CN113549596B - 一种诱导培养基及其使用方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诱导培养基及其使用方法和应用，涉及细胞生物学领域。所述诱导培养基包括诱导基础培养基和诱导剂，所述诱导剂包括B27、N2、Activin A、视黄酸和rhBMP‑7。所述诱导培养基能够以较短诱导时间稳定、有效地诱导脐带间充质干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化，大大缩短了RPE细胞分化的时间，本发明诱导分化时间为3周左右，同时，提高了UC‑MSCs向RPE分化的纯度，经过3周的分化，经过三次传代可获得将近98％的RPE细胞。

Description

一种诱导培养基及其使用方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种诱导培养基及其使用方法和应用。

背景技术

视网膜色素变性是眼科中的一种疑难疾病，被称为不治之症，是原发于视网膜营养不良的一种遗传性慢性眼病，多累及双眼，国内患者约30万，全世界约300万。视网膜色素变性(RP)属于遗传性视杆、视锥细胞营养不良性疾病。患者一经确诊此病会给病人造成极大的心理损害。

但是目前包括药物、手术在内的治疗手段对其均只有改善、缓解作用，叶黄素也不例外。近年来，新的治疗方法不断推出，包括干细胞治疗、基因治疗、神经保护治疗、营养疗法、高压氧疗法、视网膜移植等，其中，基于细胞或干细胞的治疗方法吸引了相当多的关注。

脐带间充质干细胞(UC-MSCs)具有其它来源的间充质干细胞的多向分化潜能、低免疫原性等优点。与其它来源的间充质干细胞相比，UC-MSCs来源于母体，和母体有更好的相容性，纯度更均一，成脂分化能力比围产期其它组织来源的间充质干细胞强；现有技术表明UC-MSCs能分泌更多的血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞生长因子(SCF)，说明UC-MSCs具有促进血管再生和细胞分裂等功能，UC-MSCs在干细胞临床应用中将有较好前景。

报告显示，正常视网膜色素上皮细胞(RPE)视网膜下移植可以减缓视网膜变性。阻碍这种细胞治疗的主要因素是供体细胞来源有限和原代培养中RPE采集效率低，以及免疫排斥等。常规的自主分化的方法向多种方向分化，不仅分化时间长，目的细胞得率也低。在常规的自主分化方法中，只有少部分细胞分化为RPE细胞，因而需要人工挑选的方法将黑色的RPE细胞从混合的细胞分离并扩增。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种诱导培养基，能够以较短诱导时间稳定、有效地诱导脐带间充质干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化。

为了达到上述目的，本发明提供了一种诱导培养基，包括诱导基础培养基和诱导剂，所述诱导剂包括B27、N2、Activin A、视黄酸和rhBMP-7。

本发明人在对RPE的调查研究过程中，发现获得RPE作为供体细胞的方法除了直接获取外还可以将干细胞诱导分化为RPE，而干细胞的来源既可以是胚胎干细胞这样的多能干细胞，也可以是间充质干细胞(MSCs)这样的成人干细胞。并且，间充质干细胞(MSCs)具有巨大的潜力，已经被成功地诱导分化为成熟的非造血细胞，如上皮细胞，以及具有神经元特征的细胞，包括光感受器，同时还具有较少的伦理顾虑和较少的免疫排斥反应。

因此采用上述原料形成诱导剂，其中B27是一种无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性；N2是一种神经元瘤细胞的特定生长因子；Activin A属于转化生长因子超家族，在初期胚胎形成、血管平滑肌增殖、动脉硬化、神经分化诱导、造血细胞增殖分化、内分泌中枢垂体性激素分泌调节等诸多方面发挥作用；视黄酸受体突变会导致RPE细胞转分化为神经视网膜组织；rhBMP-7是一种细胞因子，具有诱导成骨活性的作用。这5种原料的配合作用是能成功诱导UC-MSCs分化为RPE样细胞。

在其中一个实施例中，所述诱导剂包括以下含量的原料：

采用上述含量的原料形成诱导剂，能获得最好的诱导效果。

在其中一个实施例中，所述诱导基础培养基包括青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇。

采用上述原料构成诱导基础培养基，能和所述诱导剂相配合，稳定、有效地诱导脐带间充质干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化。

在其中一个实施例中，所述诱导基础培养基包括以下含量的原料：

采用上述含量的原料形成诱导基础培养基，能和所述诱导剂的协同配合效果最好。

本发明还提供了一种诱导脐带间充质干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，包括以下步骤：

诱导分化：在脐带间充质干细胞中加入权利要求1-4中任一项所述的诱导培养基，诱导5-10天；

分化增殖：在诱导分化后的细胞中加入促分化增殖培养基，培养12-20天。

采用上述使用方法，大大缩短了RPE细胞分化的时间，诱导分化时间仅需3周左右，同时，提高了UC-MSCs向RPE分化的纯度，经过3周的分化，经过三次传代可获得将近98％的RPE细胞。

在其中一个实施例中，所述促分化增殖培养基包括促分化基础培养基和添加剂。

在其中一个实施例中，所述促分化基础培养基为DMEM/F12基础培养基。

在其中一个实施例中，所述添加剂包括血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、丙酮酸钠、谷氨酰胺和β-巯基乙醇。

采用上述DMEM/F12基础培养基和上述添加剂形成促分化增殖培养基，能够和所述诱导培养基相配合，能够显著增加视网膜色素上皮细胞的数量并呈现剂量依赖性。

在其中一个实施例中，所述添加剂包括以下工作浓度的原料：血清替代物、0.1mmol/L-0.5mmol/L的非必须氨基酸、100U/ml的青霉素、100ug/ml的链霉素、1mmol/L-3mmol/L的丙酮酸钠、1mmol/L-5mmol/L谷氨酰胺和3.5×10^-5mol/L-7.5×10^-5mol/L的β-巯基乙醇。

采用上述工作浓度的原料形成添加剂，能使促分化增殖培养基和所述诱导培养基产生最好的配合效果。

在其中一个实施例中，所述诱导分化步骤中，每2-4天全量换液；所述分化增殖步骤中，每6-8天全量换液。

采用上述培养条件，诱导得到的视网膜色素上皮细胞数量多且生长状况良好。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种诱导培养基及其使用方法和应用，所述诱导培养基包括诱导基础培养基和诱导剂，能够以较短诱导时间稳定、有效地诱导脐带间充质干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化，大大缩短了RPE细胞分化的时间，本发明诱导分化时间为3周左右。提高了UC-MSCs向RPE分化的纯度，经过3周的分化，经过三次传代可获得将近98％的RPE细胞。同时，将脐带间充质干细胞作为诱导分化的对象，具有收集无创性、无伦理争议等优点，并且脐带间充质干细胞已成为脐血库或干细胞库常规收集的一类储备细胞，与其他干细胞相比，脐带间充质干细胞离临床应用更近。本发明的一种诱导培养基及其使用方法和应用方法简单，可重复性强，细胞率高，为人脐带间充质干细胞定向诱导分化为视网膜色素上皮细胞提供指导和新的途径。

附图说明

图1为本发明实施例中P3代的脐带间充质干细胞图；

图2为本发明实施例中组1的UC-MSCs分化细胞传代后所得的RPE细胞图；

图3为本发明实施例中组1-4中RPE细胞特异性标志物RPE65、Mitf、ZO-1、Pax6mRNA表达量水平结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

定义：

本发明所述的B27：是一种无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性。

N2：是一种神经元瘤细胞的特定生长因子。

Activin A：指激活素A，属于转化生长因子超家族，在初期胚胎形成、血管平滑肌增殖、动脉硬化、神经分化诱导、造血细胞增殖分化、内分泌中枢垂体性激素分泌调节等诸多方面发挥作用。

rhBMP-7：是一种细胞因子，具有诱导成骨活性。

血清替代物：人工制备的可以替代血清的混合物。

非必须氨基酸：指不一定非从食物直接摄取不可的氨基酸，这类氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。

试剂来源：

B27(购于Gibco)、N2(购于Gibco)、Activin A(购于Humanzyme公司)、视黄酸(购于美国Sigma公司)、rhBMP-7(购于Humanzyme公司)

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。

实施例

诱导人脐带间充质干细胞分化为成视网膜色素上皮细胞。

1、采集足月剖腹产胎儿胎盘组织。

医院采集足月剖腹产胎儿胎盘组织，采集前签署客户知情同意书，组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护胎盘组织生物学活性，组织保护液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染。

2、制备、培养脐带间充质干细胞。

用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎，加入组织消化液消化，消化终止后过滤移去上清，得到脐带间充质干细胞；用脐带间充质干细胞无血清性培养基培养所述脐带间充质干细胞；待细胞达到80-90％汇合度时，用低毒性消化液消化细胞；接种细胞，培养过夜，移去上清，在37℃和5％CO₂培养箱中进行。

3、传代培养脐带间充质干细胞。

当原代细胞长至80％融合度时，按1：4体积比例传代，直至P3代细胞(如图1所示)，接种于T175培养瓶中。

4、制备单细胞悬液。

取P3代脐带间充质干细胞，用0.05％(质量体积比)的胰蛋白酶(T175培养瓶使用5ml)消化得到单细胞悬液，用步骤3所述的间充质干细胞无血清增殖培养基接种于T75培养瓶中(接种密度：10000/cm²)培养过夜。

脐带间充质干细胞无血清增殖培养基成分为：间充质干细胞无血清培养基、按所述间充质干细胞无血清培养基的体积计工作浓度为15ng/ml的bFGF、工作浓度为10ng/ml的HGF。

5、诱导分化。

配制4组诱导培养基，每组诱导培养基配方的原料和工作浓度如下表所示。

培养过夜后去除间充质干细胞无血清增殖培养基，然后用PBS清洗三次，再加入10ml诱导培养基，诱导7天，每3天全量换液。

表1 4组诱导培养基配方的原料和工作浓度

6、分化增殖。

去除组1-4的诱导培养基，然后用PBS清洗三次，用0.05％(质量体积比)胰蛋白酶消化得到单细胞悬液，分别使用10ml促分化增殖培养基接种于低粘附性的T75培养瓶中，细胞接种培养密度为10000/cm²。第3天添加5ml新鲜的促分化增殖培养基，第7天全量换液，诱导培养14天，得到视网膜色素上皮细胞。组1中纯化的视网膜色素上皮细胞为整皿的单层视网膜色素上皮样细胞(如图2所示)。

所述促分化增殖培养基的配方如下：DMEM/F12基础培养基、10％的血清替代物、工作浓度为0.1mmol/L的非必须氨基酸、工作浓度为100U/ml的青霉素、工作浓度为100ug/ml的链霉素、工作浓度为1mmol/L的丙酮酸钠、工作浓度为3mmol/L谷氨酰胺及工作浓度为5.5×10^-5mol/L的β-巯基乙醇。

7、组1-4中RPE细胞特异性标志物RPE65、Mitf和ZO-1、Pax6的定量分析。

对组1-4中UC-MSCs分化来源的RPE细胞进行特异性标志物定量分析，结果如下表和图3所示。

表2组1-4不同诱导条件下所表达指标阳性率统计分析

结果显示：组1中UC-MSCs分化来源的RPE细胞高表达RPE细胞的前体基因RPE65和成熟的RPE细胞相关基因如ZO-1；同时，组1中UC-MSCs分化来源的RPE细胞的前体基因Mitf和成熟的RPE细胞相关基因Pax6，也远高于组2-4。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种诱导培养基，其特征在于，包括诱导基础培养基和诱导剂；

所述诱导剂包括以下含量的原料：

B27 体积含量1％-4％

N2 体积含量1％-4％

Activin A 工作浓度40ng/ml -60ng/ml

视黄酸工作浓度10nmol/L-20nmol/L

rhBMP-7 工作浓度20ng/ml-30ng/ml；

所述诱导基础培养基包括以下含量的原料：

青霉素浓度100U/ml

链霉素浓度100μg/ml

谷氨酰胺工作浓度1 mmol/L-4mmol/L

β-巯基乙醇工作浓度3.5×10^-5mol/L-7.5×10^-5mol/L。

2.一种诱导脐带间充质干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

诱导分化：在脐带间充质干细胞中加入权利要求1所述的诱导培养基，诱导5-10天，每2-4天全量换液；

分化增殖：在诱导分化后的细胞中加入促分化增殖培养基，培养12-20天，每6-8天全量换液；所述促分化增殖培养基包括DMEM/F12基础培养基和添加剂，所述添加剂包括以下工作浓度的原料：血清替代物、0.1mmol/L-0.5mmol/L的非必须氨基酸、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素、1mmol/L-3mmol/L的丙酮酸钠、1mmol/L-5mmol/L谷氨酰胺和3.5×10^-5mol/L -7.5×10^-5mol/L的β-巯基乙醇。

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