CN116769713B - 一种视网膜色素上皮细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，属于细胞生产技术领域。本发明通过设置特定的培养参数、利用特定的诱导培养基，能够成功诱导得到视网膜色素上皮细胞，并克服了现有技术中诱导得到视网膜色素上皮细胞的方案复杂、效率较低等问题。本发明提供的制备方法提高了干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的性能，并且还发现了培养过程的早期在低氧条件下培养，并且培养中不使用抗生素更有利于制备视网膜色素上皮细胞，最终得到了一种稳定、高效率、低成本、操作简单的视网膜色素上皮细胞制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生产技术领域，尤其涉及一种视网膜色素上皮细胞的制备方法。
背景技术
视网膜色素上皮（RPE）是一种单层的色素细胞，位于神经性视网膜和脉络膜之间，在维持光感受器方面具有重要功能。视网膜色素上皮功能障碍被认为是年龄相关性黄斑变性（AMD）发病机制的一个重要因素，抗血管内皮生长因子疗法对湿性年龄相关性黄斑变性有效；然而，占年龄相关性黄斑变性患者大多数的干性年龄相关性黄斑变性却无法从目前的疗法中获益。近年来，人们越来越关注视网膜色素上皮细胞的移植，目的是用健康的视网膜色素上皮细胞取代退化的视网膜色素上皮细胞。异体和自体的视网膜色素上皮细胞移植已被报道，但两者都不是理想的组织来源；前者会诱发免疫排斥，而后者则需要一个侵入性的程序来获取视网膜色素上皮细胞。因此，由人类诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的视网膜色素上皮细胞，能够作为自体移植或无限繁殖，是克服现有缺点的替代细胞的理想来源，开发一种高效益方法来生产高质量的干细胞来源视网膜色素上皮细胞，对于推动未来年龄相关性黄斑变性和潜在的其他人类或动物的眼病的治疗非常必要。
现有技术中CN113699097B公开了一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，在悬浮培养后，使用含有烟碱的培养基对所述拟胚体进行贴壁培养三周以上，并在所述贴壁培养的第2-3周于培养基中再添加激活素A进行培养，得到视网膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞前体。但是此方法中的烟碱为剧毒物质，用于生产并不安全。并且现有的由多能诱导干细胞分化为成熟的视网膜色素上皮细胞需要5-6个月时间，培养过程时间长；同时需要加在不同节点给培养基加入不同的生长因子，培养成本较高，过程较繁复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，用于解决现有技术中诱导得到视网膜色素上皮细胞的方案复杂、效率较低等问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.将干细胞接种至干细胞完全培养基，培养12~36h；
S2.将干细胞完全培养基更换为混合培养基1号，培养12~36h；
S3.将混合培养基1号更换为混合培养基2号，培养12~36h；
S4.将混合培养基2号更换为诱导培养基①，培养15~23d；
S5.将诱导培养基①更换为诱导培养基②，培养35~45d，得到含黑色素的细胞；
S6.将含黑色素的细胞进行消化-融合培养，得到融合细胞；
S7.将融合细胞接种至诱导培养基②，培养得到视网膜色素上皮细胞；
所述S1中培养采用的O2体积浓度为3~8%；
所述混合培养基1号中含有干细胞完全培养基和诱导培养基①，所述混合培养基1号中干细胞完全培养基和诱导培养基①的体积比为2.8~3.2:1；
所述混合培养基2号中含有干细胞完全培养基和诱导培养基①，所述混合培养基2号中干细胞完全培养基和诱导培养基①的体积比为0.8~1.2:1；
所述诱导培养基①以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为0.8~1.2%的N-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、1.8~2.2μg/mL的肝素、体积百分比为8~12%的血清替代物，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；
所述诱导培养基②以混合基础培养基为溶剂，含有以下终浓度的组分：体积百分比为1~3%的B27添加剂、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；
所述混合基础培养基中含有DMEM培养基和F12培养基，所述DMEM培养基和F12培养基的体积比为2.8~3.2:1。
优选的，所述S1中培养采用的CO2体积浓度为8~12%。
优选的，所述干细胞完全培养基为mTeSR培养基。
优选的，所述S2~S7中培养采用的O2体积浓度为18~22%。
优选的，所述S2~S7中培养采用的CO2体积浓度为3~8%。
优选的，所述S6中的消化-融合培养包括以下步骤：
将含黑色素的细胞消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状；
将融合成片状的细胞再次进行消化，消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状；
将融合成片状的细胞再次进行消化，消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状，得到融合细胞。
优选的，所述消化采用胰蛋白酶-EDTA溶液作为消化剂；
所述胰蛋白酶-EDTA溶液的浓度为0.2~0.3%。
优选的，所述消化的时间为20~50min；
所述培养至细胞完全融合成片状采用的容器用层粘连蛋白包被，所述层粘连蛋白的浓度为8~12μg/mL。
优选的，所述融合培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为8~12%的血清替代物、体积百分比为0.8~1.2%的N-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、8~12mmol/L的烟酰胺和8~12μmol/L的Rock抑制剂，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×。
优选的，所述视网膜色素上皮细胞的跨细胞电阻在300Ω/cm2以上。
本发明的技术效果和优点：
本发明通过设置特定的培养参数、利用特定的诱导培养基，能够成功诱导得到视网膜色素上皮细胞，本发明提供的制备方法操作简单、制备效率高，提高了干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的性能，最终得到了一种稳定、高效率、低成本的视网膜色素上皮细胞制备方法。
附图说明
图1为10×物镜下实施例1和对比例1的细胞情况图；
图2为实施例1和对比例1 day1培养得到的细胞数量对比图；
图3为实施例1和对比例1 day6培养得到的细胞数量对比图；
图4为实施例1和对比例1 day12培养得到的细胞数量对比图；
图5为20×物镜下实施例1和对比例1的细胞情况图，图中箭头所指处显示实施例1视网膜色素上皮排练整齐，黑色色素沉着，代表视网膜色素上皮分化成熟，对比例1细胞排列不齐，未分化空隙较大；
图6为细胞标志物检测结果图；
图7为黑色素颗粒形成情况图，图中箭头所指处显示实施例1培养出来的视网膜色素上皮细胞黑色素颗粒形成较多，对比例1黑色素颗粒较少。
具体实施方式
本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.将干细胞接种至干细胞完全培养基，培养12~36h，优选为18~24h；所述S1中培养采用的O2体积浓度为3~8%，优选为4~6%，所述S1中培养采用的CO2体积浓度优选为8~12%；
S2.将干细胞完全培养基更换为混合培养基1号，培养12~36h，优选为18~24h，所述混合培养基1号中含有干细胞完全培养基和诱导培养基①，所述混合培养基1号中干细胞完全培养基和诱导培养基①的体积比为2.8~3.2:1，优选为2.9~3.1:1；所述干细胞完全培养基优选为mTeSR培养基；所述诱导培养基①以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为0.8~1.2%的N-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、1.8~2.2μg/mL的肝素、体积百分比为8~12%的血清替代物；
S3.将混合培养基1号更换为混合培养基2号，培养12~36h，优选为18~24h；所述混合培养基2号中含有干细胞完全培养基和诱导培养基①，所述混合培养基2号中干细胞完全培养基和诱导培养基①的体积比为0.8~1.2:1，优选为0.9~1.1:1；
S4.将混合培养基2号更换为诱导培养基①，培养15~23d，优选为18~20d；
S5.将诱导培养基①更换为诱导培养基②，培养35~45d，得到含黑色素的细胞；所述诱导培养基②以混合基础培养基为溶剂，含有以下终浓度的组分：体积百分比为1~3%的B27添加剂、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；所述混合基础培养基中含有DMEM培养基和F12培养基，所述DMEM培养基和F12培养基的体积比为2.8~3.2:1；
S6.将含黑色素的细胞进行消化-融合培养，得到融合细胞；所述S6中的消化-融合培养优选包括以下步骤：将含黑色素的细胞消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状；将融合成片状的细胞再次进行消化，消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状；将融合成片状的细胞再次进行消化，消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状，得到融合细胞。所述消化优选采用胰蛋白酶-EDTA溶液作为消化剂；所述胰蛋白酶-EDTA溶液的浓度优选为0.2~0.3%；所述消化的时间优选为20~50min，进一步优选为30~40min；所述培养至细胞完全融合成片状采用的容器用层粘连蛋白包被，所述层粘连蛋白的浓度为8~12μg/mL，进一步优选为9~11μg/mL；
优选的，所述融合培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为8~12%的血清替代物、体积百分比为0.8~1.2%的N-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、8~12mmol/L的烟酰胺和8~12μmol/L的Rock抑制剂；
S7.将融合细胞接种至诱导培养基②，培养得到视网膜色素上皮细胞，所述视网膜色素上皮细胞的跨细胞电阻优选在300Ω/cm2以上；在本发明所述视网膜色素上皮细胞的制备方法的早期在低氧条件下培养，并且培养中不采用抗生素，更有利于提升干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的性能；本发明所述S2~S7中培养采用的O2体积浓度优选为18~22%，所述S2~S7中培养采用的CO2体积浓度优选为3~8%。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
配制诱导培养基①：
基础培养基选用DMEM/F12培养基，添加以下终浓度的组分：1% N-2添加剂、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、1mmol/L丙酮酸钠、2μg/mL肝素、10%血清替代物；
配制诱导培养基②：
基础培养基选用体积比为3:1的DMEM和F12培养基，添加以下终浓度的组分：2%B27添加剂、1mmol/L 丙酮酸钠、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；
配制融合培养基：
基础培养基选用DMEM/F12培养基，添加以下终浓度的组分：10%血清替代物、1% N-2添加剂、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、1mmol/L 丙酮酸钠、10 mmol/L烟酰胺和10μmol/L Rock抑制剂。
多能诱导干细胞密度生长为70%时，用分散酶消化液消化40min，加入10倍体积的F12终止消化，离心后去掉上清液，用mTeSR重悬，移液管吹打3次，显微镜下见细胞团块约15~20个干细胞，消化后的细胞团块置入6孔板，此为day0，置于10%CO2、5%O2的培养箱中培养1d，day1时更换培养基为mTeSR：诱导培养基① 3:1，培养条件更换为5% CO2、20%O2（直至最终得到视网膜色素上皮细胞），day2更换培养基为mTeSR：诱导培养基① 1:1，day3更换培养基为100%诱导培养基①培养至day7，此阶段维持悬浮培养，day8将悬浮培养的细胞团移入1% matrigel（基底膜基质）包被的常规6孔板，培养基仍为100%诱导培养基①，每周3次更换培养基直至day21，day8~day21期间视杯初步形成；
day21将培养基更换为诱导培养基②，每周3次更换培养基直至day60，期间视杯周围开始出现含黑色素的细胞；
day60在显微镜下小心分离视杯周围含黑色素的细胞，0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化40min，加入融合培养基终止消化后，种植在10μg/mL层粘连蛋白包被的普通6孔板中，此时培养基为融合培养基，每周更换3次培养基，直至细胞完全融合成片状；
再次用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化30min，种植在10μg/mL层粘连蛋白包被的T25培养皿中，此时培养基为融合培养基，细胞完全融合成片状；
再次用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化30min，按照5×105cells/mL种植入10μg/mL层粘连蛋白包被的12mm直径跨膜培养皿，此时培养基为融合培养基，再次到细胞完全融合成片状后，更换为诱导培养基②，直至跨细胞电阻升至300Ω/cm2，表明视网膜色素上皮细胞已分化完成（day120）。
实施例2
配制诱导培养基①：
基础培养基选用DMEM/F12培养基，添加以下终浓度的组分：1% N-2添加剂、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、1mmol/L丙酮酸钠、2μg/mL肝素、10%血清替代物；
配制诱导培养基②：
基础培养基选用体积比为3.2:1的DMEM和F12培养基，添加以下终浓度的组分：2%B27添加剂、1mmol/L 丙酮酸钠、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；
配制融合培养基：
基础培养基选用DMEM/F12培养基，添加以下终浓度的组分：10%血清替代物、1% N-2添加剂、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、1 mmol/L 丙酮酸钠、10 mmol/L烟酰胺和10μmol/L Rock抑制剂。
多能诱导干细胞密度生长为70%时，用分散酶消化液消化40min，加入10倍体积的F12终止消化，离心后去掉上清液，用mTeSR重悬，移液管吹打3次，显微镜下见细胞团块约15~20个干细胞，消化后的细胞团块置入6孔板，此为day0，置于10%CO2、5%O2的培养箱中培养1d，day1时更换培养基为mTeSR：诱导培养基① 3:1，培养条件更换为5% CO2、20%O2（直至最终得到视网膜色素上皮细胞），day2更换培养基为mTeSR：诱导培养基① 1:1，day3更换培养基为100%诱导培养基①培养至day7，此阶段维持悬浮培养，day8将悬浮培养的细胞团移入1% matrigel（基底膜基质）包被的常规6孔板，培养基仍为100%诱导培养基①，每周3次更换培养基直至day21，day8~day21期间视杯初步形成；
day21将培养基更换为诱导培养基②，每周3次更换培养基直至day60，期间视杯周围开始出现含黑色素的细胞；
day60在显微镜下小心分离视杯周围含黑色素的细胞，0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化40min，加入融合培养基终止消化后，种植在10μg/mL层粘连蛋白包被的普通6孔板中，此时培养基为融合培养基，每周更换3次培养基，直至细胞完全融合成片状；
再次用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化30min，种植在10μg/mL层粘连蛋白包被的T25的培养皿中，此时培养基为融合培养基，细胞完全融合成片状；
再次用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化30min，按照5×105cells/mL种植入12mm直径跨膜培养皿，此时培养基为融合培养基，再次到细胞完全融合成片状后，更换为诱导培养基②，直至跨细胞电阻升至300Ω/cm2，表明视网膜色素上皮细胞已分化完成（day120）。
实施例3
配制诱导培养基①：
基础培养基选用DMEM/F12培养基，添加以下终浓度的组分：1.2% N-2添加剂稀释倍数为80倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、1.1 mmol/L丙酮酸钠、2μg/mL肝素、10%血清替代物；
配制诱导培养基②：
基础培养基选用体积比为2.8:1的DMEM和F12培养基，添加以下终浓度的组分：2%B27添加剂、1mmol/L 丙酮酸钠、稀释倍数为80倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；
配制融合培养基：
基础培养基选用DMEM/F12培养基，添加以下终浓度的组分：10%血清替代物、1.2%N-2添加剂、稀释倍数为120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为120倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、1 mmol/L 丙酮酸钠、8 mmol/L烟酰胺和10μmol/L Rock抑制剂。
多能诱导干细胞密度生长为70%时，用分散酶消化液消化40min，加入10倍体积的F12终止消化，离心后去掉上清液，用mTeSR重悬，移液管吹打3次，显微镜下见细胞团块约15~20个干细胞，消化后的细胞团块置入6孔板，此为day0，置于10%CO2、5%O2的培养箱中培养1d，day1时更换培养基为mTeSR：诱导培养基① 3:1，培养条件更换为5% CO2、20%O2（直至最终得到视网膜色素上皮细胞），day2更换培养基为mTeSR：诱导培养基① 1:1，day3更换培养基为100%诱导培养基①培养至day7，此阶段维持悬浮培养，day8将悬浮培养的细胞团移入1% matrigel（基底膜基质）包被的常规6孔板，培养基仍为100%诱导培养基①，每周3次更换培养基直至day21，day8~day21期间视杯初步形成；
day21将培养基更换为诱导培养基②，每周3次更换培养基直至day60，期间视杯周围开始出现含黑色素的细胞；
day60在显微镜下小心分离视杯周围含黑色素的细胞，0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化40min，加入融合培养基终止消化后，种植在10μg/mL层粘连蛋白包被的普通6孔板中，此时培养基为融合培养基，每周更换3次培养基，直至细胞完全融合成片状；
再次用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化30min，种植在10μg/mL层粘连蛋白包被T25的培养皿中，此时培养基为融合培养基，细胞完全融合成片状；
再次用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化30min，按照5×105cells/mL种植入10μg/mL层粘连蛋白包被12mm直径跨膜培养皿，此时培养基为融合培养基，再次到细胞完全融合成片状后，更换为诱导培养基②，直至跨细胞电阻升至300Ω/cm2，表明视网膜色素上皮细胞已分化完成（day120）。
对比例1
配制诱导培养基①：
基础培养基选用DMEM/F12培养基，添加以下终浓度的组分：1% N-2添加剂、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、1mmol/L丙酮酸钠、2μg/mL肝素、10%血清替代物、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）；
配制诱导培养基②：
基础培养基选用体积比为3:1的DMEM和F12培养基，添加以下终浓度的组分：2%B27添加剂、1mmol/L 丙酮酸钠、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、100 U/mL青霉素和 100μg/mL链霉素）；
配制融合培养基：
基础培养基选用DMEM/F12培养基，添加以下终浓度的组分：10%血清替代物、1% N-2添加剂、稀释倍数为100倍的非必需氨基酸、稀释倍数为100倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×、1 mmol/L 丙酮酸钠、10 mmol/L烟酰胺和10μmol/L Rock抑制剂、（添加抗生素：终浓度为100 U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素，培养过程中均添加此抗生素）。
多能诱导干细胞密度生长为70%时，用分散酶消化液消化40min，加入10倍体积的F12终止消化，离心后去掉上清液，用mTeSR重悬，移液管吹打3次，显微镜下见细胞团块约15~20个干细胞，消化后的细胞团块置入6孔板，此为day0，置于5%CO2、20%O2（维持此培养条件直至最终得到视网膜色素上皮细胞）的培养箱中培养1d，day1时更换培养基为mTeSR：诱导培养基① 3:1，添加抗生素：终浓度为100 U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素，day2更换培养基为mTeSR：诱导培养基① 1:1，day3更换培养基为100%诱导培养基①培养至day7，此阶段维持悬浮培养，day8将悬浮培养的细胞团移入1% matrigel（基底膜基质）包被的常规6孔板，培养基仍为100%诱导培养基①，每周3次更换培养基直至day21，day8~day21期间视杯初步形成；
day21将培养基更换为诱导培养基②，每周3次更换培养基直至day60，期间视杯周围开始出现含黑色素的细胞；
day60在显微镜下小心分离视杯周围含黑色素的细胞，0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化40min，加入融合培养基终止消化后，种植在10μg/mLsynthemax（合成多肽共聚物）包被的普通6孔板中，此时培养基为融合培养基，每周更换3次培养基，直至细胞完全融合成片状；
再次用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化30min，种植在10μg/mLsynthemax（合成多肽共聚物）包被的T25的培养皿中，此时培养基为融合培养基，细胞完全融合成片状；
再次用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化30min，按照5×105cells/mL种植入10μg/mLsynthemax（合成多肽共聚物）包被的12mm直径跨膜培养皿，此时培养基为融合培养基，再次到细胞完全融合成片状后，更换为诱导培养基②，培养直至day120。
实验例1
分别取实施例1和对比例1在day1、day6和day12的细胞，在10×物镜下进行观察，结果如图1所示。
由图1可知，本发明实施例1中的早期培养条件可以提高细胞增殖数，并且去除抗生素可减少线粒体功能障碍和活性氧。day1中实施例1的细胞增殖与对比例1相比较快。通过day6和day12中实施例1的结果可以看到周边细胞较为规整，并且开始有分化为视杯的迹象。
在day1、day6和day12，每个时间点分别取三组实施例1和对比例1的细胞，进行细胞数量统计（细胞数量统计方法：6孔板中的1孔细胞使用0.02% EDTA溶液消化为单细胞后使用细胞计数仪统计，由于iPSC诱导分化为视网膜色素上皮细胞的过程中，细胞呈胚胎体，后续再继续分化才可以得到成熟分化的视网膜色素上皮细胞，此处细胞数量用于表征干细胞的增殖效率），统计结果如下表1所示：
表1 细胞数量统计结果（单位：cells/mL）
对数据进行t检验，结果如图2~4所示，由结果可知，本发明在多能诱导分化干细胞的早期能够增加干细胞的增殖效率，为后续分化为视网膜色素上皮细胞后细胞具有良好的成熟度提供基础。
分别取实施例1和对比例1在day90和day120的细胞，在20×物镜下进行观察，结果如图5所示。
由图5可知，实施例1中的视网膜色素上皮细胞排练整齐，黑色色素沉着，代表视网膜色素上皮分化成熟，对比例1中细胞排列不齐，未分化空隙较大，其中day90时，实施例1的细胞开始出现黑色素沉着，并逐渐开始形成六边形的紧密连接间隙，对比例1的细胞未见黑色素沉着，中间有大量未分化细胞，说明实施例1得到的视网膜色素上皮细胞成熟度更高。
实验例2
采用免疫荧光染色法和电镜扫描对day120分化后细胞标志物进行检测，用免疫荧光染色定位目标蛋白（F-actin和ZO-1）的步骤如下：
（1）固定：4%的PFA（多聚甲醛固定液）室温下固定5min。固定后1×PBS洗涤三次。
（2）通透细胞膜：室温下加入0.1% Triton-100（聚乙二醇辛基苯基醚），透膜30min。透膜后1×PBS洗涤三次。
（3）封闭：5%的含有驴血清的BSA封闭液 室温孵育2h。
（4）孵一抗：按照抗体说明书稀释一抗，将视网膜色素上皮细胞膜全部浸泡在抗体液中，4℃摇床摇动孵育一抗过夜。
（5）清洗：1× PBS洗3遍，每遍10min。
（6）孵二抗：按照1:500稀释二抗，将视网膜色素上皮细胞膜浸泡在抗体液中，室温摇床摇动孵育抗体2h。
（7）清洗：1×PBS洗3遍，每遍10min。
（8）DAPI及F-actin染色：1:1000稀释DAPI原液与按照1:200稀释的F-actin相混合，将视网膜色素上皮细胞膜浸泡在混合液中，室温摇床摇动孵育15min。
（9）漂洗：1× PBS洗3遍，每遍5min。
（10）复染DAPI：1:1000稀释DAPI原液，将视网膜色素上皮细胞膜浸泡在混合液中，室温摇床摇动孵育10min。
（11）漂洗：1× PBS洗3遍，每遍5min。
（12）封片：将膜平铺于载玻片上，视网膜色素上皮细胞 层朝上，加入Fluoromount-G封片剂封片。
结果如图6所示：通过本发明实施例1诱导分化得来的视网膜色素上皮的微绒毛（标志物：F-actin）形成较为密集，视网膜色素上皮细胞的紧密连接（标志物：ZO-1）形成较为整齐，分界清晰。而相比之下，对比例1细胞间的微绒毛模糊，几乎未成功形成紧密连接。
实验例3
通过电镜对实施例1和对比例1培养得到的细胞中黑色素颗粒形成情况进行观测，结果如图7所示：通过本发明实施例1培养出来的视网膜色素上皮细胞黑色素颗粒形成较多，而对比例1黑色素颗粒较少。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将干细胞接种至干细胞完全培养基，培养12~36h；
S2.将干细胞完全培养基更换为混合培养基1号，培养12~36h；
S3.将混合培养基1号更换为混合培养基2号，培养12~36h；
S4.将混合培养基2号更换为诱导培养基①，培养15~23d；
S5.将诱导培养基①更换为诱导培养基②，培养35~45d，得到含黑色素的细胞；
S6.将含黑色素的细胞进行消化-融合培养，得到融合细胞；
S7.将融合细胞接种至诱导培养基②，培养得到视网膜色素上皮细胞；
所述S1中培养采用的O2体积浓度为3~8%；
所述混合培养基1号中含有干细胞完全培养基和诱导培养基①，所述混合培养基1号中干细胞完全培养基和诱导培养基①的体积比为2.8~3.2:1；
所述混合培养基2号中含有干细胞完全培养基和诱导培养基①，所述混合培养基2号中干细胞完全培养基和诱导培养基①的体积比为0.8~1.2:1；
所述诱导培养基①以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为0.8~1.2%的N-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、1.8~2.2μg/mL的肝素、体积百分比为8~12%的血清替代物，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；
所述诱导培养基②以混合基础培养基为溶剂，含有以下终浓度的组分：体积百分比为1~3%的B27添加剂、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；
所述混合基础培养基中含有DMEM培养基和F12培养基，所述DMEM培养基和F12培养基的体积比为2.8~3.2:1。
2.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述S1中培养采用的CO2体积浓度为8~12%。
3.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述干细胞完全培养基为mTeSR培养基。
4.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述S2~S7中培养采用的O2体积浓度为18~22%。
5.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述S2~S7中培养采用的CO2体积浓度为3~8%。
6.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述S6中的消化-融合培养包括以下步骤：
将含黑色素的细胞消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状；
将融合成片状的细胞再次进行消化，消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状；
将融合成片状的细胞再次进行消化，消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状，得到融合细胞。
7.根据权利要求6所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述消化采用胰蛋白酶-EDTA溶液作为消化剂；
所述胰蛋白酶-EDTA溶液的质量浓度为0.2~0.3%。
8.根据权利要求6所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述消化的时间为20~50min；
所述培养至细胞完全融合成片状采用的容器用层粘连蛋白包被，所述层粘连蛋白的浓度为8~12μg/mL。
9.根据权利要求6所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述融合培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为8~12%的血清替代物、体积百分比为0.8~1.2%的N-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸、0.8~1.2mmol/L的丙酮酸钠、8~12mmol/L的烟酰胺和8~12μmol/L的Rock抑制剂，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×。
10.根据权利要求6所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞的跨细胞电阻在300Ω/cm2以上。
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