CN113730372B

CN113730372B - 一种神经干细胞磷脂膜微囊及其制备方法

Info

Publication number: CN113730372B
Application number: CN202111202001.0A
Authority: CN
Inventors: 徐瑞; 段春梅; 何胜荣; 杨清武; 陈晓燕; 刘舒
Original assignee: Second Affiliated Hospital Army Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital Army Medical University
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-10-15
Also published as: CN113730372A

Abstract

本发明公开了一种神经干细胞磷脂膜微囊及其制备方法，该磷脂膜微囊主要由神经干细胞、海藻酸钠、磷脂酰胆碱和多聚赖氨酸制备而得；该磷脂膜微囊是在传统的海藻酸盐‑聚赖氨酸类微囊中引入在脑组织中广泛存在的磷脂，从而构建与脑组织的生物相容性及整合性极好的组织工程微囊；该神经干细胞磷脂膜微囊，经动物实验证实可以运用于脑组织损伤后的神经修复、降低致残率。

Description

一种神经干细胞磷脂膜微囊及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种神经干细胞磷脂膜微囊及其制备方法或一种磷脂膜微囊化的神经干细胞。

背景技术

脑组织损伤后高致残率的病理生理基础是脑组织神经元坏死，因此脑组织损伤后的神经修复是关键。遗憾的是当前尚无有效的方法促进神经修复，临床治疗的主要方法是针对神经功能缺损症状进行对症的物理康复训练。在前沿基础研究领域，虽有文献报道通过调控基因表达等手段促进修复，但离临床运用还有较远的距离。相较而言，干细胞移植疗法则显得切实可行，为脑组织损伤后神经修复带来了一丝曙光。

机体自身的神经干细胞可以在病理条件下激活，并增殖、分化促进组织再生。但自身神经干细胞的数量有限，且干细胞从干细胞巢向病灶迁移并发挥作用受很多因素影响，导致自身神经干细胞最终发挥的修复作用极其有限，故近年来兴起通过移植外源性的干细胞用于脑组织损伤后的修复。不过随着研究的深入却发现，大部分移植的干细胞因病灶局部并无适宜生存的微环境而死亡，进而不能有效的发挥作用。

针对以上问题，促进移植后的神经干细胞在病灶局部存活，是干细胞下一步增殖、分化以及与病损组织整合的基础，也是干细胞移植疗法取得良好神经修复效果所需要解决的关键问题之一。

组织工程的出现和发展为干细胞的移植提供了载体，较单纯的干细胞移植极大的改善了细胞存活、增殖及分化的效率。其中，近年来提出的细胞微囊化，因可以为细胞提供良好的生存分化的环境而备受关注。因此，以组织工程微囊为载体移植神经干细胞有望解决移植后细胞在病灶局部的存活难题，从而促进脑组织损伤后神经修复，降低致残率，改善患者生活质量，减轻社会的经济负担。

现有报道中，研究的最为广泛也最为成熟的组织工程微囊是海藻酸盐-聚赖氨酸类微囊，其应用研究领域涉及胰岛替代、肝脏修复、镇痛等多种器官及多种用途。但在脑组织修复及功能替代领域中单纯的海藻酸盐-聚赖氨酸类微囊的应用极其有限，更不适用于脑梗死等疾病的神经修复：一方面，是由于海藻酸盐、聚赖氨酸分别是从褐藻、放线菌中提取，与人体的组织成分差异较大导致生物相容性欠佳，可能引起炎症反应、组织纤维化等，进而影响神经元功能。在病理条件(如脑梗死)诱发的炎症反应基础上，移植单纯的海藻酸盐-聚赖氨酸类微囊则更容易引起异物反应；另一方面，单纯的海藻酸盐类的微囊稳定性较好，用以长期保护囊内的细胞(如胰岛细胞等)免遭免疫排斥，而神经干细胞长期包裹于微囊内则可能封闭干细胞的表面受体，使其在体内的趋化活动与信号联系受到干扰，从而无法与脑组织很好的整合。因此，研究制备一种适用于脑组织损伤后神经修复的新型可降解组织工程微囊成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种用于脑组织损伤修复的磷脂膜微囊化的神经干细胞及其制备方法。更具体来讲是提供了一种神经干细胞磷脂膜微囊及其制备方法。其特点是在传统的海藻酸盐-聚赖氨酸类微囊中引入在脑组织中广泛存在的磷脂，从而构建与脑组织的生物相容性及整合性极好的组织工程微囊。该神经干细胞磷脂膜微囊，经动物实验证实可以运用于脑组织损伤后的神经修复、降低致残率。且其制备方法还具有工艺简单，能耗低，成本低的优点。

为实现本发明的目的，提供如下实施方案。

在一实施方案中。本发明的一种神经干细胞磷脂膜微囊，主要由神经干细胞、海藻酸钠、磷脂酰胆碱和多聚赖氨酸制备而得。

上述本发明的磷脂膜微囊，所述磷脂酰胆碱为L-α-磷脂酰胆碱。

在另一实施方案中，本发明提供一种神经干细胞磷脂膜微囊的制备方法，包括以下步骤：

1)将海藻酸钠溶液与磷脂酰胆碱混合形成混合液；

2)将培养的神经干细胞加入到混合液中，形成细胞悬液；

3)将细胞悬液使用静电液滴发生器滴入氯化钙溶液中形成微珠，设置流速为10-50ml/h，反应完后，用生理盐水漂洗；

4)将微珠加入到多聚赖氨酸溶液中成膜，反应时间10-15分钟，用生理盐水漂洗；

5)将上步成膜后的微珠加入到柠檬酸钠溶液中液化，形成微囊化的神经干细胞悬液；

6)将磷脂酰胆碱溶解在氯仿中，形成磷脂溶液；

7)将磷脂溶液涂抹至导电玻璃表面，真空干燥；

8)取上步涂有磷脂溶液的导电玻璃两块，平行放置，涂有磷脂一面朝内，中间夹一个1-2mm厚度的聚四氟乙烯框，构成密封腔室，注入步骤5)的微囊化的神经干细胞悬液；

9)将电场函数发生器与密封腔室连通交流电，输入电压和频率：频率值为10Hz，幅值0.5Vpp，随后每20min增加0.5Vpp至幅值达到2.5Vpp后，保持电压2.5Vpp，直到磷脂进一步覆盖至微囊成膜，即得神经干细胞磷脂膜微囊。

优选的，本发明所述的制备方法，在步骤1)的混合液中，海藻酸钠的浓度为1％-2％(w/v)，磷脂酰胆碱的浓度为5％-10％(w/v)；步骤2)的细胞悬液，神经干细胞的终浓度为10⁵-10⁶/ml；步骤3)的氯化钙溶液，氯化钙的浓度为100mmol/L；步骤4)所述多聚赖氨酸溶液，多聚赖氨酸的浓度为0.05-0.1％(w/v)，步骤5)所述柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠的浓度为55mmol/L；步骤6)所述的磷脂溶液，磷脂酰胆碱的浓度为2mg/ml。

单位：w/v通常是指kg/L。

另一方面，本发明还提供了一种本发明的神经干细胞磷脂膜微囊在制造修复脑组织损伤药物中的用途，优选的，脑组织损伤包括脑梗死、脑出血或/和脑外伤。

在一具体实施方案中，本发明的一种神经干细胞磷脂膜微囊的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

1)构建含磷脂的海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化的神经干细胞

1.1)在1％-2％(w/v)的海藻酸钠溶液中，加入5％-10％(w/v)的L-α-磷脂酰胆碱，形成混合液；

1.2)将培养的神经干细胞加入混合液中，得到神经干细胞最终浓度为10⁵-10⁶/ml的细胞悬液；

1.3)将上述细胞悬液加入到微囊静电液滴发生器中，流速为10-50ml/h，压力100kPa，滴入100mmol/L的氯化钙溶液中形成微珠，反应10-15分钟后，用0.9％生理盐水漂洗三次；

1.4)将微珠加入0.05-0.1％的多聚赖氨酸溶液中成膜，反应时间10-15分钟，0.9％生理盐水漂洗三次；

1.5)将成膜后的微珠加入55mmol/L柠檬酸钠溶液中液化形成微囊化的神经干细胞。

2)进一步磷脂覆盖成膜

2.1)将磷脂酰胆碱溶于氯仿，配制浓度为2mg/ml磷脂溶液；

2.2)将磷脂溶液涂抹至ITO导电玻片表面，真空干燥至少2小时；

2.3)将两块涂有磷脂的ITO导电玻片按导电面向内平行放置，中间夹一个1-2mm厚度的聚四氟乙烯框，构成密封腔室，并向腔室内注入含磷脂的海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化的神经干细胞悬液；

2.4)上述装置连通交流电场函数发生器，输入电压和频率：频率值为10Hz，幅值0.5Vpp，随后每20min增加0.5Vpp至幅值达到2.5Vpp后，保持2个小时，直到磷脂进一步覆盖至微囊成膜，即得神经干细胞磷脂膜微囊。

本发明的化的神经干细胞磷脂膜微囊具有如下优点：

1、本发明采用静电液滴生成法结合电形成法，制备全新的磷脂膜微囊并包裹神经干细胞即神经干细胞磷脂膜微囊。

2、制备工艺简单，能耗低。

3、本发明生产过程中不产生废气废液，对环境友好。

4、本发明的神经干细胞磷脂膜微囊安全性好，对人体的毒副作用小，尤其适用于脑组织的损伤修复。

附图说明

图1为本发明的神经干细胞磷脂膜微囊的显微镜照片，以及显示其内神经干细胞的荧光显微镜照片。

图2为本发明的磷脂膜微囊化的神经干细胞在OGD模型中的存活曲线图。

图3为本发明的神经干细胞磷脂膜微囊在小鼠MCAO模型中的TTC染色试验显示效果图。

图4为本发明的神经干细胞磷脂膜微囊在小鼠MCAO模型中的磁共振检查试验效果图。

图5为本发明的神经干细胞磷脂膜微囊改善小鼠MCAO模型的神经功能缺损评分效果图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明神经干细胞磷脂膜微囊(也称为“磷脂膜微囊化的神经干细胞”)及其制备方法进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明的精神实质作出一些非本质的改进和变通，也属于本发明的范围。

实施例1磷脂膜微囊化的神经干细胞的制备

将5％(w/v)的L-α-磷脂酰胆碱加入到2％(w/v)的海藻酸钠溶液中，然后加入培养的神经干细胞，得到神经干细胞最终浓度为10⁶/ml的细胞悬液；将细胞悬液装入微囊静电液滴发生器，设置流速为10ml/h，压力100kPa，滴入100mmol/L的氯化钙溶液中形成微珠，反应10分钟后，用0.9％生理盐水漂洗三次，然后加入到0.1％的多聚赖氨酸溶液中成膜，反应时间10分钟，用0.9％生理盐水漂洗三次后，加入到55mmol/L柠檬酸钠溶液中液化形成磷脂-海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化的神经干细胞悬液。

以磷脂酰胆碱为原料，氯仿为溶剂，配制浓度为2mg/ml磷脂溶液；将磷脂溶液涂抹至ITO导电玻璃表面，真空干燥至少2小时；将两块ITO玻片按导电面向内平行放置，中间夹一个1-2mm厚度的聚四氟乙烯框，构建一密封腔室，并注入含磷脂的海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化的神经干细胞悬液；上述装置密封腔室连通交流电场函数发生器。输入电压和频率：频率值为10Hz，幅值0.5Vpp，随后每20min增加0.5Vpp至幅值达到2.5Vpp后，保持2个小时，磷脂进一步覆盖至微囊成膜，即制得神经干细胞磷脂膜微囊。

经免疫荧光染色，用显微镜观察神经干细胞磷脂膜微囊中神经干细胞，结果见图1。图1表明：成功将神经干细胞包裹至磷脂膜微囊中。

实施例2在OGD模型中检测微囊化的神经干细胞的存活情况

按如下方法构建OGD模型：换用无糖DMEM/F12培养液，将各实验组的细胞数量调整至1×10⁵/ml浓度，接种至96孔板，每孔接种100μl；放置细胞于无氧培育箱(85％氮气，10％二氧化碳，5％氢气)，37℃条件下培养2小时；2小时后，采用半换液法并用原细胞培养液代替无糖DMEM/F12培养液，细胞返回常氧培养箱。于恢复正常培养的0，24，48小时后，CCK8法定量检测并对比不同时相点各实验组的细胞数量，检测步骤如下：收集细胞，PBS轻柔漂洗3次后，转移至新的96孔板，加入100μl培养基，再加入10μl CCK8试剂后，37℃孵育1小时，酶标仪450nm波长检测溶液吸光度，并绘制细胞生长曲线，结果见图2。图2的结果表明在氧糖剥夺的环境中，本发明的磷脂膜微囊化的神经干细胞存活率明显高于对照组。

实施例3 TTC染色，检测移植磷脂膜微囊化的神经干细胞对脑梗死后神经修复的影响

按如下方法构建MCAO模型，选用成年C57BL/6小鼠，1％戊巴比妥钠溶液(0.01mg/g体重)常规麻醉。剪开颈部皮肤，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，分离颈动脉叉。颈外动脉远端结扎，近端打一单结。颈内动脉挂线，分别于颈内动脉远心端和颈总动脉近心端各打一单结，暂时阻断血流，然后在颈外动脉单结远侧剪一切口，从切口处插入栓线。离断颈外动脉，松开颈内动脉单活结。调节栓线方向，指向颈内动脉方向，循血管走形插入栓线至大脑中动脉，切口处覆盖蘸有生理盐水的棉花。缺血2小时后，退出栓线行颈总动脉再灌注，颈外动脉断端结扎，逐层缝合皮肤。

通过立体定向注射，向梗死区域移植神经干细胞，具体分组为：①空白对照组：移植10μl DMEM/F12完全培养基；②磷脂膜微囊化神经干细胞悬液移植组：向梗死局部移植含有10⁵个细胞的磷脂膜微囊化神经干细胞悬液。移植后14天，收集脑组织，按如下方法行TTC染色：-20度冰箱中速冻20分钟左右，便于切片。切成7片，每隔2mm切一片。将切片置于2％TTC中，常规浓度为2％，避光，37℃温箱孵育30min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液。拍照观察，结果见图3。图3结果显示，在移植磷脂膜微囊化的神经干细胞后，TTC染色提示梗死范围较对照组明显减少。

实施例4核磁共振检查，检测移植磷脂膜微囊化的神经干细胞对脑梗死后神经修复的影响

按实施例3中所述方法，构建MCAO模型以及移植磷脂膜微囊化的神经干细胞。移植后7天，使用GE 3.0T MRI检测并获得模型小鼠的头颅磁共振影像学结果。结果见图4。图4显示，在移植磷脂膜微囊化的神经干细胞后，磁共振检查提示梗死范围较对照组明显减少。

实施例5神经干细胞磷脂膜微囊改善小鼠MCAO模型的神经功能缺损评分的效果

按如下方法，构建不含磷脂的海藻酸钠-聚赖氨酸微囊化的神经干细胞：在2％(w/v)的海藻酸钠溶液中，然后加入培养的神经干细胞，得到最终浓度为10⁶/ml的细胞悬液；将细胞悬液装入微囊静电液滴发生器，设置流速为10ml/h，压力100kPa，滴入100mmol/L的氯化钙溶液中形成微珠，反应10分钟后，用0.9％生理盐水漂洗三次，然后加入到0.1％的多聚赖氨酸溶液中成膜，反应时间10分钟，用0.9％生理盐水漂洗三次后，加入到55mmol/L柠檬酸钠溶液中液化形成海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化的神经干细胞悬液。

按实施例3中所述方法，构建MCAO模型以及移植磷脂膜微囊化的神经干细胞、海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化的神经干细胞(即非磷脂膜微囊化组)。在移植的1、7、14天采用Longa 5分量表进行神经功能缺损评分(分数越高，神经功能缺损越重)，结果见图5。图5显示，经移植磷脂膜微囊化的神经干细胞，可显著改善小鼠MCAO模型的神经功能缺损。

Claims

1.一种神经干细胞磷脂膜微囊，主要由神经干细胞、海藻酸钠、磷脂酰胆碱和多聚赖氨酸制备而得，具体制备方法，包括以下步骤：

1)将海藻酸钠溶液与磷脂酰胆碱混合形成混合液；

2)将培养的神经干细胞加入到混合液中，形成细胞悬液；

3)将细胞悬液使用静电液滴发生器滴入氯化钙溶液中形成微珠，流速为10-50ml/h，反应完后，用生理盐水漂洗；

6)将磷脂酰胆碱溶解在氯仿中，形成磷脂溶液；

7)将磷脂溶液涂抹至导电玻璃表面，真空干燥；

8)取上步涂有磷脂溶液的导电玻璃两块，平行放置，中间夹一个1-2mm厚度的聚四氟乙烯框，构成密封腔室，注入步骤5)微囊化的神经干细胞悬液；

9)将电场函数发生器与密封腔室连通交流电，输入电压和频率：频率值为10Hz，幅值0.5Vpp，随后每20min增加0.5Vpp至幅值达到2.5Vpp后，保持电压2.5Vpp，直到磷脂酰胆碱进一步覆盖至微囊成膜，即得神经干细胞磷脂膜微囊。

2.如权利要求1所述的磷脂膜微囊，所述磷脂酰胆碱为L-α-磷脂酰胆碱。

3.如权利要求1所述的磷脂膜微囊，所述制备方法，步骤1)的混合溶液，海藻酸钠的浓度为1％-2％w/v，磷脂酰胆碱的浓度为5％-10％w/v。

4.如权利要求1所述的磷脂膜微囊，所述制备方法，步骤2)的细胞悬液，神经干细胞的终浓度为10⁵-10⁶/ml。

5.如权利要求1所述的磷脂膜微囊，所述制备方法，步骤3)的氯化钙溶液，氯化钙的浓度为100mmol/L。

6.如权利要求1所述的磷脂膜微囊，所述制备方法，步骤4)所述多聚赖氨酸溶液，多聚赖氨酸的浓度的为0.05-0.1％w/v。

7.如权利要求1所述的磷脂膜微囊，所述制备方法，步骤5)所述柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠的浓度为55mmol/L。

8.如权利要求1所述的磷脂膜微囊，所述制备方法，步骤6)所述的磷脂溶液，磷脂的浓度为2mg/ml。

9.权利要求1的神经干细胞磷脂膜微囊在制造修复脑组织损伤药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，所述脑组织损伤包括脑梗死、脑出血或/和脑外伤。