CN114426951B - 利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法，包括培养干细胞、接种、培养、悬浮培养、单核细胞诱导和小胶质细胞诱导的过程。该方法简便、高效，获得的小胶质细胞样细胞不但与体内的小胶质细胞表达类似蛋白，还具有类似功能；且，由该方法获得的小胶质细胞样细胞纯度高达90％。

Description

利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，更具体地说是涉及一种利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法。
背景技术
小胶质细胞是神经组织中重要的免疫效应细胞，在中枢神经系统发育和退行性病变过程中均发挥重要作用。它们不仅能分泌转化生长因子β(TGF-β)等调节星形胶质细胞的功能和细胞数量，而且可以通过分泌神经生长因子和吞噬功能调节神经细胞的生长和凋亡。在受损伤的视神经或脊髓中，移植新的小胶质细胞可以显著改善神经纤维的创伤后再生。然而，虽然小胶质细胞有上述功能，但是其在神经系统中数量有限，无论是将其从组织中分离或是在组织原位研究都存在着不小的难度。因此，小胶质细胞的再生，不仅为研究其与神经细胞或其他胶质细胞的相互作用提供体外模型，而且还能为移植治疗神经损伤提供细胞来源。
干细胞是一类具有分化为所有类型体细胞潜能的细胞，利用干细胞进行组织再生和替代有望在未来解决多项医学难题。人多能干细胞(即hPSC)包括人胚胎干细胞(即hES细胞)或诱导的多能干细胞(即iPS细胞)。
从2015年开始，国内外就有多个课题组研发通过添加细胞因子诱导干细胞分化为小胶质细胞样细胞，但这些方法有些过于繁琐，需要用到6种以上的重组蛋白，或者需要通过流式细胞术将小胶质细胞前体细胞分选出来，再进一步分化，得到细胞的难度增加，而且纯度大大降低。
例如，Ohgidani等人(Ohgidani M.等，Direct induction of ramifiedmicroglia-like cells from human monocytes:Dynamic microglial dysfunction inNasu-Hakola disease.Sci Rep.,14；4:4957(2014).)开发了一种方法，其将从外周血分离的人单核细胞分化成小胶质细胞样细胞。但是，该过程需要大量的细胞，从而限制了该方法的应用。Muffat等人(Muffat J.等，Efficient derivation of microglia-like cellsfrom human pluripotent stem cells.Nat Med.,22:1358-1367(2016).)从人诱导的多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ESC)诱导小胶质细胞样细胞，其利用多能干细胞的分化潜能诱导卵黄囊中间体，随后它们分化成小胶质细胞样细胞。然而该方法非常费力，需要复杂的步骤，并且需要近3个月的时间。WO2018200669A1公开了一种从纯化的造血干细胞诱导小胶质细胞样细胞的方法，但是该方法需要进行流式细胞分选以及扩增，并且应用了6种以上的细胞因子(例如SCF、TPO、Flt-3、IL-3、SR1、UM171、M-CSF、GM-CSF、IL-34)，而且分化周期长，且收获仅为一批细胞。
因此，如何提供一种简便、快速的利用多能干细胞分化小胶质细胞样细胞的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供了一种利用多能干细胞制备小胶质细胞的方法，所述方法包括：
1)提供多能干细胞(例如人多能干细胞)，所述多能干细胞选自胚胎干细胞和诱导的多能干细胞，对所述多能干细胞进行扩增并形成包含小细胞团的干细胞悬液；
2)在拟胚体形成培养基中对所述多能干细胞进行悬浮培养以形成悬浮细胞团；
3)将所述悬浮细胞团转移至盛有单核细胞诱导分化培养基的培养容器，优选包被的培养容器中，进行诱导分化，得到悬浮的单核细胞和贴壁细胞；
优选地，所述单核细胞诱导分化培养基包含至多三种、优选两种选自碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素3(IL-3)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的细胞因子，优选地，所述细胞因子包含或仅包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素3(IL-3)的组合；并且还优选地，
所述单核细胞诱导分化培养基中使用的细胞因子的浓度各自独立地选自10-200ng/ml，优选20-100ng/ml，更优选25-50ng/ml，例如所述单核细胞诱导分化培养基包含50-100ng/ml、优选50ng/ml的M-CSF和20-25ng/ml、优选25ng/ml的IL-3；以及
4)收集所述单核细胞，并置于小胶质细胞诱导分化培养基中培养，收集未粘壁细胞，即得小胶质细胞样细胞；
优选地，所述小胶质细胞诱导分化培养基包含至多三种、优选两种选自巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素34(IL-34)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的细胞因子，优选地，所述细胞因子包含或仅包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素34(IL-34)的组合；并且还优选地，
所述小胶质细胞诱导分化培养基中使用的细胞因子的浓度各自独立地选自40-200ng/ml，优选60-160ng/ml，更优选80-120ng/ml，最优选100ng/ml。
优选地，在拟胚体形成培养基中对所述多能干细胞进行悬浮培养1天后，更换新的拟胚体形成培养基，然后继续培养，并且在步骤3)之前更换新的拟胚体形成培养基至少1次。例如在拟胚体形成培养基中在V型或U型底低粘附细胞培养板中培养1天后，得到干细胞细胞团，然后将所述干细胞细胞团转移至容积更大的悬浮培养容器中继续培养，得到所述悬浮细胞团。在优选情况下，在悬浮培养容器中培养1天后，更换新的拟胚体形成培养基并继续培养1、2、3、4、5或6天，例如3天。
优选地，本发明的方法还包括收集步骤3)的贴壁细胞并在单核细胞诱导分化培养基中持续培养，并定期或不定期收集诱导分化得到的单核细胞用于重复步骤4)。
在一种具体实施方式中，本发明的方法包括：
1)将选自胚胎干细胞和诱导的多能干细胞的多能干细胞培养至汇合度为80-90％，用EDTA消化后，将细胞吹散并溶于拟胚体形成培养基，得到干细胞悬液；
2)将所述干细胞悬液接种于低粘附V型或U型底细胞培养板中，并置于30-40℃、5％CO2的环境中培养1天，得到干细胞团；
3)将所述干细胞团转移至新的拟胚体形成培养基进行悬浮培养，并优选在培养1天后，更换新的拟胚体形成培养基并继续培养，由此得到悬浮细胞团；
4)将所述悬浮细胞团转移至盛有单核细胞诱导分化培养基且被包被的培养容器中，进行诱导分化，得到悬浮的单核细胞；
5)收集所述单核细胞，并置于小胶质细胞诱导分化培养基中培养6-8天，收集未粘壁细胞，即得小胶质细胞。
本发明还提供了一种适用于执行上述方法的试剂盒，所述试剂盒包括至少三种选自FGF-2、SCF、IL6、M-CSF、GM-CSF、IL-3和IL-34的用于诱导所述小胶质细胞样细胞的细胞因子和说明书。优选地，所述细胞因子包含或仅包含M-CSF、IL-3和IL-34并且所述说明书记载了符合本发明的方法。
进一步地，本发明提供了由所述方法制备得到的小胶质细胞样细胞及包含所述小胶质细胞样细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗视网膜疾病，例如糖尿病视网膜病变、青光眼或视网膜色素变性。
本发明的有益效果
本发明的方法简便、高效。所述方法不需要进行流式细胞分选以及扩增，并且最快可以在一个月左右得到小胶质细胞样细胞，同时在单核细胞阶段可以维持培养，收获多批细胞，所得细胞数量更多。
本发明获得的小胶质细胞样细胞不但与体内的小胶质细胞表达类似蛋白，还具有类似功能；而且，由该方法获得的小胶质细胞样细胞纯度高达90％。本发明提供的小胶质细胞样细胞可用于研究其与神经细胞或其他胶质细胞的相互作用，而且还能为移植治疗神经损伤提供细胞来源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的示例。
图1为将人胚胎干细胞hESCs-H9在TeSR-E8培养基中培养至汇合度为80-90％时的过程电镜图，其中1为人诱导多能干细胞hESCs-H9，2为拟胚体图，3为单核细胞图，4为小胶质细胞样细胞；
图2为hESCs分化来源的小胶质细胞样细胞(hES-MG)和hESCs分化的巨噬细胞表达特异性蛋白CX3CR1和IBA1的免疫染色结果示意图；1为/>表面CX3CR1的染色结果图，2为hES-MG表面CX3CR1的染色结果图，3为hES-MG表面IBA1的染色结果图；
图3为人胚胎干细胞hESCs诱导分化的小胶质细胞样细胞的形态图；
图4为人诱导多能干细胞hiPSCs诱导分化的小胶质细胞样细胞的形态图；
图5为小胶质细胞样细胞(MG)与巨噬细胞表达小胶质细胞特异性的表面蛋白TREM2、TMEM119、CD11b和P2RY12含量的对比图；
图6为以流式细胞仪检测小胶质细胞样细胞表达的特异性表面蛋白CD45和CD11b含量的示意图；
图7-1为细菌添加到小胶质细胞样细胞中5小时，小胶质细胞样细胞吞噬结果图；
图7-2为细菌添加到小胶质细胞样细胞中5小时，小胶质细胞样细胞吞噬结果的剖面图；
图7-3分别为细菌添加0h、0.5h、1h、2h、3h、4h后小胶质细胞样细胞吞噬结果图；
图8为验证实施例3分化的小胶质细胞样细胞是否能够对ATP刺激产生反应的结果示意图；
图9-1为分别以Poly I:C、分化的类器官(Organoid)和细菌(E.coli)刺激小胶质细胞样细胞后炎症因子IL-8的表达情况图；
图9-2为分别以Poly I:C、分化的类器官(Organoid)和细菌(E.coli)刺激小胶质细胞样细胞后炎症因子IL-1β的表达情况图；
图9-3为分别以Poly I:C、分化的类器官(Organoid)和细菌(E.coli)刺激小胶质细胞样细胞后炎症因子IL-6的表达情况图；
图9-4为分别以Poly I:C、分化的类器官(Organoid)和细菌(E.coli)刺激小胶质细胞样细胞后炎症因子IL-10的表达情况图；
图9-5为分别以Poly I:C、分化的类器官(Organoid)和细菌(E.coli)刺激小胶质细胞样细胞后炎症因子TNF-α的表达情况图；
图9-6为分别以Poly I:C、分化的类器官(Organoid)和细菌(E.coli)刺激小胶质细胞样细胞后炎症因子IL-12P70的表达情况图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法，所述多能干细胞选自胚胎干细胞和诱导的多能干细胞。
胚胎干细胞(简称ES细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
诱导的多能干细胞(iPS细胞)是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。分化的细胞在特定条件下被逆转后，恢复到全能性状态，形成胚胎干细胞系。目前可从血液、真皮组织或尿液中分离体细胞进行重编程，从而得到诱导的多能干细胞。
在一些实施方式中，在拟胚体形成培养基中对所述多能干细胞进行悬浮培养以形成悬浮细胞团，其中形成的悬浮细胞团又称拟胚体，是体外分化的关键步骤。在本申请中，术语“悬浮细胞团”和“拟胚体”可互换使用。
“拟胚体”(Embryoid bodies，EBs)可由胚胎干细胞或诱导的多能干细胞在体外一定的培养条件下形成，具有内、中、外三胚层结构，是在形态学上与哺乳动物早期的胚胎发育阶段有着很高相似度的一种球状结构。目前很多分化系统都是基于拟胚体分化体系建立的，如造血干细胞，自然杀伤细胞，神经干细胞，心肌细胞等，其分化策略都是先制备出EB，然后用不同的措施定向诱导分化为目的细胞.之所以经EB途径,目的是模拟体内胚胎发育过程,EB中内中外三胚层的细胞互相支持,互相提供分化生长的微环境。
本发明方法的特征在于首先从胚胎干细胞(ES)或诱导多能干细胞(iPS)形成拟胚体，由其分化形成单核细胞，再进而分化形成小胶质细胞样细胞。其中，“分化”是指细胞从一种细胞类型(例如多能或全能细胞)改变为更专门化的细胞类型(例如体细胞)的过程。
“单核细胞”是白细胞的一种，可以分化为巨噬细胞和髓系谱系树突细胞。作为脊椎动物先天免疫系统的一部分，单核细胞也影响适应性免疫的过程。单核细胞占人体所有白细胞的2％至10％，并在免疫功能中起多种作用。这些作用包括但不限于：在正常条件下补充常驻巨噬细胞；响应组织感染部位的炎症信号，在大约8-12小时内迁移；并分化为巨噬细胞或树突状细胞以产生免疫反应。在成年人中，一半的单核细胞被储存在脾脏中。
可以分化为单核细胞的细胞包括但不限于胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、造血干细胞或CD34+细胞。
“小胶质细胞”是位于整个大脑、骨髓和视网膜中的一种神经胶质细胞。神经胶质细胞是一种非神经元细胞，可维持体内稳态，形成髓鞘并为中枢神经系统和周围神经系统的神经元提供支持和保护。神经视网膜作为中枢神经系统的一部分，主要由排列有序的神经元及围绕其周围的胶质细胞包括大胶质细胞和小胶质细胞组成。在视网膜微环境中，小胶质细胞的迅速激活可以由外部或者内部因素造成的细微变化引起。小胶质细胞作为免疫效应细胞，对病理刺激反应迅速，可以由不同的分子触发激活，如脂多糖、补体成分、凝血酶、炎性细胞因子和趋化因子等。小胶质细胞在维持成人视网膜的功能和组织结构方面有着重要作用，包括但不限于作为中枢神经系统病理改变的传感器，保护神经元细胞免受炎症损害并介导组织再生，参与视网膜特异性免疫应答，还可以通过清除毒性副产物、病原体、外渗血清蛋白和细胞碎片，以及产生神经营养因子和抗炎细胞因子，起到对视网膜细胞有益的作用。已知小胶质细胞在糖尿病视网膜病变、青光眼和视网膜色素变性(例如原发性视网膜色素变性)等眼科疾病中发挥重要作用(王爱玲等，国外医学眼科学分册，2004年12月，第28卷第6期)。
“小胶质细胞样细胞”是指类似于小胶质细胞的细胞，例如其形态和生物学功能。例如，小胶质细胞样细胞可具有小胶质细胞的分支形态(长分支过程和小的细胞体)，并具有与小胶质细胞相当的生物学功能(例如，吞噬功能)。
在一些实施方式中，在形成拟胚体之前对多能干细胞进行扩增并形成包含小细胞团的干细胞悬液，所述小细胞团是5-7个细胞的小细胞团。可以通过本领域常规技术手段培养获得所述干细胞悬液，例如在细胞培养板中扩增然后用EDTA进行消化。
在一些实施方式中，在拟胚体形成培养基中对多能干细胞、优选干细胞悬液进行悬浮培养以形成悬浮细胞团。在优选实施方式中，在悬浮培养容器或非黏附型细胞培养容器中培养形成拟胚体。本发明使用的培养容器选自表面经过处理或未经处理的培养皿、板、瓶或管。本领域技术人员根据需要能够选择具有合适容积和表面性能的培养容器。
在又一些实施方式中，本发明的方法包括更换新的拟胚体形成培养基以促使拟胚体长大的步骤，例如在培养1天后、培养2天后或培养3天后更换一次、两次或三次培养基。其中拟胚体的培养一般不超过8天，优选不超过5天。
在本发明中使用的拟胚体形成培养基为本领域中常规使用的那些，可商购或由本领域技术人员根据需要配制。
本发明用于分化形成单核细胞的培养基包含至多三种、优选两种选自碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素3(IL-3)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的细胞因子，优选包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素3(IL-3)的组合，并任选额外包含FGF-2、SCF或IL-6。
碱性成纤维细胞生长因子(也称为FGF-2、bFGF)是有丝分裂蛋白FGF家族的成员。酸性FGF(FGF-1)和碱性FGF(FGF-2)是最早发现的两种FGF蛋白，其命名为酸性和碱性指的是它们的相对等电点。FGF-2可以从许多组织中分离得到，包括神经组织，肾上腺皮质，垂体，黄体和胎盘。FGF-2能刺激所有中胚层来源的细胞以及神经外胚层、外胚层和内胚层来源的细胞增殖。FGF-2还可诱导神经元分化、存活和再生，并调节胚胎的发育和分化。这些体外观察到的功能提示FGF可能在体内调节血管生成、伤口愈合和组织修复、胚胎发育和分化、神经功能和神经退行性变等过程中发挥作用。
SCF又称肥大细胞生长因子，已知SCF和其他细胞因子一起诱导干细胞和祖细胞增生、延长其存活期并引起干细胞和祖细胞动员。
白细胞介素在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中发挥重要作用。其中IL-6可调节多种细胞的生长与分化；IL-3可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化，又称为多重集落刺激因子和造血细胞生长因子。
M-CSF是一种具有谱系特异性的细胞因子,主要存在于骨髓腔内，对单核细胞的增殖、分化及维持其活性有重要作用。
在单核细胞诱导步骤中使用的多种细胞因子的浓度可以相同或不同，并且各自在10-200ng/ml、优选20-100ng/ml、更优选25-50ng/ml的范围内。在本发明的优选实施方式中，所述单核细胞诱导分化培养基包含50-100ng/ml、优选50ng/ml的M-CSF和20-25ng/ml、优选25ng/ml的IL-3。
在优选实施方式中，使用包被(例如明胶、胶原或多聚-D-赖氨酸包被)的培养容器进行单核细胞的诱导分化。在培养过程中，拟胚体贴壁生长，优选每周更换单核细胞分化培养基，3-4周后可以开始产生单核细胞，分泌出的单核细胞会悬浮于培养基中。
进一步的，本发明使用的小胶质细胞诱导分化培养基包含至多三种、优选两种选自M-CSF、白细胞介素34(IL-34)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的细胞因子，优选包含M-CSF和IL-34的组合，并任选额外包含GM-CSF。
IL-34具有增强单核细胞活力，调节髓样细胞生长分化，加速破骨细胞形成等功能，是小胶质细胞分化和成熟的关键的因子。
GM-CSF是一种造血生长因子，可刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的发育并促进早期红细胞巨核细胞和嗜酸性粒细胞祖细胞的增殖和发育。它可增强中性粒细胞的迁移。GM-CSF在炎症和自身免疫疾病中起着至关重要的作用。
在小胶质细胞诱导步骤中使用的多种细胞因子的浓度可以相同或不同，并且各自在40-200ng/ml、优选60-160ng/ml、更优选80-120ng/ml范围内。在本发明的优选实施方式中，所述小胶质细胞诱导分化培养基包含100ng/ml的M-CSF和100ng/ml的IL-34。优选地，在该步骤中使用的细胞因子的浓度高于单核细胞诱导步骤中使用的细胞因子的浓度。优选情况下，5至7天后可以观察到小胶质细胞样细胞出现，每周更换小胶质细胞诱导分化培养基，收集未粘壁细胞，即得小胶质细胞样细胞。
在优选实施方式中，对本发明获得的单核细胞维持培养以收获多批细胞。具体而言，在单核细胞诱导分化培养基中对步骤3)中的贴壁细胞持续培养，并定期或不定期收集诱导分化得到的单核细胞用于重复步骤4)。
本发明的方法最快可以在一个月左右得到小胶质细胞样细胞，同时在单核细胞阶段可以维持培养，收获多批细胞，所得细胞数量更多。
相应地，本发明还提供了一种用于从多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的试剂盒以及由上述方法产生的小胶质细胞样细胞。
本发明的方法适用于从任何多能干细胞制备小胶质细胞样细胞，优选哺乳动物多能干细胞，更优选人多能干细胞。所述多能干细胞可商购或通过本领域常规方法制备，例如从血液、真皮组织或尿液中分离体细胞，然后进行细胞重编程，从而得到诱导多能干细胞。
从以下实施例中将更充分地理解本发明的优点、特征和用途。实施例旨在说明本发明的益处并示例性描述本发明优选的实施方案，而不限制本发明的范围。
实施例
以下实施例中使用的培养基包括：
拟胚体形成培养基：78％Advanced DMEM/F12培养基(Invitrogen)、1％青霉素和链霉素的混合物(Invitrogen)、20％KSR(Gibco)和1％Glutamix(Invitrogen)。
单核细胞诱导分化培养基：98％X-Vivo 15(LONZA)、1％青霉素和链霉素的混合物(Invitrogen)和1％Glutamix(Invitrogen)，50ng/ml hrM-CSF(R&D system)、25ng/mlhrIL-3(R&D system)。
巨噬细胞诱导分化培养基：88％RPMI 1640培养基(SIGMA)、1％青霉素和链霉素的混合物(Invitrogen)、10％FBS(Gibco)、1％Glutamix(Invitrogen)、100ng/ml hrM-CSF(R&D system)。
小胶质细胞诱导分化培养基：88％DMEM/F12培养基(Invitrogen)、1％青霉素和链霉素的混合物(Invitrogen)、10％FBS(Gibco)、1％Glutamix(Invitrogen)、100ng/ml hrM-CSF(R&D system)和100ng/ml hrIL-34(PeproTech)。
实施例1：从人胚胎干细胞hESCs-H9制备小胶质细胞样细胞
一种利用人多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法，包括下述步骤：
1)培养干细胞：
(11)将人胚胎干细胞hESCs-H9在TeSR-E8培养基中培养至汇合度为80-90％，如图1所示；
(12)先向步骤(11)得到的80-90％汇合度的干细胞中加入1-2ml 0.5μM EDTA消化3min后，去除消化液，然后将细胞吹散，并溶于3-5ml拟胚体形成培养基，得到干细胞悬液；
2)接种、培养：
(21)将步骤1)得到的干细胞悬液按照12000-20000细胞/孔的接种量接种于低粘附V型底96孔板中，并于30℃、5％CO2环境中培养一天，得到干细胞细胞团；
(22)将步骤(21)得到的干细胞细胞团转移至盛有8ml拟胚体形成培养基的10cm悬浮培养皿中进行悬浮培养，培养1天后，将细胞团转移至含有10ml新的拟胚体形成培养基的10cm悬浮细胞培养皿，继续培养3天。得到悬浮细胞团；
3)单核细胞诱导：将步骤(22)得到的悬浮细胞团转移至盛有8-10ml单核细胞诱导分化培养基且以5-10ml 0.1％明胶包被的培养皿中，进行诱导分化，悬浮细胞团转为贴壁生长，培养21天后，得到悬浮的单核细胞；
4)小胶质细胞诱导：收集步骤3)中的单核细胞，并将其放于2ml小胶质细胞诱导分化培养基中培养6天，收集未粘壁细胞，即得小胶质细胞样细胞；收集步骤3)中的贴壁细胞，重复上述步骤3)-4)的过程。
实施例2：从人诱导多能干细胞hiPSCs制备小胶质细胞样细胞
1)培养干细胞：
(11)将人诱导多能干细胞hiPSCs在TeSR-E8培养基中培养至汇合度为80-90％；
(12)先向步骤(11)得到的80-90％汇合度的干细胞中加入1-2ml 0.5μM EDTA消化7min后，去除消化液，然后将细胞吹散，并溶于3-10ml拟胚体形成培养基，得到干细胞悬液；
2)接种、培养：
(21)将步骤1)得到的干细胞悬液按照12000-20000细胞/孔的接种量接种于低粘附V型底96孔板中，并于37℃、5％CO2环境中培养一天，得到干细胞细胞团；
(22)悬浮培养：将步骤(21)得到的干细胞细胞团转移至盛有10ml拟胚体形成培养基的10cm悬浮培养皿中进行悬浮培养，培养1天后，将细胞团转移至含有10ml新的拟胚体形成培养基的10cm悬浮细胞培养皿，继续培养3天。得到悬浮细胞团；
3)单核细胞诱导：将步骤(22)得到的悬浮细胞团转移至盛有10ml单核细胞诱导分化培养基且以5-10ml 0.1％明胶包被的培养皿中，进行诱导分化，悬浮细胞团转为贴壁生长，培养21-60天后，得到悬浮的单核细胞；
4)小胶质细胞诱导：收集步骤3)中的单核细胞，并将其放于3ml小胶质细胞诱导分化培养基中培养8天，收集未粘壁细胞，即得小胶质细胞样细胞；收集步骤3)中的贴壁细胞，重复上述步骤3)-4)的过程。
实施例3：从人胚胎干细胞hESCs-H9制备小胶质细胞样细胞
1)培养干细胞：
(11)将人胚胎干细胞hESCs-H9在TeSR-E8培养基中培养至汇合度为80-90％；
(12)先向步骤(11)得到的80-90％汇合度的干细胞中加入1.5ml 0.5μM EDTA消化5min后，去除消化液，然后将细胞吹散，并溶于10ml拟胚体形成培养基，得到干细胞悬液；
2)接种、培养：
(21)将步骤1)得到的干细胞悬液按照12000-20000细胞/孔的接种量接种于低粘附V型底96孔板中，并于37℃、5％CO2环境中培养一天，得到干细胞细胞团；
(22)将步骤(21)得到的干细胞细胞团转移至盛有9ml拟胚体形成培养基的10cm悬浮培养皿中进行悬浮培养，培养1天后，将细胞团转移至含有10ml新的拟胚体形成培养基的10cm悬浮细胞培养皿，继续培养3天。得到悬浮细胞团；
3)单核细胞诱导：将步骤(22)得到的悬浮细胞团转移至盛有9ml单核细胞诱导分化培养基且以5-10ml 0.1％明胶包被的培养皿中，进行诱导分化，悬浮细胞团转为贴壁生长，培养21-60天后，得到悬浮的单核细胞；
4)小胶质细胞诱导：收集步骤3)中的单核细胞，并将其放于3ml小胶质细胞诱导分化培养基中培养7-10天，收集未粘壁细胞，即得小胶质细胞样细胞；收集步骤3)中的贴壁细胞，重复上述步骤3)-4)的过程。
实施例4：与从人胚胎干细胞hESCs-H9制备的巨噬细胞的比较
1、诱导hESCs分化的巨噬细胞
部分巨噬细胞和小胶质细胞在发育来源上是同源的，均来源于卵黄囊，小胶质细胞只是分布在大脑和视网膜等神经组织中，而巨噬细胞则分布于其他组织中。为了区分本方法分化的是小胶质细胞而非巨噬细胞，对这两种细胞加以区分。
(1)步骤同实施例3步骤1)-3)；
(2)收集培养基中的单核细胞，培养于巨噬细胞诱导分化培养基。贴壁细胞继续培养于单核细胞诱导分化培养基，每周收集一次单核细胞；
(3)在巨噬细胞诱导分化培养基中培养七天后，收集未粘附的细胞用于转录组测序，或者贴壁培养于细胞爬片用于免疫染色分析。
2、细胞形态比较
实施例3获得的小胶质细胞样细胞在细胞爬片上培养，培养三天后，将细胞用免疫染色固定液(碧云天)固定10min，然后用500μl PBS洗涤细胞三次，每次5min。将固定后的细胞置于200μl含有0.5％TritonX-100的4％牛血清白蛋白(BSA)溶液中封闭1h，再分别将一抗(Anti-CX3CR1和Anti-IBA1)按照1:500稀释于100μl含有0.5％TritonX-100的1％BSA的溶液。细胞在一抗溶液中4℃孵育过夜，再将二抗(Anti-Rabbit IgG)用含有0.5％TritonX-100的1％BSA的溶液稀释(1:1000)，同时将DNA染料DAPI稀释至二抗溶液中，室温孵育1h。用PBS洗三次，每次5min。将细胞放置荧光防猝灭剂(FluorSave Reagent，货号345789，Millipore)中保存，并在激光共聚焦显微镜下观察。
结果表明，hESCs分化来源的小胶质细胞样细胞(hES-MG)表达特异性蛋白CX3CR1和IBA1，如图2为CX3CR1和IBA1在hESCs分化来源的小胶质细胞样细胞中的免疫染色结果。与hESCs分化的巨噬细胞相比，他们的形态明显不同，/>胞体更大，呈椭圆状，而hES-MG胞体较小，有伸出的树枝状胞体，如图3和图4所示。图3为人胚胎干细胞hESCs诱导分化的小胶质细胞样细胞的形态图；图4为人诱导多能干细胞hiPSCs诱导分化的小胶质细胞样细胞的形态图。
3、表面蛋白表达的比较
将实施例3分化的小胶质细胞样细胞贴壁培养14天和21天，收集细胞于Trizol试剂中，提取总RNA，用于转录组测序分析。同时，用hESCs分化的巨噬细胞作为对照。转录组测序结果表明，分化的小胶质细胞样细胞(MG)表达小胶质细胞特异性的表面蛋白TREM2、TMEM119、CD11b和P2RY12，表达量明显高于分化的巨噬细胞如图5所示。
实施例5：分化的小胶质细胞样细胞的纯度分析
表面蛋白CD45和CD11b是小胶质细胞表达的特异性蛋白，用流式细胞仪检测这两个蛋白的表达情况，分析分化获得的小胶质细胞样细胞的纯度。首先，200×g离心收集分化的小胶质细胞样细胞，3％BSA溶液封闭细胞10min，再用荧光标记的抗体Anti-CD45 BB515和Anti-CD11b PerCP(BD Pharmingen)1:100稀释于3％BSA溶液中，室温孵育30min，200×g离心去除上清，细胞用PBS溶解，置于冰上，用流式细胞仪分析。结果表明，分化的小胶质细胞样细胞纯度非常高，高达90％，如图6所示。
实施例6：分化的小胶质细胞样细胞的功能表征
为了验证实施例3分化的小胶质细胞样细胞是否具有吞噬功能，将用pHrodo标记的细菌(E.coli)(Life Technologies)添加至培养基中，染料pHrodo的特性是其在中性和碱性环境中无色，在酸性环境中显示为红色。将小胶质细胞样细胞用活细胞表面抗体Anti-CD45 BB515(BD Pharmingen)标记，当pHrodo标记的细菌被小胶质细胞样细胞吞噬后，在酸性的溶酶体中显示红色。结果表明，pHrodo标记的细菌添加后半小时后就可以观察到被小胶质细胞样细胞吞噬，随着时间的延长，吞噬的细菌逐渐增加，如图7-1至7-3所示；
在小胶质细胞表面表达嘌呤受体(P2RY12)，该受体可以被其配体ATP或ADP激活，引起小胶质细胞的活化。为了验证分化的小胶质细胞样细胞是否能够对ATP刺激产生反应，我们在培养基中加入100μM的ATP。加入后10min，观察到小胶质细胞样细胞的树枝状突起明显增加，如图8所示。结果表明，分化的小胶质细胞样细胞对ATP刺激十分敏感。
炎症因子的分泌是小胶质细胞的另一个重要功能。为了检验不同刺激物能否激活分化的小胶质细胞样细胞产生炎症因子。采用流式细胞仪和CBA试剂盒(BD Pharmingen)检测Poly I:C、分化的类器官(Organoid)和细菌(E.coli)刺激小胶质细胞样细胞后炎症因子的表达情况，如图9-1至9-6所示。
实施例7：分化的小胶质细胞样细胞的移植实验
为了验证分化的小胶质细胞样细胞是否在视网膜疾病中起到保护作用，将实施例3分化得到的小胶质细胞样细胞以及分化的视网膜感光细胞混合制作为细胞悬液，比例为1：300，然后注射至视网膜色素变性小鼠模型(rd10)的视网膜下腔。在注射后一个月后，视功能检查发现与对照组相比实验组视功能得到了挽救。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.一种利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)将所述多能干细胞培养至汇合度为80-90％，用EDTA消化后，将细胞吹散并溶于拟胚体形成培养基，得到干细胞悬液；所述多能干细胞选自人胚胎干细胞系或人诱导多能干细胞；
(2)将所述干细胞悬液接种于低粘附V型或U型底细胞培养板中，并置于30-40℃、5％CO2的环境中培养1天，得到干细胞团；
(3)将所述干细胞团转移至新的拟胚体形成培养基进行悬浮培养，并在培养1天后，更换新的拟胚体形成培养基并继续培养3天，由此得到悬浮细胞团；
(4)将所述悬浮细胞团转移至盛有单核细胞诱导分化培养基且被0.1％明胶包被的培养容器中，进行诱导分化，悬浮细胞团转为贴壁生长，培养21-60天后，得到悬浮的单核细胞和贴壁细胞；
(5)收集所述单核细胞，并置于小胶质细胞诱导分化培养基中培养6-8天，收集未粘壁细胞，即得小胶质细胞样细胞；
所述拟胚体形成培养基包含：78％的Advanced DMEM/F12培养基、1％的青霉素和链霉素的混合物、20％的KSR和1％的Glutamix；
所述单核细胞诱导分化培养基包含：98％的X-Vivo 15培养基、1％的青霉素和链霉素的混合物和1％的Glutamix，50ng/ml的hrM-CSF、25ng/ml的hrIL-3；
所述小胶质细胞诱导分化培养基包含：88％的DMEM/F12培养基、1％的青霉素和链霉素的混合物、10％的FBS、1％的Glutamix、100ng/ml的hrM-CSF和100ng/ml的hrIL-34。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括收集步骤(4)的贴壁细胞，在单核细胞诱导分化培养基中持续培养，并收集诱导分化得到的单核细胞用于重复步骤(5)。
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