CN116622636A - 一种嗅上皮神经干细胞的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞提取领域，且公开了一种嗅上皮神经干细胞的提取方法，其包括以下步骤：步骤一、准备材料，包括实验动物和细胞培养试剂；步骤二、实验动物速眠新注射液皮下注射麻醉，以针头磨平1ml注射器在双侧鼻腔滴注1％硫酸锌溶液0.3ml；步骤三、在0.125％胰蛋白酶37℃下消化25min；步骤四、Hank平衡盐溶液清洗两次，然后用100目的铜网过滤；步骤五、用细胞培养液重新制成单细胞悬液，锥虫蓝染色后细胞计数，并置于培养箱内培养。本发明在鼻腔滴用硫酸锌后,嗅上皮组织破坏,基底细胞分裂增殖随之显著增加，硫酸锌原位创伤嗅上皮中神经元特有微管蛋白和神经元干细胞表达增多,表明神经元增殖增强,即硫酸锌原位创伤后的实验动物嗅上皮中可培养出神经元干细胞。
Description
技术领域
本发明属于细胞提取领域，具体为一种嗅上皮神经干细胞的提取方法。
背景技术
神经干细胞是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群，其是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。
由于神经干细胞(NSC)具有一定的可塑性，可分化成与移植区相似的神经细胞，胚胎及成年NSC的成功培养为中枢神经系统损伤及退行性病变治疗带来了新的希望，但异体NSC移植可能带来伦理学和免疫排斥等问题，即使是从自身的嗅球获取NSC，也需要开颅手术并可能导致一定的并发症，因此，从颅外组织如嗅上皮等获取NSC是一种风险较低的途径。
发明内容
要解决的技术问题：如何从嗅上皮中提取神经干细胞。
技术方案：本发明提供了一种嗅上皮神经干细胞的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一、准备材料，包括实验动物和细胞培养试剂；步骤二、实验动物速眠新注射液皮下注射麻醉，以针头磨平1ml注射器在双侧鼻腔滴注1％硫酸锌溶液0.3ml，分3次滴药，持续时间30min，6天后取出材料；步骤三、硫酸锌原位创伤的实验动物用75％乙醇消毒，无菌条件下切除颅骨及鼻骨，取出鼻中隔后上部及筛鼻甲内侧面淡黄色黏膜，置于4℃不含Ca2+、Mg2+的Hank平衡盐溶液中，漂洗两次后在显微镜下剪成尽可能小的碎块，然后在0.125％胰蛋白酶37℃下消化25min；步骤四、Hank平衡盐溶液清洗两次，期间用火焰抛光的Pasteur管轻轻吹打，然后用100目的铜网过滤；步骤五、用细胞培养液重新制成单细胞悬液，锥虫蓝染色后细胞计数，以108/L的活细胞密度接种于60mm塑料细胞培养皿中，并置于培养箱内培养，每7天更换培养液一次，在实验动物鼻腔滴用硫酸锌后,嗅上皮组织破坏,基底细胞分裂增殖随之显著增加，硫酸锌原位创伤后嗅上皮中神经元特有微管蛋白和神经元干细胞表达增多,表明神经元增殖增强,即从硫酸锌原位创伤后的实验动物嗅上皮中可培养出神经元干细胞。
进一步地，步骤一中的细胞培养试剂包括达氏修正依氏培养基、Hank平衡盐溶液、MEM、表皮生长因子、多聚赖氨酸、碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清。
进一步地，步骤三中的Hank平衡盐溶液中含有105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
进一步地，步骤三中在25min的消化过程中，每5min振荡一次，离心5min，离心在1000r/min的转速下进行。
进一步地，步骤五中的培养液为内含10％热灭活胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的达氏修正依氏培养基。
进一步地，步骤五中的培养箱中的体积浓度为5％CO2，温度为37℃。
技术效果：
本发明中，在实验动物鼻腔滴用硫酸锌后,嗅上皮组织破坏,基底细胞分裂增殖随之显著增加，硫酸锌原位创伤后嗅上皮中神经元特有微管蛋白和神经元干细胞表达增多,表明神经元增殖增强,即从硫酸锌原位创伤后的实验动物嗅上皮中可培养出神经元干细胞。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的流程结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本具体实施方式提供的嗅上皮神经干细胞的提取方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤一、准备材料，包括实验动物和细胞培养试剂，细胞培养试剂包括达氏修正依氏培养基、Hank平衡盐溶液、MEM、表皮生长因子、多聚赖氨酸、碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清；
步骤二、实验动物速眠新注射液皮下注射麻醉，以针头磨平1ml注射器在双侧鼻腔滴注1％硫酸锌溶液0.3ml，分3次滴药，持续时间30min，6天后取出材料；
步骤三、硫酸锌原位创伤的实验动物用75％乙醇消毒，无菌条件下切除颅骨及鼻骨，取出鼻中隔后上部及筛鼻甲内侧面淡黄色黏膜，置于4℃不含Ca2+、Mg2+的Hank平衡盐溶液中，其中，Hank平衡盐溶液中含有105U/L青霉素和100mg/L链霉素，漂洗两次后在显微镜下剪成尽可能小的碎块，然后在0.125％胰蛋白酶37℃下消化25min，在此消化过程中，每5min振荡一次，离心5min，离心在1000r/min的转速下进行；
步骤四、Hank平衡盐溶液清洗两次，期间用火焰抛光的Pasteur管轻轻吹打，然后用100目的铜网过滤；
步骤五、用细胞培养液重新制成单细胞悬液，锥虫蓝染色后细胞计数，以108/L的活细胞密度接种于60mm塑料细胞培养皿中，培养皿中的培养液为内含10％热灭活胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的达氏修正依氏培养基；并置于体积浓度为5％CO2，温度为37℃培养箱内培养，每7天更换培养液一次；
早提取培养完成后，为更好的观察细胞，还可进行传代及简介免疫荧光染色操作，即在出现细胞克隆后，用习惯轻吹培养液使半悬浮细胞悬浮，收集含细胞克隆的培养液,用火焰抛光的Pasteur管轻轻吹打成单细胞悬液，以相同培养液重新制成单细胞悬液，调成1×104个/L细胞密度，每孔100μl接种于96孔板中，标记含单个细胞的孔，7天后收集细胞克隆，按1×108/L细胞密度接种于60mm塑料细胞培养皿并按同样细胞密度传代，取第四代含细胞克隆的培养液滴在多聚赖氨酸预处理的盖玻片上，在37℃下继续孵育，2h后取出，用4％多聚甲醛固定15min；0.2％TritonX-100室温10min；正常山羊血清封闭20min,加入一抗4℃过夜,37℃下FITC标记二抗1h,按1:50的比例细胞核标记8min，上述步骤除正常山羊血清封闭后不洗直接加一抗外,其余步骤均用0.1mol/L的PBS洗涤，一抗包括1:500的nestin，1:50的细胞角蛋白；阴性对照以PBS代替一抗；将第四代细胞克隆移至含10％热灭活胎牛血清培养液中,在内置多聚赖氨酸预处理盖玻片的培养皿中继续培养,7天后取出盖玻片,然后用0.1mol/L的PBS、pH7.4的4％多聚甲醛固定15min；间接免疫荧光染色方法同上；一抗包括NSE(1∶50),GFAP(1∶100),GalC(1∶500)和细胞角蛋白(1∶50)，然后即可用显微镜观察。
嗅上皮球形基底细胞和水平基底细胞在不同的培养条件下都具有增殖并分化为神经细胞的能力，在模拟体内嗅上皮微环境及添加生长因子的培养条件下,水平基底细胞可以形成克隆并分化为神经元和胶质细胞的前体细胞位于嗅上皮基底膜上的水平基底细胞表达角蛋白,在无血清及添加EGF的培养状态下,角蛋白免疫反应阳性的水平基底细胞可以分化为嗅感觉神经细胞，而嗅上皮NSC适宜在DMEM/F12加胎牛血清的培养液中生长,不表达角蛋白；本方法采用含血清的DMEM/F12培养的细胞克隆及分化的细胞均不表达角蛋白,推测这些NSC可能来源于球形基底细胞,而不是水平基底细胞。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
在本装置空闲处，安置所有电器件与其相匹配的驱动器，并且通过本领域人员，将上述中所有驱动件，其指代动力元件、电器件以及适配的电源通过导线进行连接，具体连接手段，应参考上述表述中，各电器件之间先后工作顺序完成电性连接，其详细连接手段，为本领域公知技术。
Claims (6)
1.一种嗅上皮神经干细胞的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一、准备材料，包括实验动物和细胞培养试剂；
步骤二、实验动物速眠新注射液皮下注射麻醉，以针头磨平1ml注射器在双侧鼻腔滴注1％硫酸锌溶液0.3ml，分3次滴药，持续时间30min，6天后取出材料；
步骤三、硫酸锌原位创伤的实验动物用75％乙醇消毒，无菌条件下切除颅骨及鼻骨，取出鼻中隔后上部及筛鼻甲内侧面淡黄色黏膜，置于4℃不含Ca2+、Mg2+的Hank平衡盐溶液中，漂洗两次后在显微镜下剪成尽可能小的碎块，然后在0.125％胰蛋白酶37℃下消化25min；
步骤四、Hank平衡盐溶液清洗两次，期间用火焰抛光的Pasteur管轻轻吹打，然后用100目的铜网过滤；
步骤五、用细胞培养液重新制成单细胞悬液，锥虫蓝染色后细胞计数，以108/L的活细胞密度接种于60mm塑料细胞培养皿中，并置于培养箱内培养，每7天更换培养液一次。
2.根据权利要求1所述的嗅上皮神经干细胞的提取方法，其特征在于，步骤一中的细胞培养试剂包括达氏修正依氏培养基、Hank平衡盐溶液、MEM、表皮生长因子、多聚赖氨酸、碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的嗅上皮神经干细胞的提取方法，其特征在于，步骤三中的Hank平衡盐溶液中含有105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
4.根据权利要求1所述的嗅上皮神经干细胞的提取方法，其特征在于，步骤三中在25min的消化过程中，每5min振荡一次，离心5min，离心在1000r/min的转速下进行。
5.根据权利要求1所述的嗅上皮神经干细胞的提取方法，其特征在于，步骤五中的培养液为内含10％热灭活胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的达氏修正依氏培养基。
6.根据权利要求1所述的嗅上皮神经干细胞的提取方法，其特征在于，步骤五中的培养箱中的体积浓度为5％CO2，温度为37℃。
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