CN116121173B

CN116121173B - 一种眼组织类器官及其衍生细胞系、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116121173B
Application number: CN202310243172.0A
Authority: CN
Inventors: 龚明喜
Original assignee: Guangzhou Bay Area Biogenic Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Bay Area Biogenic Technology Co ltd
Priority date: 2023-03-14
Filing date: 2023-03-14
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2043-03-14
Also published as: CN116121173A

Abstract

本发明属于医学类器官技术领域，具体公开了一种眼组织类器官及其衍生细胞系、其制备方法和应用，所述眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法通过三维成球培养，促使hiPSCs或hESCs聚集，形成神经干细胞球；神经干细胞球贴壁培养形成类眼杯组织；类眼杯组织经悬浮培养后，产生类视杯结构，以及角膜原基、晶状体原基；诱导类视杯结构发育为视网膜类器官，出现片层化结构并产生各种类视网膜细胞；诱导角膜原基发育为角膜类器官；诱导晶状体原基发育为晶状体小体。本发明解决了眼组织类器官诱导分化异质性等难题，从而能够标准化、规模化提供高度保留原始组织的形态和遗传特征的视网膜类器官，以及角膜类器官、晶状体小体等眼组织类器官。

Description

一种眼组织类器官及其衍生细胞系、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医学类器官技术领域，尤其涉及一种眼组织类器官及其衍生细胞系、其制备方法和应用。

背景技术

世界卫生组织（WHO）提出，眼病已成为继肿瘤、心血管病后的第三位危害及影响人们生存质量之疾病。近年来，传统的动物模型有助于我们对病理机制和治疗方案的研究。但由于物种间存在差异，动物模型无法完全模拟人眼发育和病理过程，限制了这些基础研究成果向临床应用的转化。随着体外细胞培养技术的成熟，类器官被赋予了新的含义。类器官具有与原生器官相似的细胞组成和组织结构，能够在更具生理学相关性的环境中模拟疾病发生，既可以避开传统动物模型的劣势，还可以发挥更多再生的优势，大大激发了人们对这种新型疾病模型研究的热情。

2013年，类器官被《科学》杂志评为年度十大技术。然而作为一种新兴技术，类器官缺乏统一的制备规范和应用标准，在一定程度上制约了类器官技术转化和临床应用。

类器官是体外培养的自组织结构，由成群基因在时间与空间的迭代，互相牵制和协调，定时开启和关闭而发育形成。有文献报道，可诱导产生眼某特定组织类器官，但仅仅是眼组织中某特定种类的类器官，并且这些类器官诱导分化能力不足、异质性较差，还产生了很大一部分眼组织以外的其他组织和细胞，难以还原原生组织细胞组成、形态结构等特征。因此，眼组织类器官从实验研究到产业应用，难以做到标准化、规模化、和异质化，特别是眼组织类器官与原生器官发育的异质化，仍是该领域亟待解决的问题。

因此，发明人致力于设计一种眼组织类器官及其制备方法和应用以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法，可再生眼组织类器官及其衍生细胞系，很好地解决了眼组织类器官诱导分化异质性等难题，从而能够标准化、规模化提供高度保留原始组织的形态和遗传特征的视网膜类器官，以及角膜类器官、晶状体小体等眼组织类器官。

本发明的另一目的在于：提供一种眼组织类器官及其衍生细胞系，为构建遗传性眼病模型和实现精准医疗提供了新的工具。

本发明的又一目的在于：提供一种眼组织类器官及其衍生细胞系在药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明所采用的一种技术方案为：

一种眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、神经干细胞成球培养：将扩增的hiPSCs或hESCs接种到三维培养皿中培养，以诱导hiPSCs或hESCs向神经干细胞分化，并形成神经干细胞球；

步骤2、神经干细胞球贴壁培养：将所述神经干细胞球接种到细胞培养板进行贴壁培养，形成圆形或椭圆形的类眼杯组织；

步骤3、类眼杯组织悬浮培养：用细胞刮逐一收集所述类眼杯组织，并转入悬浮培养体系，类眼杯组织分化为类视杯结构，以及角膜原基、晶状体原基；

步骤4、诱导形成眼组织类器官：类视杯结构进一步发育成熟形成视网膜类器官，同时，出现片层化结构并产生各种类视网膜细胞，角膜原基进一步发育成角膜类器官，晶状体原基进一步发育成晶状体小体。

作为本发明眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法的一种改进，所述步骤1中，hiPSCs或hESCs优选以300个/孔的密度进行接种，并使用成神经诱导培养基连续培养至少10天。

hiPSCs或hESCs接种，若接种密度过低，则因细胞数量过少难以形成细胞球；若接种密度过高，培养过程中细胞死亡较多，同样不利于形成细胞球，因此，本发明中，hiPSCs或hESCs以300个/孔的密度接种较佳。

作为本发明眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法的一种改进，所述步骤2中，所述神经干细胞球优选以15个/孔的密度接种到6孔细胞培养板，并继续使用成神经诱导培养基培养至少5天，再将成神经诱导培养基更换为成眼神经诱导培养基进行连续培养至少15天，经细胞自组织发育，神经干细胞向眼相关组织祖细胞分化，并发育形成类眼杯组织。

作为本发明眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法的一种改进，所述步骤3中，类眼杯组织经悬浮培养至少5天后，在成眼神经诱导培养基的作用下，出现类视杯结构、角膜原基、晶状体原基。

作为本发明眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法的一种改进，所述步骤4中，类视杯结构依次使用视网膜诱导培养基、视网膜成熟培养基以及视网膜维持培养基进行培养，以获得视网膜类器官，同时，出现外核层、内核层、节细胞层的片层化结构，并不断产生各种类视网膜细胞，所述视网膜细胞包括色素上皮细胞、视细胞、神经节细胞、无长突细胞、双极细胞、水平细胞、穆勒神经胶质细胞。

为能够更好地产生视网膜类器官，类视杯结构应逐一转移到96孔细胞培养板进行单孔悬浮培养；先后使用视网膜诱导培养基、视网膜成熟培养基和视网膜维持培养基进行培养，诱导视网膜类器官进一步成熟，并高度保留原始组织的形态和遗传特征。

作为本发明眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法的一种改进，所述步骤4中，角膜原基使用角膜诱导培养基进行培养，以获得角膜类器官。

为能够更好地产生角膜类器官，角膜原基应接种到细胞培养皿进行悬浮培养；培养期间应及时将粘连在一起的类器官球分开；并使用角膜诱导培养基，诱导产生成熟的角膜类器官。

作为本发明眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法的一种改进，所述步骤4中，晶状体原基使用晶状体诱导培养基进行培养，以获得晶状体小体。

为能够更好地产生晶状体小体，晶状体原基应接种到细胞培养皿进行悬浮培养；并使用晶状体诱导培养基，诱导产生成熟的晶状体小体。

为了达到上述另一目的，本发明所采用的一种技术方案为：

一种眼组织类器官及其衍生细胞系，所述眼组织类器官及其衍生细胞系由上述眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法制备而成。

为了达到上述又一目的，本发明所采用的一种技术方案为：

一种眼组织类器官及其衍生细胞系的应用，所述眼组织类器官及其衍生细胞系用于眼相关疾病治疗的药物中。

与现有技术相比，本发明的眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法，通过神经干细胞成球培养、神经干细胞球贴壁培养、类眼杯组织悬浮培养、诱导形成眼组织类器官等步骤，促使hiPSCs或hESCs聚集，形成神经干细胞球；神经干细胞球贴壁培养形成类眼杯组织；用细胞刮收集类眼杯组织，类眼杯组织经悬浮培养后，产生从形态上可区分的类视杯结构，以及角膜原基、晶状体原基；诱导类视杯结构进一步成熟为视网膜类器官，出现片层化结构，并产生各种类视网膜细胞；诱导角膜原基进一步发育为角膜类器官；诱导晶状体原基进一步发育为晶状体小体，整个制备方法可形成标准化流程和质量控制体系，不仅能够标准化、规模化产生可再生眼组织类器官及其衍生细胞系，很好地解决了眼组织类器官诱导分化异质性等难题，而且在培养涉及的操作环节方面有朝着自动化方向靠拢的可行性，在产业化方面具备很强的自主研发的能力，能够标准化、规模化提供高度保留原始组织的形态和遗传特征的视网膜类器官，以及角膜类器官、晶状体小体等眼组织类器官。

与现有技术相比，本发明的眼组织类器官及其衍生细胞系，为构建遗传性眼病模型和实现精准医疗提供了新的工具。在遗传性眼病模型构建方面，随着基因编辑技术不断发展，可特异性构建与遗传性眼病相关的单致病基因或多致病基因编辑后的眼组织类器官，为疾病研究提供新思路；另一方面，还可以通过体细胞重编程技术将遗传性眼病患者的体细胞重编程形成iPSCs，进一步分化为眼组织类器官，为个性化药物筛选或潜在的自体细胞移植治疗提供有效资源。

与现有技术相比，本发明的眼组织类器官及其衍生细胞系可应用于眼相关疾病治疗的药物中，为眼相关疾病的治疗提供有效的药物资源，更为研究遗传性眼病、实现个体化治疗提供可能性。

附图说明

图1为本发明的眼组织类器官及其衍生细胞系的成形方法示意图；

图2为本发明体外培养的hiPSCs；

图3为本发明体外培养的神经干细胞球；

图4为本发明体外培养的类眼杯组织；

图5为本发明体外培养的类视杯结构；

图6为本发明类视杯结构中，表达Pax6的视网膜祖细胞；

图7为本发明类视杯结构中，表达Rax的视网膜祖细胞；

图8为本发明不断成熟并出现片层化结构的视网膜类器官；

图9为本发明视网膜类器官中，表达CRX的视细胞前体细胞；

图10为本发明视网膜类器官中，表达Rcvrn的视细胞；

图11为本发明视网膜类器官中，表达Calbindin的无长突细胞和水平细胞；

图12为本发明视网膜类器官中，表达OTX2的双极细胞；

图13为本发明视网膜类器官中，表达GFAP的穆勒神经胶质细胞；

图14为本发明视网膜类器官中，表达EBF3的神经节细胞；

图15为本发明视网膜类器官中，表达RPE65的色素上皮细胞；

图16为本发明的角膜原基；

图17为本发明的角膜类器官；

图18为本发明的晶状体小体。

具体实施方式

下面结合附图，具体阐明本发明的实施方式，附图仅供参考和说明使用，不构成对本发明专利保护范围的限制。

本发明的眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法涉及神经干细胞成球培养、神经干细胞球贴壁培养、类眼杯组织悬浮培养，各个培养方法如下：

一、神经干细胞成球培养

此过程用于体外模拟胚胎早期发育的囊胚向神经胚发育过程。本实施步骤采用的三维成球培养体系，能够突破二维限制，使原本分开的hiPSCs（人诱导多能干细胞）或hESCs（人胚胎干细胞）开始聚集并形成三维结构。在细胞自组织以及添加的外源性营养因子共同作用下，迅速诱导hiPSCs或hESCs分化并聚集成神经干细胞球。对于能够用于本发明的hiPSCs或hESCs没有特殊限制，以下以hiPSCs作为举例，包括如下步骤：

1）hiPSCs接种前，应使用终浓度为200μg/ml的Matrigel（基底膜基质）处理细胞培养板；

2）从液氮罐或-80℃冰箱取出细胞冻存管，迅速置于37℃水浴解冻；

3）将解冻后的细胞悬液轻轻转移到含有8ml hiPSCs培养基的15ml离心管中，室温200g离心2分钟；

4）去除上清，加入适量hiPSCs培养基轻轻吹打，新的细胞悬液重新接种细胞培养板中，并置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养；

5）每天更换hiPSCs培养基，当细胞集落覆盖细胞培养板约70%面积的时候可进行细胞传代；

6）移去旧hiPSCs培养基，加入PBS清洗残留培养基1次；

7）移去PBS并加入细胞传代消化液，在室温放置1分钟；

8）移去细胞传代消化液，静置5分钟；

9）重新加入hiPSCs培养基，可观察到细胞集落边缘的细胞开始飘起；轻轻吹打并以1:4的比例进行传代接种。

10）传代后的细胞集落覆盖细胞培养板约70%面积时，移去hiPSCs旧培养基，加入PBS清洗1次；

11）移去PBS，加入EDTA（乙二胺四乙酸）螯合细胞集落中的二价离子，使细胞集落更容易被消化成单细胞形态；

12）移去EDTA，加入细胞消化液后静置3分钟；

13）重新加入hiPSCs培养基，将细胞集落轻轻吹打成单个细胞；

14）将吹散后的hiPSCs细胞重新接种到3D培养皿中，并置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养约10天；

15）第2天移去旧培养基，以2:1比例添加hiPSCs培养基和成神经诱导培养基；

16）第3天移去旧培养基，以1:2比例添加hiPSCs培养基和成神经诱导培养基；

17）从第4天起，每天更换新的成神经诱导培养基。

其中，所述hiPSCs培养基优选mTeSR™培养基（人诱导多能干细胞培养基）；细胞传代消化液优选ReLeSR消化液；细胞消化液优选Accutase®溶液；成神经诱导培养基的主要成分包括：占总体积98%的DMEM/F-12,GlutaMAX™、占总体积1％的N-2 Supplement、占总体积1％的NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)和终浓度为2μg/ml的Heparin；PBS优选D-PBS（不含钙镁和酚红的磷酸缓冲液）。

二、神经干细胞球贴壁培养

此过程用于体外模拟神经干细胞向眼相关组织祖细胞分化，并发育成类眼杯组织过程。作为举例，包括如下步骤：

1）神经干细胞球贴壁培养前，应使用终浓度为200μg/ml的Matrigel（基底膜基质）处理细胞培养板；

2）以合适的密度将神经干细胞球转移到细胞培养板；

3）使用成神经诱导培养基培养约5天，每天更换新的培养基，以获得足够的神经干细胞；

4）从第6天起，将成神经诱导培养基更换为成眼神经诱导培养基，诱导神经干细胞向眼相关组织祖细胞分化；

5）每天更换为成眼神经诱导培养基，连续培养约15天，圆形或椭圆形类眼杯组织基本形成。

其中，成眼神经诱导培养基主要成分包括：占总体积71%的DMEM with GlutaMAX™Supplement、占总体积25%的F12 with GlutaMAX™、占总体系2%的B27 Supplement(without vitamin A，50X)、占总体积1％的NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)和占总体积1％的青霉素/链霉素(100×)。

三、类眼杯组织悬浮培养

为了促进类眼杯组织发育成复杂的结构，经细胞刮收集后将类眼杯组织转入悬浮培养条件，细胞之间能够更加灵活地发生相互作用，发育成视网膜、角膜、晶状体等眼组织类器官三维结构。作为举例，包括如下步骤：

1）在倒置显微镜下使用细胞刮，将类眼杯组织挑起，并转移到培养皿进行培养；

2）使用成眼神经诱导培养基连续培养约5天，促进类眼杯组织分化为从形态上可区分的类视杯结构、角膜原基、晶状体原基；

3）将类视杯结构逐一转移到96孔细胞培养板进行单孔培养，分阶段诱导视网膜类器官成熟。第一阶段，使用视网膜诱导培养基培养至少20天；第二阶段，使用视网膜成熟培养基培养至少20天；第三阶段，使用视网膜维持培养基长期培养，以维持视网膜类器官成熟状态；

其中，视网膜诱导培养基的主要成分包括：占总体积66%的DMEM with GlutaMAX™Supplement、占总体积20%的F12 with GlutaMAX™、占总体积10%的FBS胎牛血清、占总体系2%的B27 Supplement (without vitamin A，50X)、占总体积1％的NEAA(Non EssentialAmino Acid，100×)、占总体积1％的青霉素/链霉素(100×)和终浓度为100μM的牛磺酸（Taurine）；

视网膜成熟培养基的主要成分包括：占总体积70%的DMEM with GlutaMAX™Supplement、占总体积20%的F12 with GlutaMAX™、占总体积10%的FBS胎牛血清、终浓度为100μM的牛磺酸（Taurine）和终浓度为1μM的视黄酸（Retinoic Acid）；

视网膜维持培养基的主要成分包括：占总体积67%的DMEM with GlutaMAX™Supplement、占总体积20%的F12 with GlutaMAX™、占总体积10%的FBS胎牛血清、占总体系1%的N-2 Supplement (100X)、占总体积1％的NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)、占总体积1％的青霉素/链霉素(100×)、终浓度为100μM的牛磺酸（Taurine）和终浓度为1μM的视黄酸（Retinoic Acid）。

4）将角膜原基转移到细胞培养皿中培养，使用角膜诱导培养基进行分化诱导至少20天；培养中及时将粘连在一起的类器官球分开；

其中，角膜诱导培养基的主要成分包括：占总体系99%的DMEM/F12、占总体系1%的N-2 Supplement (100X)、以及终浓度为5 ng/ml的成纤维细胞生长因子（FGF）、5 μg/ml的胰岛素（insulin）和10 ng/ml表皮细胞生长因子（EGF）。

5）将晶状体原基转移到细胞培养皿中培养，使用晶状体诱导培养基进行分化诱导至少10天。

晶状体诱导培养基的主要成分包括：总体积96％的DMEM/F12、占总体积1％的NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)、占总体系1%的N-2 Supplement (100X)、占总体系2%的B27 Supplement (50X)、终浓度为2 mM 的GlutaMAX Supplement、100 ng/mL的纤维细胞生长因子-2（FGF2）和 20ng/mL Wnt3a。

参照图1至图18，一种眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法，包括以下步骤：

本发明的步骤0主要用于体外扩增hiPSCs。

（1）实验准备阶段：

a、使用终浓度为200μg/ml的Matrige处理6孔细胞培养板，室温放置1小时，备用；

b、在15ml离心管中加入8ml mTeSR™培养基，室温放置，备用；

（2）细胞解冻：

a、从液氮罐或温度为-80℃的冰箱中取出细胞冻存管，迅速以37℃水浴解冻，形成含有hiPSCs的细胞悬液；

b、将解冻后的细胞悬液轻轻转移到含有8ml hiPSCs培养基的15ml离心管中；

c、室温离心2分钟后，弃除上清，备用；

（3）细胞接种：

a、往15ml离心管中加入1ml mTeSR™培养基，轻轻吹打；

b、吸取250μl细胞悬液，并逐一接种到6孔板细胞培养板中；

c、每孔再加入3ml mTeSR™培养基；

d、置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养；

e、每天更换mTeSR™培养基；

（4）细胞传代：

a、当细胞集落覆盖细胞培养板约70%面积的时候可进行细胞传代；

b、移去旧mTeSR™ 培养基，加入D-PBS清洗残留培养基1次；

c、移去D-PBS；

d、加入ReLeSR消化液，在室温放置1分钟；

e、移去ReLeSR消化液，在室温放置3分钟；

f、重新加入mTeSR™培养基并轻轻吹打，细胞集落边缘的细胞开始飘起，以1:4的比例进行重新接种；

g、置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养；

h、当细胞集落覆盖细胞培养板约70%面积时（见图2），可进行下一环节实验。

（1）细胞消化：

a. 移去旧的hiPSCs培养基，加入D-PBS清洗1次；

b. 移去D-PBS，加入1ml 0.5 mM的EDTA，室温放置3分钟；

c. 移去EDTA，加入1ml Accutase®溶液消化3分钟；

d. 加入1ml mTeSR™ 培养基中止Accutase®溶液；

e. 将hiPSCs细胞集落吹打成单个细胞；

f. 对细胞悬液进行细胞数数，并用于下一步实验。

（2）三维成球培养

a. 以300个/孔的细胞密度将hiPSCs接种到三维培养皿，并使用mTeSR™ 培养基，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养；

b. 第2天移去旧培养基，以2:1比例添加mTeSR™ 和成神经诱导培养基；

c. 第3天移去旧培养基，以1:2比例添加mTeSR™ 和成神经诱导培养基；

d. 第4天到第10天，每天更换新的成神经诱导培养基；

经反复测试，如图3所示，能够形成神经干细胞球。

本发明的步骤2主要用于将神经干细胞球诱导形成类眼杯组织。

a、以15个/孔的的密度，将神经干细胞球接种到经Matrigel预处理的6孔细胞培养板，进行贴壁培养；

b、置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养；

c、使用成神经诱导培养基培养5天，每天更换新的成神经诱导培养基；

d、从第6天起，将成神经诱导培养基更换为成眼神经诱导培养基，每天更换新的成眼神经诱导培养基；

e、连续培养15天，圆形或椭圆形的类眼杯组织基本形成（见图4）。

本步骤3主要用于将类眼杯组织分化为类视杯结构，以及角膜原基、晶状体原基。

在倒置显微镜下使用细胞刮将类眼杯组织挑起，转移到细胞培养皿，并置于37℃、CO₂浓度为5%的且饱和湿度的CO₂培养箱，使用成眼神经诱导培养基连续悬浮培养5天，类眼杯组织分化为类视杯结构，以及角膜原基、晶状体原基；

本发明的步骤4用于将类眼杯组织分化而产生的各种结构进一步发育成高度保留了原始组织的形态和遗传特征的视网膜类器官、角膜类器官和晶状体小体这些眼组织类器官。

其中，类视杯结构进一步发育成熟形成视网膜类器官，同时，出现片层化结构并产生各种类视网膜细胞的诱导步骤如下：

a、挑选出类视杯结构（见图5），逐一转移到96孔细胞培养板进行单孔培养；

眼发育中，Pax6和Rax可作为视网膜祖细胞的标记物。对类视杯结构进行冰冻切片的免疫染色，该结构特异性表达视网膜祖细胞标记物Pax6（见图6）、Rax（见图7）。因此，上述类视杯结构在形态和遗传特征高度保留原始组织特征；

b、将成眼神经诱导培养基更换为视网膜诱导培养基，培养20天；

c、将视网膜诱导培养基更换为视网膜成熟培养基，培养20天；

d、将视网膜成熟培养基更换为视网膜维持培养基，可长期培养。

视网膜类器官不断成熟，出现外核层、内核层、神经节细胞层的片层化结构（见图8），并产生视细胞前体细胞（见图9）、视细胞（见图10）、无长突细胞和水平细胞（见图11）、双极细胞（见图12）、穆勒神经胶质细胞（见图13）、神经节细胞（见图14）以及色素上皮细胞（见图15）等视网膜后代细胞。因此，上述视网膜类器官结构在形态和遗传特征高度保留原始组织特征。

其中，角膜原基发育成角膜类器官的诱导步骤如下：

a、挑选出角膜原基（见图16），转移到新的细胞培养皿中；

b、将成眼神经诱导培养基更换为角膜诱导培养基，继续培养20天，形成角膜类器官（见图17）。

其中，晶状体原基发育成晶状体小体的诱导步骤如下：

a、挑选出晶状体原基，转移到新的细胞培养皿中；

b、将成眼神经诱导培养基更换为晶状体诱导培养基，继续培养10天，形成晶状体小体（见图18）。

一种眼组织类器官及其衍生细胞系，所述眼组织类器官及其衍生细胞系由上述眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法制备而成，其中，眼组织类器官具体为视网膜类器官、角膜类器官和晶状体小体，衍生产生的各细胞系指衍生的各类祖细胞、前体细胞以及后代细胞等。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例，不能以此来限定本发明的权利保护范围，因此依本发明申请专利范围上所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims

1.一种眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、神经干细胞成球培养：

a.将扩增的hiPSCs或hESCs以300个/孔的密度进行接种到三维培养皿培养，并使用mTeSR™ 培养基，置于CO₂培养箱中培养；

b.第2天移去旧培养基，以2:1比例添加mTeSR™ 和成神经诱导培养基；

c.第3天移去旧培养基，以1:2比例添加mTeSR™ 和成神经诱导培养基；

d.第4天到第10天，每天更换新的成神经诱导培养基，以诱导hiPSCs或hESCs向神经干细胞分化，并形成神经干细胞球；

步骤2、神经干细胞球贴壁培养：将所述神经干细胞球以15个/孔的密度接种到6孔细胞培养板，并继续使用成神经诱导培养基贴壁培养至少5天，再将成神经诱导培养基更换为成眼神经诱导培养基进行连续贴壁培养至少15天，经细胞自组织发育，神经干细胞向眼相关组织祖细胞分化，并发育形成圆形或椭圆形的类眼杯组织；

步骤3、类眼杯组织悬浮培养：

1）用细胞刮将类眼杯组织挑起，并转移到培养皿进行培养；

2）使用成眼神经诱导培养基连续培养5天，促进类眼杯组织分化为从形态上可区分的类视杯结构、角膜原基、晶状体原基；

步骤4、诱导形成眼组织类器官：

挑选出类视杯结构，逐一转移到96孔细胞培养板进行单孔培养，依次使用视网膜诱导培养基、视网膜成熟培养基以及视网膜维持培养基进行培养，以获得视网膜类器官，同时，出现外核层、内核层、节细胞层的片层化结构，并不断产生视网膜后代细胞；

挑选出角膜原基，转移到新的细胞培养皿中，使用角膜诱导培养基进行培养，以获得角膜类器官；

挑选出晶状体原基，转移到新的细胞培养皿中，使用晶状体诱导培养基进行培养，以获得晶状体小体。

2.根据权利要求1所述的眼组织类器官及其衍生细胞系的制备方法，其特征在于，所述视网膜后代细胞包括色素上皮细胞、视细胞、神经节细胞、无长突细胞、双极细胞、水平细胞、穆勒神经胶质细胞。

3.一种眼组织类器官及其衍生细胞系，其特征在于，所述眼组织类器官及其衍生细胞系由权利要求1-2任一项所述的眼组织类器官的制备方法制备而成。

4.一种如权利要求3所述的眼组织类器官及其衍生细胞系的应用，其特征在于，所述眼组织类器官及其衍生细胞系作为制备治疗眼相关疾病药物的应用。