，所述凝胶组合物中Collagen I的pH值为7.4。
在本发明的一些实施例中，在步骤D中，所述预冷的温度为0-8℃，优选为0-4℃。
在本发明的另一些实施例中，在步骤B中，所述目标细胞覆盖度为细胞覆盖度≥80％-90％。
在本发明的又一些实施例中，在步骤C中，所述目标分离度为90％。
根据本发明，在步骤D和G中，所述离心处理的温度4℃，所述离心处理的时间为5分钟。
在本发明的一些实施例中，在步骤H中，在所述孵育温度为37℃。
在胰岛微器官的构建过程中，我们以供能核心血管内皮细胞的研究为主，通过加入血管内皮细胞，间充质干细胞与胰岛细胞共培养，细胞间相互作用，产生胰岛细胞生长所需的细胞因子，促进胰岛微器官血管系统的生长。与现有技术相比，本发明的优点如下：
(1)小鼠血管内皮细胞和人间充质干细胞产生多种细胞因子，如调节胰腺β细胞增殖和功能的血管生成因子。不需要额外添加其他细胞因子。
(2)有了内皮细胞的加入，为胰岛类器官提供了血管供能支撑，使血糖供能模型更加完善。
(3)在本实验中减少了基质胶的比例，通过加入Collagen I，替代部分基质胶，节约了试验成本。
附图说明
下面将结合附图对本发明做进一步的阐述。
图1示出本发明中胰岛微器官培养过程中细胞的1-4天逐渐由平面聚集成球的过程(延时成像)。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ、术语
本文所述用语“约”，“大约”，“基本上”和“主要”，当与元件，浓度，温度或其它物理或化学性质或特性的范围结合使用时，覆盖可能存在于属性或特性的范围的上限和/或下限中的变化，包括例如由舍入，测量方法或其他统计变化导致的变化。例如本文所述，与量，重量等相关的数值，被定义的“约”是每个特定值的所有数值加或减1％。例如，用语“约10％”应理解为“9％至11％”。
本发明中所述用语“细胞覆盖度”与“细胞融合度”可以互换使用。
Ⅱ、实施方案
如前所述，目前在胰岛类器官培育中还存在的一个关键问题就是尚无法建立完善的血管网络，移植后因胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足，严重影响长期疗效。人胰岛中存在十分丰富的血管网络，它们是胰岛氧气和营养物质运输、血糖感知、激素分泌的重要途径，是胰岛调控血糖稳态的关键。另外，目前的胰岛类器官虽然在体外具备糖刺激的胰岛素分泌能力，但是其响应机制尚不成熟，在移植后建立完善的血运后，才逐渐继续成熟，具备完善的血糖响应机制。鉴于此，本发明人对于胰岛微器官及其构建方法进行了大量的研究。
本发明人基于良好的血管化对于胰岛类器官移植未来临床治疗严重糖尿病的重要意义，利用先进的胰岛类器官评估技术，全面评估血管化胰岛类器官的生物医学功能和临床转化前景；在胰岛类器官的构建过程中，以供能核心血管内皮细胞的研究为主，通过改变血管内皮细胞的代谢模式，促进胰岛微器官的生长。基于此，本发明人进一步研究发现，采用由Collagen I、基质凝胶和DMEM(high glucose)组合而成的凝胶组合物制成基质凝胶床，并在其上对MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞混合孵育，能够获得一种新型的血管化胰岛微器官，该胰岛微器官能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制。
为实现本发明，本发明首先提供了一种用于培养血管化胰岛微器官的凝胶组合物，其由Collagen I、基质凝胶和DMEM(high glucose)混合而成。
优选地，在所述凝胶组合物中，Collagen I与基质凝胶和DMEM(high glucose)的质量比为(1-2.5):(1-2.5):(2-5)，优选为2.5:2.5:5。
本发明还提供了一种血管化胰岛微器官的培养方法，其包括：
步骤A，在冰上(0-8℃，优选为0-4℃，更优选为4℃)混合配制凝胶组合物，并将其转移到96孔板中，每孔100μL，在37℃下用5％CO2孵育该96孔板至少30分钟，获得基质凝胶床；
步骤B，分别独立地在T75培养瓶中培养MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞，直至细胞覆盖度≥80％-90％，取出培养基，分别获得各细胞的初级培养物；
步骤C，分别独立地向含初级培养物的T75培养瓶中加入PBS，轻柔地清洗后吸出PBS，再加入trypsin-EDTA，将细胞胰酶混合物在37℃的CO2培养箱中培养，分别独立地对各细胞的初级培养物进行消化处理，直至分离度≥90％(大约2至6分钟))，获得各细胞消化后的初级培养物；
步骤D，分别独立地向各细胞消化后的初级培养物中加入在0-8℃，优选为0-4℃，更优选为4℃下提前预冷的中和剂以中和胰酶，将所获得的细胞悬液收集到离心管中，4℃下离心处理5分钟，除去上清液，将所获得的沉淀重悬于DMEM中，4℃下离心处理5分钟，除去上清液，分别获得各细胞的单细胞沉淀；
步骤E，分别独立地将各细胞的单细胞沉淀重悬于DMEM中，并进行细胞计数；
步骤F，混合MIN6单细胞、MS1单细胞和MSCs单细胞，获得细胞混合物；
步骤G，在4℃下对细胞混合物进行离心处理5分钟，并去除上清液，获得细胞悬浮液；
步骤H，将细胞悬浮液接种到基质凝胶床上，孵育，并观察细胞形成3D结构，孵育完成后获得血管化胰岛微器官。
本发明人研究发现，采用由Collagen I(I型胶原蛋白，High Concentration,RatTail)、基质凝胶和DMEM(high glucose)组合而成的凝胶组合物的制成基质凝胶床，有利于有效地对MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞共培养，获得血管化胰岛微器官。
本发明中所述基质凝胶(Corning Matrigel matrix)是一种从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜制剂。EHS是一种富含细胞外基质蛋白的肿瘤，包括层粘胶蛋白(主要成分)、IV型胶原、硫酸肝素蛋白聚糖、entactin/nidogen和一些生长因子。
本发明中所述DMEM(dulbecco's modified eagle medium)是指高糖(低于4500mg/L)DMEM培养基，其特点主要包括：(1)氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；(2)维生素含量为依格尔培养基的4倍；(3)含有糖酵解途径中的重要物质—丙酮酸；(4)含有微量的铁离子。
优选地，在所述凝胶组合物中，Collagen I与基质凝胶和DMEM(high glucose)的质量比为(1-2.5):(1-2.5):(2-5)，优选为2.5:2.5:5。
进一步优选地，所述凝胶组合物中Collagen I的pH值由1M NaOH调节至7.4。
本发明中，所述中和剂由DMEM(high glucose)和FBS培养基(新西兰胎牛血清)以体积比为9:1混合配制而成，例如，450毫升的DMEM(high glucose)里加入50毫升的FBS(新西兰胎牛血清)混合配制，获得中和剂。
在本发明的一些具体的实施例中，所述中和剂与胰酶的体积比为(5-10):1。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述步骤H包括：
(1)将细胞悬浮液接种到基质凝胶床上，在37℃下孵育；
(2)在孵育30分钟后，24小时内，以GX53奥林巴斯倒置光学显微镜观察细胞形成3D结构；
(3)孵育24小时后，在GX53奥林巴斯倒置光学显微镜下观察24小时后的细胞，获得血管化胰岛微器官。
上述MIN6细胞为小鼠胰岛瘤细胞，其外形为球形岛状；MS1细胞为胰内皮细胞(小鼠MS1传代细胞)，其为菱形细胞；MSCs细胞为人间充质干细胞，其为长条菱形细胞。研究发现，将MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞共培养，会形成一种球状细胞团，且边缘有微管组织，能够生成调节胰腺β细胞增殖和功能性血管生成因子，本发明中称为血管化胰岛微器官。本发明中所述微器官因为加入了血管内皮细胞与器官更为接近，研究结果表明，该胰岛微器官能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制。
在本发明的一些优选的实施例中，在步骤F中，所述细胞混合物中MIN6单细胞与MS1单细胞和MSCs单细胞的细胞个数比为10:(5-7):(2-3)，优选为10:7:2。
实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
材料
Matrigel matrix基质胶(Corning,cat.no.356234)；
Collagen I,High Concentration,Rat Tail,100mg胶原蛋白(Corning,cat.no.354249)；
DMEM,high glucose高糖DMEM培养基(Thermo,cat.no.11965125)；
MIN6 cells小鼠胰岛瘤细胞；MS1细胞；Human MSCs人间充质干细胞；
1×phosphate-buffered saline(PBS),calcium and magnesium free(-)磷酸盐缓冲液(Thermo,cat.no.10010031)；
Fetal Bovine Serum,qualified,Australia澳大利亚胎牛血清(Thermo,cat.no.25200072)；
Trypsin-EDTA胰酶(Thermo,cat.no.25200072)。
实施例1：
(1)使用pH7.4的Collagen I与基质凝胶以及DMEM(high glucose)以2.5:2.5:5的比例在冰上混合，将每孔100μL的混合物转移到96孔板中，并在37℃下用5％CO2孵育该板至少30分钟，获得基质凝胶床。
(2)T75培养瓶培养MIN6细胞/MS1细胞/Human MSCs细胞，培养至80-90％融合度，取出培养基，然后加入5ml PBS。轻柔地清洗后吸出PBS，加入2毫升trypsin-EDTA。将细胞胰酶混合物在37℃的CO2培养箱中培养，直到细胞分离度>90％(2至6分钟)。
(3)细胞(离壁)分离后，用提前预冷的10mL DMEM+10％FBS培养基中和胰酶，将细胞悬液收集到15毫升离心管中。
(4)在150×g(150倍重力加速度)，4℃下离心试管5分钟。除去上清液，并将沉淀重悬于DMEM中，150×g，4℃下离心试管5分钟。
(5)除去上清液，并将沉淀重悬于DMEM中，并进行细胞计数。
(6)为了产生一个3D组织，在15毫升离心管中混合MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞，以10:7:2的比例。
(7)将混合物在100×g，4℃下离心5分钟，并小心地尽可能多地去除上清液，使剩余体积小于20μL。用100μL DMEM重悬细胞。
(8)将细胞悬浮液接种到基质凝胶床上，并在37℃孵育30分钟。
(9)继续如步骤8中那样孵育，以观察细胞形成3D结构。在12小时内，细胞开始显著移动并形成3D组织(见图1)。
(10)在立体显微镜下观察24小时后的细胞，最终获得血管化胰岛微器官。
每隔一天换一次培养基。培养4天后观察；结果表明：冷凝物形成大的三维组织(
图1)。所有的培养基都应该沿着盘子的壁慢慢地、轻轻地加入。注意细胞不要从培养皿上脱落。
研究结果表明，该胰岛微器官能够建立完善的血管网络，移植后不会出现胰岛类器官缺氧和营养物质供给不足的情况，且在移植后具备完善的血糖响应机制
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种血管化胰岛微器官，其由MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞共培养而成，其为球状细胞团，且边缘有微管组织，能够生成调节胰腺β细胞增殖和功能性血管生成因子。
2.一种用于培养血管化胰岛微器官的凝胶组合物，其由Collagen I、基质凝胶和DMEM(high glucose)混合而成。
3.根据权利要求2所述的凝胶组合物，其特征在于，在所述凝胶组合物中，Collagen I与基质凝胶和DMEM(high glucose)的质量比为(1-2.5):(1-2.5):(2-5)。
4.一种如权利要求1所述的血管化胰岛微器官的培养方法，其包括：
步骤A，在低温下配制凝胶组合物，并将其转移到孔板中，孵育，获得基质凝胶床；
步骤B，分别独立地培养MIN6细胞、MS1细胞和MSCs细胞，直至达到目标细胞覆盖度，分别获得各细胞的初级培养物；
步骤C，分别独立地对各细胞的初级培养物进行消化处理，直至达到目标分离度标，获得各细胞消化后的初级培养物；
步骤D，分别独立地用经预冷的中和剂处理各细胞消化后的初级培养物以中和胰酶，收集细胞悬液，离心处理，除去上清液，将所获得的沉淀重悬于DMEM中，离心处理，除去上清液，分别获得各细胞的单细胞沉淀；
步骤E，分别独立地将各细胞的单细胞沉淀重悬于DMEM中，并进行细胞计数；
步骤F，混合MIN6单细胞、MS1单细胞和MSCs单细胞，获得细胞混合物；
步骤G，对细胞混合物进行离心处理，并去除上清液，获得细胞悬浮液；
步骤H，将细胞悬浮液接种到基质凝胶床上，孵育，并观察细胞形成3D结构，孵育完成后获得血管化胰岛微器官；
其中，所述凝胶组合物为权利要求1或2所述的凝胶组合物。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，在步骤F中，所述细胞混合物中MIN6单细胞与MS1单细胞和MSCs单细胞的细胞个数比为10:(5-7):(2-3)。
6.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，在步骤A中，所述低温为0-8℃，优选为0-4℃；和/或，所述凝胶组合物中Collagen I的pH值为7.4。
7.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，在步骤D中，所述预冷的温度为0-8℃，优选为0-4℃。
8.根据权利要求4-7中任意一项所述的培养方法，其特征在于，在步骤B中，所述目标细胞覆盖度为细胞覆盖度≥80％-90％；和/或，在步骤C中，所述目标分离度为90％。
9.根据权利要求4-7中任意一项所述的培养方法，其特征在于，在步骤D和G中，所述离心处理的温度4℃，所述离心处理的时间为5分钟。
10.根据权利要求4-7中任意一项所述的培养方法，其特征在于，在步骤H中，在所述孵育温度为37℃。
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