CN114752565B - 带有免疫细胞的视网膜类器官及其构建方法 - Google Patents
带有免疫细胞的视网膜类器官及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了带有免疫细胞的视网膜类器官及其构建方法。本发明所提供的带有免疫细胞的视网膜类器官的构建方法，包括如下步骤：提供体外分化培养约10～90天的视网膜类器官或其前体；提供小胶质细胞；将所述视网膜类器官或其前体与所述小胶质细胞在含血清培养基中共培养，由此得到带有免疫细胞的视网膜类器官，所述视网膜类器官或其前体选自视网膜祖细胞、视泡结构和成熟的视网膜类器官。本发明方法构建的带有免疫细胞的视网膜类器官，弥补了视网膜类器官与小胶质细胞因为分化来源不同，给现有的视网膜类器官带来的缺陷。小胶质细胞整合在视网膜类器官，从而提供了一种更加接近于天然视网膜的视网膜类器官。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，特别地涉及带有免疫细胞的视网膜类器官及其构建方法。
背景技术
视网膜，又称外周脑，由间脑的眼区发育而来，其具有感光和初步处理视觉信息的功能。一直以来，人们认为血脑屏障作为坚实的保护层为视网膜提供免疫豁免的环境，但其实与大脑类似，视网膜中也存在免疫反应，而小胶质细胞就是视网膜中主要的免疫细胞。小胶质细胞是视网膜和大脑中重要的常驻免疫效应细胞，对维持中枢神经系统发育以及退行性病变进程均具有重要作用。它们不仅能分泌转化生长因子β(TGF-β)等调节其他胶质细胞的功能和神经细胞数量，而且可以通过分泌神经生长因子和吞噬功能调节神经细胞的生长和凋亡。在受损伤的视神经或脊髓中，移植新的小胶质细胞可以显著改善神经纤维的创伤后再生。
成体中的小胶质细胞分布于视网膜的感光细胞层以内，但成体内的组织难以获取且不可再生，不利于视网膜疾病的研究及相应治疗方案的进展，因此出现了体外培养的视网膜类器官，视网膜类器官由多能干细胞(人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞)分化而来。从2012年Yoshiki Sasai第一个利用人胚胎干细胞分化为神经视网膜开始，分化视网膜类器官的方法已经很多，主要分为完全3D的分化方法和2D/3D相结合的方法。体外3D培养能更好地模拟体内视网膜的发育及生存状态。这些方法都需要经历拟胚体阶段，神经诱导阶段，视泡阶段及最后的成熟阶段。但是，由于视网膜由外胚层分化而来，小胶质细胞由中胚层分化而来，从这些体外分化方法得到的视网膜类器官都不具有与体内一致的免疫系统，也就是说，目前的视网膜类器官中并没有小胶质细胞的存在，这必然会对视网膜类器官的发育和疾病模拟带来一定的偏差。
因此，体外构建一个具有免疫功能的视网膜体系是完善体外视网膜类器官模型，使视网膜类器官更接近视网膜器官的重要一步。
已经有研究团队构建了体外中枢神经细胞与免疫细胞的共存体系。例如Haenseler,W等在2017年发表了小胶质细胞与脑细胞共培养的体系("A Highly EfficientHuman Pluripotent Stem Cell Microglia Model Displays a Neuronal-Co-culture-Specific Expression Profile and Inflammatory Response."Stem Cell Reports 8:1727-1742)，将分化成熟的小胶质细胞重悬而后加入生长了7天的神经细胞中，然后共培养14天，以此构建了具有免疫反应的共培养体系。在Haenseler,W的共培养体系中，采用的是2D的培养方式，神经细胞和小胶质细胞均为贴壁生长的细胞，因此完全无法模拟体内细胞的空间位置，无法模拟免疫细胞的空间定位，也就无法真实反应体内中枢系统中免疫细胞的作用方式。
因此，对于其中的免疫细胞能够尽可能真实地模拟体内细胞的空间位置的体外视网膜类器官，存在着需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的是提供一种其中的小胶质细胞能够自主增殖和定位的视网膜类器官，以及该带有免疫细胞的视网膜类器官的构建方法。
本发明所提供的带有免疫细胞的视网膜类器官的构建方法，包括如下步骤：
提供体外分化培养约10～90天、优选30～60天、更优选40～50天的视网膜类器官或其前体；提供小胶质细胞；将所述视网膜类器官或其前体与所述小胶质细胞在含血清培养基中共培养，由此得到带有免疫细胞的视网膜类器官，所述视网膜类器官或其前体选自视网膜祖细胞、视泡结构和成熟的视网膜类器官。
优选地，所述小胶质细胞衍生自多能干细胞，并且/或者所述视网膜类器官或其前体衍生自多能干细胞。
优选地，将所述视泡结构在含血清培养基中培养约7天，由此获得成熟的视网膜类器官。
优选地，通过包括如下步骤的方法获得所述视泡结构：(A.1)将多能干细胞在神经分化培养基中培养约10～17天，由此形成视网膜祖细胞；(A.2)将所述视网膜祖细胞用消化酶分散后，在视泡形成培养基中培养约7天，由此获得视泡结构。
优选地，通过包括如下步骤的方法获得所述视泡结构：(B.1)将多能干细胞在Rock通路抑制剂的存在下，在视网膜类器官分化培养基1中培养约2天，由此获得拟胚体；(B.2)向所述拟胚体中加入包被胶培养约10天，拟胚体在视网膜类器官分化培养基1中向神经外胚层分化；(B.3)将视网膜类器官分化培养基1更换为视网膜类器官分化培养基2，培养约6天，由此获得视泡结构。
优选地，将所述小胶质细胞和所述视网膜类器官或其前体按10000：1～500000：1，更优选50000：1～250000：1的数量比加入含血清培养基中。
优选地，将所述小胶质细胞按1x104～1x105/cm2的密度，并且将所述视网膜类器官或其前体按0.2～1/cm2的密度一起共培养。
所述含血清培养基是增补有牛磺酸、视黄酸和视黄醛中的一种或多种的含血清培养基。
所述共培养包括将小胶质细胞(1)与分化约10～17天的视网膜祖细胞在视泡培养基中共培养，贴壁生长约7天，再在含血清培养基中共培养，或者(2)与分化约17～24天的视泡结构在含血清培养基中共培养，或者(3)与分化约24～90天的成熟的视网膜类器官在含血清培养基中共培养，由此得到带有免疫细胞的三维视网膜类器官。
优选地，所述共培养持续至少3天。
所述方法制备得到的带有免疫细胞的视网膜类器官也属于本发明的保护范围。
所述的带有免疫细胞的视网膜类器官在制备用于治疗视网膜相关疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明构建的带有免疫细胞的视网膜类器官，弥补了视网膜类器官与小胶质细胞因为分化来源不同，给现有的视网膜类器官带来的缺陷。具有小胶质细胞的视网膜类器官能更健康的发育生长。在本发明的共培养方法中，小胶质细胞能够在视网膜类器官中自主增殖与定位，其空间定位与体内视网膜中小胶质细胞的空间位置基本上完全一致，从而提供了一种更加接近于天然视网膜的视网膜类器官。
附图说明
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
图1为视网膜类器官分化培养方法示意图，其中灰色箭头标识出本发明可以开始共培养的阶段。
图2为分化得到的小胶质细胞。
图3为2D/3D相结合的方法在分化第10～17天时，混合小胶质细胞和视网膜祖细胞并共培养7天，圆圈中为2D培养的视网膜祖细胞，黑色箭头为小胶质细胞。
图4为2D的视网膜祖细胞消化内卷为3D悬浮培养的早期视泡结构，小胶质细胞被内卷进入早期视泡结构内；黑色箭头为小胶质细胞。
图5为对共培养14天的视网膜类器官进行免疫荧光的团块染色结果；IBA为小胶质细胞的特异性标签蛋白，可以观察到小胶质细胞已经进入视网膜类器官团块中。
图6为完全3D悬浮培养(方法B)的视网膜类器官在第25-50天悬浮培养过程中，加入小胶质细胞共培养，左边为小胶质细胞，图中白色箭头为进入视网膜类器官的小胶质细胞。
图7为小胶质细胞在视网膜类器官中的3D成像。
图8为共培养77天后的团块免疫荧光染色结果。
图9为共培养77天后的小胶质细胞定位结果。
图10为共培养14天后，对整合了小胶质样细胞的视网膜类器官进行冰冻切片的免疫染色结果。
具体实施方式
目前的视网膜类器官由于分化来源不同，不能分化在视网膜中扮演重要角色的免疫细胞，即视网膜小胶质细胞。本发明利用现有技术分别分化出视网膜类器官和小胶质细胞，然后采用完全3D或2D/3D相结合的方式培养出具有小胶质细胞的视网膜类器官。
一、小胶质细胞
对于能够用于本发明的小胶质细胞没有特殊限制。在一些实施方式中，小胶质细胞是从多能干细胞诱导分化得到的小胶质细胞样细胞。所述多能干细胞选自胚胎干细胞和诱导的多能干细胞。所述多能干细胞可商购或通过本领域常规方法制备，例如从血液、真皮组织或尿液中分离体细胞，然后进行细胞重编程，从而得到诱导的多能干细胞，或者从未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取人胚胎干细胞。在本发明中，小胶质细胞和小胶质细胞样细胞可以互换使用。
可以使用本领域中已知的任何分化方法来获得适用于本发明的小胶质细胞，例如参考文献(1.Haenseler W,Sansom SN,Buchrieser J,Newey SE,Moore CS,Nicholls FJ,et al.A Highly Efficient Human Pluripotent Stem Cell Microglia Model Displaysa Neuronal-Co-culture-Specific Expression Profile and InflammatoryResponse.Stem Cell Reports.2017；8(6):1727-42.2.Chen SW,Hung YS,Fuh JL,ChenNJ,Chu YS,Chen SC,et al.Efficient conversion of human induced pluripotentstem cells into microglia by defined transcription factors.Stem CellReports.2021；16(5):1363-80.)中记载的那些方法。
作为举例，小胶质细胞的分化包括如下步骤：
1)将多能干细胞扩增培养至第4天，约80％的密度，用0.5mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液1mL处理5分钟；
2)用拟胚体形成培养基重悬加入Rock通路抑制剂后形成悬浮的大小均一的拟胚体；
3)将所述悬浮细胞团转移至盛有单核细胞诱导分化培养基的培养容器，优选包被的培养容器中，进行诱导分化，得到悬浮的单核细胞和贴壁细胞；以及
4)收集所述单核细胞，并置于小胶质细胞诱导分化培养基中培养，收集未粘壁细胞，即得小胶质细胞样细胞。
其中，拟胚体形成培养基为本领域中常规使用的那些，可商购或由本领域技术人员根据需要配制。单核细胞诱导分化培养基包含至多三种、优选两种选自碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素3(IL-3)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的细胞因子，优选地，所述细胞因子包含或仅包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素3(IL-3)的组合。所述单核细胞诱导分化培养基中使用的细胞因子的浓度各自独立地选自10-200ng/ml，优选20-100ng/ml，更优选25-50ng/ml，例如所述单核细胞诱导分化培养基包含50-100ng/ml、优选50ng/ml的M-CSF和20-25ng/ml、优选25ng/ml的IL-3。所述小胶质细胞诱导分化培养基包含至多三种、优选两种选自巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素34(IL-34)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的细胞因子，优选地，所述细胞因子包含或仅包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素34(IL-34)的组合。所述小胶质细胞诱导分化培养基中使用的细胞因子的浓度各自独立地选自40-200ng/ml，优选60-160ng/ml，更优选80-120ng/ml，最优选100ng/ml。
二、视网膜类器官
适用于本发明的视网膜类器官也可以通过常规方法得到。目前已知的视网膜类器官的分化方法包括两种：其中方法A包括视网膜祖细胞形成阶段、视泡形成阶段以及视网膜类器官成熟阶段；方法B包括拟胚体阶段、神经诱导阶段、视泡形成阶段、以及视网膜类器官成熟阶段(图1)。
在一些实施方式中，通过包括以下步骤的方法分化得到视网膜类器官：A.0、提供多能干细胞，将其扩增至一定密度后采用消化酶消化成多能干细胞团(每个细胞团10个左右细胞)；A.1、向步骤A.0获得的多能干细胞团加入包被胶包裹后，加入神经分化培养基，悬浮培养约10～17天后细胞团贴壁生长，由此获得贴壁生长的视网膜祖细胞；A.2、向步骤A.1获得的视网膜祖细胞中加入消化酶消化后，加入视泡形成培养基，培养约7天(即分化17～24天)，由此获得视泡结构；A.3、向步骤A.2获得的视泡中加入含血清培养基，培养约7天，由此获得成熟的视网膜类器官。
在又一些实施方式中，通过包括以下步骤的方法分化得到视网膜类器官：B.0、提供多能干细胞，将其扩增至一定密度后采用消化酶消化成单个多能干细胞的群；B.1、向步骤B.0获得的单个多能干细胞的群中加入视网膜类器官(RO)分化培养基1和Rock通路抑制剂，培养约2天获得拟胚体；B.2、向步骤B.1中加入包被胶培养约10天，拟胚体在RO分化培养基1中向神经外胚层分化；B.3、将RO分化培养基1更换为RO分化培养基2，培养约6天，由此获得视泡结构；B.4、将视泡结构移至悬浮培养皿中用含血清培养基培养约7天，即可获得成熟的视网膜类器官。
其中神经分化培养基、视泡形成培养基、RO分化培养基1、RO分化培养基2和含血清培养基为本领域中常规使用的那些，可商购或由本领域技术人员根据需要配制。
三、共培养
发明人通过实验发现，体外分化的RGC(视网膜神经节细胞)在30天到60天之间最多，而小胶质细胞参与调节神经节细胞的修剪，可以调控视网膜神经节细胞的细胞密度，使小胶质细胞准确定位在外丛状层以内，从而与体内一致，所以本发明选择使用年轻的视网膜类器官或其前体与小胶质细胞共培养。具体而言，本发明选择使用分化约10～90天，优选30～60天，最优选40～50天的视网膜类器官或其前体与小胶质细胞共培养。
因此，本发明的方法包括：(1)提供体外分化培养约10～90天的视网膜类器官或其前体；(2)提供小胶质细胞；(3)将所述视网膜类器官或其前体与所述小胶质细胞在含血清培养基中共培养，由此得到带有小胶质细胞的视网膜类器官。
体外分化培养约10～90天的视网膜类器官或其前体例如是体外分化约10～17天、17～24天、24～31天、31～38天、38～45天、45～52天、52～59天、59～66天、66～73天、73～80天、80～87天的视网膜类器官或其前体，例如视网膜祖细胞、视泡结构和成熟的视网膜类器官。
当在本发明中使用时，“分化”或“分化培养”一定天数的视网膜类器官或其前体指的是从多能干细胞开始分化的天数。例如，采用方法A分化培养30天的视网膜类器官是指将所述多能干细胞与神经分化培养基接触的当天记为第0天，其分化约10天形成视网膜祖细胞(分化10天的视网膜祖细胞)，后续在视泡形成培养基中培养约7天形成视泡结构(分化17天的视泡结构)，然后在含血清培养基中培养约13天，得到所述分化培养30天的视网膜类器官。
术语“约”在本发明中结合天数使用时，指的是±3天、优选±2天、更优选±1天。
如图1中灰色箭头所示，可以在视网膜类器官分化的不同阶段进行与成熟小胶质细胞的共培养。当在视泡结构阶段或视网膜类器官阶段加入小胶质细胞时，所述共培养是完全3D培养。当在视网膜祖细胞阶段加入小胶质细胞时，小胶质细胞会和视网膜祖细胞一起先贴壁生长，而后经消化酶消化贴壁生长的细胞，形成带有小胶质细胞的视泡结构，再向所述视泡结构中加入含血清培养基进行共培养，因此，这样的共培养方式是2D/3D结合培养。
本发明的共培养均是在含血清培养基中进行。在优选实施方式中，所述含血清培养基增补有一种或多种在视网膜发育中比较重要的营养成分，例如牛磺酸、视黄酸、视黄醛或其任一组合。
通常将小胶质细胞和视网膜类器官或其前体按10000：1～500000：1，优选50000：1～250000：1，更优选100000：1～200000：1的数量比加入含血清培养基中。在另一些实施方式中，将小胶质细胞按1x104～1x105细胞/cm2的密度，优选5x104细胞/cm2的密度，并且将所述视网膜类器官或其前体按0.2～1细胞/cm2的密度混合共培养。
发明人发现：共培养的比例会影响小胶质细胞的进入，过高或过低都有可能导致小胶质细胞无法进入。
共培养需要持续至少3天，以便小胶质细胞能够进入视网膜类器官内。本领域技术人员知道，体外类器官可以培养长达700天，因此对于本发明的共培养时间的最长时长没有特别限制。本领域技术人员可以根据实验需求决定停止时间。需要观察RGC就可以共培养时间短至一个月，研究光感受器细胞就可以延长至一年。
在本发明的方法中，共培养期间每周换液，使得小胶质细胞在进入视网膜类器官之后保持增殖，更真实地模拟了体内小胶质细胞的动态增殖和定位行为，使其空间定位与体内视网膜中小胶质细胞的空间位置完全一致。因此，在又一些实施方式中，本发明还提供了一种带有免疫细胞的视网膜类器官，所述带有免疫细胞的视网膜类器官通过如上所述的方法获得。这样的视网膜类器官更加接近于天然视网膜，可通过移植用于治疗视网膜相关疾病，例如年龄相关性黄斑病变、视网膜色素变性。
下面将结合实施例对本发明进行详细描述。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在下文中描述了示例性的方法和材料，但与本文中描述的相似或等同的方法和材料均可用于本发明的实施。具体的材料、方法和实例仅仅是说明性的，不打算必定是限制性的。
实施例
实验材料：
实施例1、小胶质细胞分化与培养
(1)细胞准备：在hiPSC培养基中培养多能干细胞(iPSC)培养至传代当天，汇合度达到大约80％，准备至少3个孔，形态状态饱满。
(2)iPSC分化成拟胚体EB(D0-D4)
a)吸走hiPSC培养基，用EDTA洗一遍，吸走EDTA，再加入EDTA消化5分钟(3～6个孔)。
b)取无粘附六孔板1个，加6mL iPS base+6μL Y27632于一个孔中。为了保证数量足够，把3～6个孔的细胞保存在一个孔里。
c)消化结束，吸走EDTA，每个孔中加入1mL iPS base培养基。拍打使细胞脱落，不要吹打，镜下观察脱落细胞呈块状。
d)将3～6个孔的细胞用10mL移液管全部转移到无粘附六孔板1号孔中，摇晃使细胞聚集于培养皿中央，标记D0，放入培养箱。
iPS base培养基成分及浓度
(3)EB分化形成单核细胞(D4-D25)
单核细胞培养基成分及浓度
a)配液：按照以上成分配制单核细胞培养基。
b)准备无粘附10cm孔板一个，铺明胶30分钟以上。
c)回收明胶，加入10mL单核细胞培养基，以及4μL M-CSF(125μg/mL)和5μL IL3(50μg/mL)。
d)用10mL移液管将EB转移到15mL离心管中，待细胞自然沉降后，吸走上清液。
e)吸取部分孔板中的培养基于离心管中重悬EB，最后转移至无粘附10cm孔板中。
f)EB将会贴壁生长分化，以后每7天换液1次，第一周尽量不要动孔板。
(4)单核细胞分化形成小胶质细胞(D21-D35)
a)配液：按照以下成分配制NR培养基。
NR培养基成分及浓度
g)准备无粘附六孔板一块，IL34，MCSF，滤膜。
h)将单核细胞上清收集起来，转移至15mL离心管中，利用离心机离心200g，5分钟。原培养基里加入新鲜的单核细胞培养基。
i)离心完取出离心管，吸弃上清，用NR培养基重悬细胞。
j)每孔加2mL培养基，加入2μL IL34(100μg/mL)和1.6μL MCSF(125μg/mL)，再把重悬的细胞加入培养基，维持培养大约7～14天(图2)。
实施例2、视网膜类器官分化与培养(方法A)
1)在干细胞培养基(中盛溯源)中将多能干细胞扩增培养至约第4天，约80％的密度，采用分散酶(中性蛋白酶)溶液置于37℃培养箱消化5分钟；
2)第0天，加入神经分化培养基，用1μL枪头在皿底划线，将每个细胞克隆分成6～9个小块，而后用细胞刮把所有细胞刮起来，悬浮于神经分化培养基中；
3)离心后弃上清加入250μL包被胶混匀，置于37℃细胞培养箱20分钟；
4)加入神经分化培养基吹打被胶包裹的细胞，以形成一个胶块中3～4个细胞团块，培养至约第10～17天，在此阶段悬浮的细胞团会贴壁形成一个个细胞克隆(图3)，即视网膜祖细胞；
5)加入分散酶溶液置于37℃培养箱消化5分钟，细胞边缘稍稍卷起，加入视泡形成培养基，细胞会全部卷起形成悬浮的早期视泡结构；
6)在视泡培养基中生长约7天后，将培养基换成成熟分化培养基。
神经分化培养基成分及浓度
视泡形成培养基成分及浓度
成熟分化培养基成分及浓度
实施例3、视网膜类器官分化与培养(方法B)：
1)将多能干细胞扩增培养至约第4天，约80％的密度，细胞形态良好。
2)用DPBS洗一遍，加入TrypLE Select消化细胞成单细胞并用血细胞计数板计数大约100,000个细胞每毫升。
3)取10mL RO分化培养基1，加入20μL Y27632，混匀细胞，加入到10cm无粘附皿中，通过排枪，将细胞分装至96孔V形底的板子，每孔100μL，记为第0天。
4)第2天，在RO分化培养基1中加入6％的matrigel，每孔加入20μL，增加细胞营养。
5)第6天，用排枪吸出一半的培养基，然后加入新鲜的培养基。
6)第12天，更换为RO分化培养基2，从96孔板中吸出，转移到10cm皿中培养。
7)第18天，用眼科手术刀切连在一起的团块，一个团块可以切分成4-8个小团块，换成NR培养基培养。继续在NR培养基中培养至多60天。
RO分化培养基1成分及浓度
RO分化培养基2成分及浓度
实施例4、构建具有免疫细胞的视网膜类器官
1、完全3D培养
收集实施例1中步骤4)获得的成熟的小胶质细胞样细胞，以5x104细胞/cm2的密度加入实施例3中步骤7)获得的视网膜类器官(0.2～1/cm2)中，在NR培养基中共培养，每周换液一次。
48小时可见小胶质细胞进入视网膜类器官中(图6)。共培养12天、39天及61天时对整合了小胶质样细胞的视网膜类器官进行3D成像(图7)。共培养至77天时，切片染色可见小胶质细胞均匀分布(图8)，且定位准确(图9)。
2、2D/3D结合培养
1)2D培养：收集实施例1中步骤4)获得的成熟的小胶质细胞样细胞，以5x104细胞/cm2的密度加入实施例2中步骤4)的视网膜祖细胞(0.2～1细胞/cm2)中，与贴壁展开生长的视网膜祖细胞一起贴壁生长约7天(图3)，而后一起消化形成带有小胶质细胞的早期视泡结构(图4)；
2)3D培养：向带有小胶质细胞的早期视泡结构中加入成熟分化培养基进行共培养。
14天后，对整合了小胶质样细胞的视网膜类器官进行团块的3D染色成像，小胶质细胞特异性标志物显示出小胶质的形态与定位(图5)；同时还对整合了小胶质样细胞的视网膜类器官进行冰冻切片的免疫染色，可见整合了小胶质细胞后，视网膜光感受器祖细胞的迁移优于未整合小胶质的视网膜类器官，且视网膜神经节细胞的数量得到了修剪(图10)。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。
Claims (8)
1.带有免疫细胞的视网膜类器官的构建方法，包括如下步骤：
提供体外分化培养10～17天的视网膜祖细胞；提供小胶质细胞；将所述小胶质细胞和所述视网膜祖细胞在含血清培养基中共培养，所述小胶质细胞与贴壁展开生长的视网膜祖细胞一起贴壁生长，而后一起消化形成带有小胶质细胞的早期视泡结构；向所述带有小胶质细胞的早期视泡结构中加入成熟分化培养基进行共培养，由此得到带有免疫细胞的视网膜类器官。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述小胶质细胞衍生自多能干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述视网膜祖细胞衍生自多能干细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：将所述多能干细胞在神经分化培养基中培养10～17天，由此形成视网膜祖细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述小胶质细胞与贴壁展开生长的视网膜祖细胞一起贴壁生长7～14天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：向所述带有小胶质细胞的早期视泡结构中加入成熟分化培养基进行共培养的天数是7～14天。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于：将所述小胶质细胞按1x104～1x105细胞/cm2的密度，并且将所述视网膜祖细胞按0.2～1细胞/cm2的密度一起共培养。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含血清培养基是增补有牛磺酸、视黄酸和视黄醛中的一种或多种的含血清培养基。
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