CN104971382B - 一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织及其构建方法。本发明采用未添加牛血清和垂体提取物的细胞培养液，通过对生物膜载体特殊处理，使生物膜上形成适宜细胞相互作用的微生境（niche），促进人成纤维细胞和表皮细胞发挥自身潜能，增殖、分裂及分泌生长因子，4～7天即可在生物膜上形成具有活性细胞的人工组织。人工组织细胞活性高，分裂及移行能力强，可归巢至创面，作为治愈烧烫伤和慢性溃疡的种子细胞，促进组织再生。本发明完全避免了血清、垂体提取物和胶原等动物衍生制品的免疫排斥，人畜共患病毒传染的危险，形成以生物膜为支架和感染屏障的薄层细胞组织，真正实现生物安全的创口贴式人工活性组织。

Description

一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活 性组织及其构建方法

技术领域

本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，具体涉及一种无血清和牛垂体提取物细胞培养液以及采用此培养液在医用生物膜上形成的“创口贴”式人工活性组织及其构建方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是与外界环境接触的屏障。皮肤由内至外主要有表皮、真皮和皮下组织构成，表皮和真皮之间含有基底膜，皮下组织含有丰富的血管和神经。由于各种原因会造成皮肤的缺损，如烧烫伤、慢性疾病、创伤等。皮肤组织虽具有较强的再生能力，但在大面积全层皮肤缺损的情况下，皮肤的再生能力明显减弱，极易产生大量瘢痕和瘢痕挛缩。

目前，应对皮肤缺损主要有四种方式：自体植皮、同种异体植皮、异种植皮、人工组织皮肤替代。自体植皮仍是临床治疗全层皮肤缺损最有效的方法，但该方法面临自体皮供应不足的缺点，且是一种“以伤治伤”的方法。异体或异种植皮则受到免疫排斥的限制和感染供体病原体的潜在危险。人工组织皮肤替代是用组织工程方法体外培养组织替代物，然后应用于皮肤缺损处。常见的体外培养组织替代物是用成人干细胞、分化的真皮成纤维细胞(fibroblast,F)或/和表皮细胞(keratinocyte，K)培养而形成的活性组织。通过培养细胞的倍增生长形成具有一定细胞密度的组织替代物，原则上解决了皮源紧张的问题，是治疗皮肤缺损未来的趋势。

然而，组织工程是一种复杂的系统生物工程，在构建过程中需要综合考虑分子、细胞和骨架材料的相互作用及相容性等综合因素，才能形成生物安全、具再生能力的活性组织替代物。

首先，构建体系中分子是相互作用的基本元件，是最需考虑的影响因素之一。构建人工活性组织必然涉及相应细胞的扩增培养，培养所需的细胞培养液通常是在基础培养液中添加胎牛血清(fetal bovine serum,FCS)或/和牛垂体提取物(bovine pituitaryextract)以提供多种维生素、氨基酸、嘌呤、生长因子、蛋白等活性分子。胎牛血清供给细胞生长所必需的蛋白质、生长因子等；牛垂体提取物含有激素，促进原代和传代表皮细胞的增殖以及维持表皮细胞的精细分化。若在添加成分中剔除胎牛血清或牛垂体提取物，表皮细胞将难以贴壁生长或停止增殖，逐渐脱落，因此两者是表皮细胞培养必需添加的成分。然而胎牛血清和牛垂体提取物含有多种异种抗原、抗体、激素等不确定成分，牛垂体提取物取自脑部(朊粒的发病部位)，这两种异种生物材料，存在传播人畜共患病毒、逆转录病毒、朊粒(引起疯牛病)和支原体等病原体的危险；另外异种抗原能激发超敏反应，引起机体免疫病理损伤或组织排斥，不仅降低了人工活性组织的再生速度和存活率，甚至危及患者健康和生命。因此，需从根本上剔除胎牛血清和牛垂体提取物，由此导致的培养液部分营养缺失和不足等问题，除需添加人源或生物工程来源的多种维生素、氨基酸、嘌呤、生长因子、蛋白等活性分子外，还需要通过细胞-细胞、细胞-骨架相互作用等环节予以弥补，达到既促进细胞生长，又具有生物安全性，有利于促进人工活性组织的产业化生产和临床应用。

其次，细胞与细胞之间的相互作用是形成含有成纤维细胞和表皮细胞的皮肤组织必要条件。两种细胞之间细胞-细胞相互作用提供了一种组织样微环境，这些相互作用又促使两种细胞分泌胶原蛋白、粘多糖、网状纤维、弹性纤维、糖蛋白和各种细胞因子等，从而促进彼此的增殖和分化，胞外基质发育和基底膜产生。最初表皮细胞培养时，是用射线照射的小鼠成纤维细胞(i3T3)作为饲养细胞，i3T3不能分裂繁殖，仅提供有丝分裂信号促使表皮细胞生长和维持表皮细胞精细分化，形成以表皮细胞为主的人工活性组织。目前国外应用的商品Myskin、Epicel为此类，但终产品仍含有痕量i3T3，会有对人体不利的代谢产物和抗原，i3T3也可引起移植后的免疫排斥反应。改进的组织工程技术，以人成纤维细胞作为饲养细胞，细胞来源于自体或异体(例如新生儿包皮)，技术上解决了异种细胞的排斥问题，可形成模拟皮肤结构的真皮-表皮细胞双层人工活性组织，其临床应用效果更佳。国外的商品有Apligraf、OrCel，不过构建中仍使用含血清的细胞培养液。因此若考虑血清剔除，需添加相应的生物活性分子，平衡细胞-细胞之间相互作用，适当抑制成纤维细胞的生长，以促进表皮细胞的增殖与分化。

最后，人工活性组织商品，除具有成纤维细胞和表皮细胞外，还用医用生物膜或三维网状材料作为类似皮肤胞外基质的支架，使成纤维细胞和表皮细胞能够附着在支架上生长。常用的支架材料有脱细胞真皮、胶原海绵膜、透明质酸膜和聚乳酸/聚羟基乙酸等。脱细胞真皮和胶原海绵膜主要成分是胶原，多用与人胶原类似的牛、猪I型和VII型胶原作为支架供体，此类成分仍与人皮肤胶原有差异，会激发一定的免疫排斥反应，影响移植产品的移植存活率。产品Apligraf、OrCel和安体肤用胶原成分做骨架，均不适用于对牛、猪胶原敏感的患者。采用透明质酸膜和聚乳酸/聚羟基乙酸等医用可降解生物材料作为支架贴合伤口，在1～2月内逐渐降解，会使伤口局部微环境酸化，不利于活性组织的存活和生长。支架的厚度和孔径也存在一定的问题，常规介于0.3～2.0mm,孔径大小不一。现有商品均是支架直接贴合创面，一方面支架太厚或孔径极细，人工组织活细胞不迅速贴合创面和接触伤口组织血供，常因血供差，活细胞营养供应不足，导致细胞增殖缓慢，甚至死亡脱落，影响皮肤的再生。另一方面，支架材料位于创面，表皮细胞位于外侧，则需将表皮细胞培养至10～15层，形成角质细胞层，才具有皮肤屏障功能，防止感染。若对自体皮移植来说，从自体皮肤分离表皮细胞，直至角化形成，一般需15～20天，从产品的时效性来说完全不能满足临床如烫伤、烧伤急需植皮的需要。因此，改变组织工程支架的思路，将支架既作为活性组织的载体，又是封闭创伤的屏障，类似“创口贴”，活性细胞直接贴合创面，则表皮细胞无需长时间培养至角化，缩短活性组织制备时间，是组织工程需要考虑的技术问题。

综上所述，组织工程面临的根本问题是如何在未添加牛血清和牛垂体提取物以及其它动物衍生制品而导致的细胞培养液部分营养缺失和不足等问题下，通过细胞-细胞相互作用和医用生物膜载体特殊处理，产生具活性细胞的人工组织，为烧烫伤、慢性溃疡等皮肤缺损患者的临床治疗提供活性种子细胞，促进伤口愈合、皮肤再生，同时避免免疫排斥及病毒传染的危险。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新的无胎牛血清和牛垂体提取物的人工组织细胞培养液。本发明运用系统生物学技术，在深入细致的研究细胞分离，培养基，细胞相互作用，生物膜材料处理等各个环节对细胞生长，分化的影响的基础上，充分利用各个构建环节之间的互补关系，对人工活性组织构建过程中对牛血清及其它动物衍生品的高度依赖的难题进行了改进。因此本发明在细胞培养液中未添加牛血清和牛垂体提取物以及其它动物衍生制品，而仅仅包含了基础培养液和活性分子，从而完全避免了牛血清和动物衍生制品的免疫排斥，病毒传播等潜在问题，增强人工活性组织的安全性和移植存活率。

本发明需要解决的技术问题之二是提供一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织及其构建方法。本发明在无血清等动物衍生物而导致的培养基部分营养的缺失和不足等问题下，通过氧气离子体对医用生物膜进行特殊处理，改变细胞的培养环境，促进成纤维细胞和表皮细胞在处理过生物膜载体上形成适宜的微生境,刺激细胞发挥自身潜能，增殖、分裂和分泌生长所需的因子，4～7天即可在医用生物膜上形成具有成纤维细胞或/和表皮细胞的人工活性组织。活性细胞以医用生物膜作为支架，细胞活性高，成纤维细胞和表皮细胞分裂和移行能力强，能迅速归巢到创面，产生促进伤口愈合的因子，促进皮肤再生。生物膜又可作创面屏障，其材料、透水透气性、柔韧性可依临床需要进行调整，真正实现生物安全的“创口贴”式人工活性组织。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织的构建方法，该方法具体包括如下步骤：

(1)医用生物膜处理：首先将医用生物膜灭菌处理，然后用氧气离子体进行3秒～1小时的等离子清洗处理；

(2)细胞培养液配制：用于培养成纤维细胞的细胞培养液A，采用基础培养液DMEM，在该基础培养液DMEM中加入青霉素、链霉素双抗1～5000U/ml；用于培养表皮细胞的细胞培养液B，由以下体积百分比的物质构成：基础培养液DMEM 60％～85％；基础培养液HAM’s F-1210％～40％；以下成分5％～15％：青霉素、链霉素双抗1～5000U/ml；两性霉素B 0.5～6000ng/ml；腺嘌呤0.06～370ng/ml；胰岛素0.02～530ug/ml；氢化可的松0.05～490ug/ml；三碘甲腺原氨酸0.03～280ng/ml；转铁蛋白0.07～460ug/ml；三者体积百分比之和为100％，制成细胞培养液B；

(3)采用步骤(2)配制的细胞培养液进行成纤维细胞和表皮细胞的分离与培养；

(4)将步骤(3)所得成纤维细胞接种于步骤(1)的医用生物膜上，形成含成纤维细胞的人工活性组织；然后将步骤(3)所得表皮细胞接种到医用生物膜上，形成含表皮细胞的人工活性组织；将步骤(3)所得成纤维细胞和表皮细胞接种到医用生物膜上，形成含成纤维细胞和表皮细胞的人工活性组织。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)具体为：首先将医用生物膜消毒灭菌处理，并置于组织细胞培养器皿中，固定住，置于等离子清洗机(plasma cleaner)用氧气离子体处理3秒钟到1小时，处理后的医用生物膜经清洗后可用于细胞的培养和扩增。医用生物膜的材料，包括但不限于胶原、透明质酸膜、壳聚糖和聚乳酸、聚羟基乙酸聚丙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰亚胺、聚酯、环氧树脂等高聚物医用生物材料。医用生物膜使用但不限于有孔或无孔、棉质或非棉质、可降解或不可降解、薄膜或网状等。其大小可根据临床需要任意裁剪。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，所述成纤维细胞分离与培养具体包括如下步骤：

1)取材：人成纤维细胞源自多种组织，包括男性新生儿包皮、真皮、腱、肺、脐带、软骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜和肠；所述人成纤维细胞优选男性新生儿包皮和自体皮中成纤维细胞，包括干细胞、皮肤或口腔来源的成纤维细胞、皮肤毛乳头细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、角膜细胞以及基因工程改造的上述细胞。经手术分离的以上皮源，置入无菌生理盐水中，送入细胞培养室；

2)消化：去除皮下脂肪组织、筋膜及毛细血管，用磷酸盐缓冲盐水1×PBS漂洗两次，剪成条状，浸于0.05％胰蛋白酶中4℃过夜；消化4～24小时后，将皮肤倒入无菌平皿，观察皮肤降解情况，用镊子剥离表皮和真皮，刀片刮拭真皮正面和背面，1×PBS漂洗三次；将真皮切碎，移入含0.1％胶原酶的无菌平皿中，37℃消化2～24小时，离心，弃去上清，收集沉淀；

3)原代培养：将沉淀用少量细胞培养液A悬浮，放入细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂,100％相对湿度的培养箱中培养，一周后观察是否有成纤维细胞游离，若有成纤维细胞，3～4天换液，使细胞达到一定密度；

4)传代培养：当细胞培养密度达到60～100％时，经1×PBS漂洗三次，0.25％胰蛋白酶消化，37℃，1～5分钟；加入细胞培养液A终止消化，移入离心管中，离心，弃去上清液，加入10ml细胞培养液A培养液，混匀，台盼蓝染色计数，计数后制成单细胞悬液，按5×10³～5×10⁵/cm²接种于细胞培养瓶中；3～4天换液，直到细胞培养密度达到60～100％时，再传代培养。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，所述表皮细胞分离具体包括如下步骤：

1)取材：人表皮细胞源自多种组织，包括男性新生儿包皮、真皮、腱、肺、脐带、软骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜和肠；所述人表皮细胞优选皮肤或口腔粘膜来源的自体表皮细胞，包括成人皮肤干细胞、黑色素细胞、角膜上皮细胞、角膜干细胞、肠粘膜表皮细胞、尿道上皮细胞、膀胱上皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、肝细胞和表皮细胞以及基因工程改造的上述细胞。经手术分离的以上皮源，置入无菌生理盐水中，送入细胞培养室；

2)消化：去除皮下脂肪组织、筋膜及毛细血管，用1×PBS漂洗两次，剪成条状，浸于0.05％胰蛋白酶中4℃过夜；

3)分离表皮细胞：消化4～24小时后，将皮肤倒入无菌平皿中，观察皮肤降解情况，将皮肤移入无菌平皿中，用镊子剥离表皮和真皮，刀片刮拭表皮背面和真皮正面，反复用镊子揉捏表皮，经200目不绣钢滤网过滤，收集滤液，离心，加入细胞培养液B 10ml，混匀，台盼蓝染色计数，检测细胞活力，分离的细胞用于构建人工活性组织。

作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，形成含成纤维细胞的人工活性组织具体为：将传代培养的成纤维细胞，经1×PBS漂洗三次，0.25％胰蛋白酶消化，37℃，5分钟；终止消化，移入离心管中，离心，弃去上清液，加入10ml细胞培养液A，混匀，台盼蓝染色计数；计数后制成单细胞悬液，按5×10³～5×10⁵/cm²接种于含医用生物膜的细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养2～7天，形成具有成纤维细胞的人工活性组织。

作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，形成含表皮细胞的人工活性组织具体为：将新鲜分离，60～100％活性的表皮细胞，用细胞培养液B悬浮，接种到处理过的医用生物膜上，接种细胞密度为5×10³～5×10⁵/cm²，37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时，更换新鲜细胞培养液B，继续培养2～7天，形成含表皮细胞的人工活性组织。

作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，形成含成纤维细胞和表皮细胞的人工活性组织具体为：将具有60％～100％活性的成纤维细胞和表皮细胞，用细胞培养液B悬浮，接种到处理过的医用生物膜上，接种细胞密度为5×10³～5×10⁵/cm²。37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时，更换新鲜细胞培养液B，继续培养2～7天，形成含成纤维细胞和表皮细胞的人工活性组织。

在本发明的另一方面，提供采用上述方法构建得到的创口贴式人工活性组织。

在本发明的另一方面，提供专用于上述方法的细胞培养液，由以下体积百分比的物质构成：基础培养液DMEM 60％～85％；基础培养液HAM’s F-12 10％～40％；以下成分5％～15％：青霉素、链霉素双抗1～5000U/ml；两性霉素B 0.5～6000ng/ml；腺嘌呤0.06～370ng/ml；胰岛素0.02～530ug/ml；氢化可的松0.05～490ug/ml；三碘甲腺原氨酸0.03～280ng/ml；转铁蛋白0.07～460ug/ml；三者体积百分比之和为100％，制成细胞培养液，该细胞培养液不包括：胎牛血清和牛垂体提取物。

在医用生物膜上建立活性人工组织后，可将医用生物膜的细胞面贴合于伤口(类似于创口贴方式)，活性细胞迅速归巢到伤口，形成种子细胞，促进皮肤再生,可用于烧烫伤和慢性溃疡等皮损的治疗。本发明的构建方法也适用于产生角膜、活性重组蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明运用最新的系统生物学技术，依据细胞培养液优化，细胞间相互作用、生物膜支架处理等各个环节的互补关系，解决了人工活性组织构建过程中的关键性问题：对牛血清及其它动物衍生品的高度依赖。在活性组织构建全程，使用的细胞培养液未添加牛血清和牛垂体提取物，仅仅添加了基础培养液和活性分子，从而完全避免了牛血清和动物衍生制品的免疫排斥，疾病毒传播等潜在问题，但完全不影响成纤维细胞和表皮细胞的生长。该培养液成分确定，配制简便，成本低，安全性高，稳定性好，保质期长，利于企业化生产和商品化。用此培养液，细胞能生长于特殊处理的生物膜上，细胞活性高，可迅速归巢到创面，产生促进伤口愈合的因子，利于皮肤再生。

2、解决国内外商品使用胶原作为组织支架的弊端，运用特殊处理的医用生物膜形成适宜的微生境，在无血清细胞培养液部分营养缺失的情况下，仍能使成纤维细胞和表皮细胞快速生长，避免人工组织中胶原引起的过敏反应和免疫排斥，增强组织的安全性和再生率。通过对生物膜载体的特殊处理，改变细胞的培养环境，在生物膜载体上形成适宜细胞相互作用的微生境，刺激人成纤维细胞和表皮细胞发挥自身潜能，使细胞在不同生长阶段，分泌自身所需的生长因子，4～7天即在生物膜上形成具有活性细胞的人工组织。

3、简化制备程序，表皮细胞无需角化形成屏障，由医用生物膜作为防止创面感染的隔离屏障，因此大大缩短制备时间，4～7天即可形成高活性薄层细胞组织。细胞一旦与创面接触，迅速归巢到创面，形成种子效应，产生促伤口愈合的因子，利于皮肤再生；医用生物膜非侵入伤口，因此其材料、大小、透气透水性，柔韧性和强度皆可依临床需要进行调整，真正实现“创口贴”式人工活性组织。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是本发明实施例4中成纤维细胞在医用生物膜上的生长示意图(放大倍数：10x10)；其中,A代表无血清，B代表有血清；

图2是本发明实施例4中表皮细胞在医用生物膜上的生长示意图(放大倍数：10x10)；其中,A代表无血清，B代表有血清；

图3是本发明实施例4中成纤维细胞和表皮细胞在医用生物膜上的生长示意图(放大倍数：10x10)；其中,A代表无血清，B代表有血清；

图4是本发明实施例5中免疫荧光检测医用生物膜上表皮细胞的活性和特异性的示意图(放大倍数：10x40)；

图5是本发明实施例5中DAPI和免疫荧光检测医用生物膜上成纤维细胞和表皮细胞的活性和特异性的示意图(放大倍数：10x40)。

具体实施方式：

本发明是一种生物安全的活性人工组织的构建方法，包括人体组织中分离成纤维细胞和表皮细胞，成纤维细胞原代和传代培养，成纤维细胞和表皮细胞构建在医用生物膜上，相应细胞培养液的配制，列举以下实施例对本发明具体步骤进行详细说明：

实施例1细胞培养液配制

细胞培养液A(人工组织成纤维细胞培养液)：采用基础培养液DMEM(HyClone,USA),在基础培养液DMEM中加入青霉素、链霉素双抗1～5000U/ml；

细胞培养液B(人工组织表皮细胞培养液):由以下体积百分比的物质构成：基础培养液DMEM 60％～85％；基础培养液HAM’s F-12(ScienCell,USA)10％～40％；以下成分5％～15％：青霉素、链霉素双抗1～5000U/ml；两性霉素B 0.5～6000ng/ml；腺嘌呤0.06～370ng/ml；胰岛素0.02～530ug/ml；氢化可的松0.05～490ug/ml；三碘甲腺原氨酸0.03～280ng/ml；转铁蛋白0.07～460ug/ml；三者体积百分比之和为100％，以上培养液DMEM、HAM’s F-12均按配方加入相应体积液体，青霉素、链霉素双抗、两性霉素B、腺嘌呤、胰岛素、氢化可的松、三碘甲腺原氨酸、转铁蛋白配成一定浓度的母液，按配方浓度加入相应体积液体，三者体积百分比之和为100％，调pH 7.2～7.4,用0.2μm无菌滤膜过滤，分装使用。

实施例2真皮成纤维细胞分离与培养

1)取材：

人成纤维细胞可源自多种组织，包括但不限于男性新生儿包皮、真皮、腱、肺、脐带、软骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜和肠。细胞供体可在发育和年龄方面不同，细胞可来源于新生儿或者更年长个人，包括成人的供体组织，例如间充质干细胞，可用于本发明并诱导分化，发育为期望的组织。成纤维细胞优选男性新生儿包皮和自体皮。

经手术分离的以上皮源，置入无菌生理盐水中，送入细胞培养室。

2)消化

用剪刀仔细去除皮下脂肪组织、筋膜及毛细血管，用磷酸盐缓冲盐水(1×PBS)漂洗两次，剪成约0.5cm条状，浸于0.05％胰蛋白酶中4℃过夜。消化4～24小时后，将皮肤倒入无菌平皿，观察皮肤降解情况，用镊子剥离表皮和真皮，刀片刮拭真皮正面和背面。1×PBS漂洗3次。将真皮切碎，移入含0.1％胶原酶的无菌平皿中，37℃消化2～24小时，2000rpm/min离心5分钟，弃去上清，收集沉淀。

3)原代培养

将沉淀用少量细胞培养液A悬浮，放入细胞培养瓶中。37℃，5％CO₂,100％相对湿度的培养箱中培养，一周后观察是否有成纤维细胞游离，若有成纤维细胞，3～4天换液，使细胞达到一定密度。

4)传代培养

当细胞培养密度达到60～100％时，经1×PBS漂洗三次，0.25％胰蛋白酶消化，37℃，1～5分钟。加入细胞培养液A终止消化，移入离心管中，1500rpm/min离心5分钟，弃去上清液，加入10ml细胞培养液A培养液，混匀，台盼蓝染色计数。计数后制成单细胞悬液，按5×10³～5×10⁵/cm²接种于细胞培养瓶中。3～4天换液，直到细胞培养密度达到60～100％时，再传代培养。

实施例3表皮细胞的分离

1)取材：

人表皮细胞可源自多种组织，包括但不限于男性新生儿包皮、真皮、腱、肺、脐带、软骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜和肠。细胞供体可在发育和年龄方面不同，细胞可来源于新生儿或者更年长个人，包括成人的供体组织，例如间充质干细胞，可用于本发明并诱导分化，发育为期望的组织。人表皮细胞可选自体皮或者异体皮。

经手术分离的以上皮源，置入无菌生理盐水中，送入细胞培养室。

2)消化

用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织、筋膜及毛细血管，用1×PBS漂洗两次，剪成约0.5cm条状，浸于0.05％胰蛋白酶中4℃过夜。

3)分离表皮细胞

消化4～24小时后，将皮肤倒入无菌平皿中，观察皮肤降解情况，将皮肤移入无菌平皿中，用镊子剥离表皮和真皮，刀片刮拭表皮背面和真皮正面，反复用镊子揉捏表皮，经200目不绣钢滤网过滤，收集滤液，2000rpm/min离心10分钟，加入细胞培养液B 10ml,混匀，台盼蓝染色计数，检测细胞活力。分离的细胞用于构建人工活性组织。

实施例4人工活性组织构建

1)膜材料

各种来源的医用生物膜，使用但不限于胶原、透明质酸膜、壳聚糖或聚乳酸、聚羟基乙酸、聚丙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰亚胺、聚酯、环氧树脂等高聚生物医药材料等。医用生物膜使用但不限于有孔或无孔、棉质或非棉质、可降解或不可降解、薄膜或网状等。大小可依临床需要剪裁。

2)膜处理

将一定大小的医用生物膜，灭菌处理，使用时，置于细胞培养皿中，固定住，置于等离子清洗机槽内，关闭清洗机封门，真空状态处理3秒～1小时(采用等离子清洗机用氧气离子体进行3秒～1小时的处理)，待压力平衡，打开封门，取出细胞培养皿。

3)建立含成纤维细胞的真皮组织

将传代培养的成纤维细胞，经1×PBS漂洗三次，0.25％胰蛋白酶消化，37℃，5分钟。终止消化，移入离心管中，1500rpm/min离心5分钟，弃去上清液，加入10ml细胞培养液A，混匀，台盼蓝染色计数。计数后制成单细胞悬液，按5×10³～5×10⁵/cm²接种于含医用生物膜的细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养2～7天，形成具有成纤维细胞的真皮组织。同时以添加15％FCS的细胞培养液A培养成纤维细胞作为对照，观察细胞生长情况，结果显示实验组和对照组成纤维细胞的生长情况和细胞形态非常相似。参见图1，成纤维细胞在医用生物膜上的生长(A：无血清，B：有血清)。

4)建立含表皮细胞的皮肤组织

将新鲜分离，具有60％～100％活性的表皮细胞，用细胞培养液B悬浮，接种到处理过的医用生物膜上，接种细胞密度为5×10³～5×10⁵/cm²。37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时，更换新鲜细胞培养液B，继续培养2～7天，形成含表皮细胞的皮肤组织。同时以添加15％FCS的细胞培养液B培养表皮细胞作为对照，观察细胞生长情况，结果显示实验组和对照组表皮细胞的生长情况和细胞形态非常相似。参见图2，表皮细胞在医用生物膜上的生长(A：无血清，B：有血清)。

5)建立含成纤维细胞和表皮细胞的皮肤组织

将具有60％～100％活性的成纤维细胞和表皮细胞，用细胞培养液B悬浮，接种到处理过的医用生物膜上，接种细胞密度为5×10³～5×10⁵/cm²。37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时，更换新鲜细胞培养液B，继续培养2～7天，形成含成纤维细胞和表皮细胞的皮肤组织。同时以添加15％FCS的细胞培养液B培养成纤维细胞和表皮细胞作为对照，观察细胞生长情况，结果显示实验组和对照组表皮细胞的生长情况和细胞形态非常相似。参见图3，成纤维细胞(F)和表皮细胞(K)在医用生物膜上的生长(A：无血清，B：有血清)。

实施例5人工活性组织活性和特异性检测

为确认用无血清和牛垂体提取物培养液在医用生物膜上培养的人工组织，用DAPI和免疫荧光检测细胞的活性和特异性。DAPI(蓝色荧光)标记表皮细胞和成纤维细胞DNA；抗人广谱细胞角蛋白(Pancytokeratin)抗体和FITC标记的兔抗鼠IgG抗体(绿色荧光)标记表皮细胞，荧光显微镜下观察，用UV波段激发，测定细胞活性和特异性。主要步骤：4天的人工组织培养物，吸除培养液上清，用预温的1×PBS洗3次；加入4％冷的多聚甲醛固定20分钟，自然干燥10分钟，1×PBS洗3次；加入0.2％Triton X-100通透10分钟，1×PBS洗3次；牛血清封闭，37℃，20分钟；一抗鼠抗人广谱细胞角蛋白抗体4℃孵育过夜，PBS洗3次，二抗FITC标记的兔抗鼠IgG抗体37℃孵育30分钟；PBS洗3次。含成纤维细胞和表皮细胞的人工活性组织再用DAPI染色液室温孵育15分钟，PBS洗3次。荧光显微镜下观察，用UV波段激发，照相保存实验结果。参见图4，可以证明免疫荧光检测医用生物膜上表皮细胞(K)的活性和特异性；参见图5，可以证明DAPI和免疫荧光检测医用生物膜上成纤维细胞(F)和表皮细胞(K)的活性和特异性。

上述对比实验结果证明，采用本发明无血清和垂体提取物培养液培养的成纤维细胞和表皮细胞，与采用常规的有血清培养液培养的成纤维细胞和表皮细胞相比，其生长状况和细胞形态非常相似，经检测细胞活性高。显微镜下观察，人工组织厚度0.1mm～0.3mm,成纤维细胞单层生长，表皮细胞单层或者团聚状生长，成纤维细胞和表皮细胞分裂能力强，具迁移性，可迅速归巢到创面，形成组织再生的种子细胞。因此是一种生物安全的创口贴式人工活性组织。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，对本发明的细胞培养液和技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (12)

1.一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)医用生物膜处理：首先将医用生物膜灭菌处理，然后用氧气离子体进行3秒～1小时的等离子清洗处理；

(2)细胞培养液配制：用于培养成纤维细胞的细胞培养液A，采用基础培养液DMEM，在该基础培养液DMEM中加入青霉素、链霉素双抗1～5000U/ml；用于培养表皮细胞的细胞培养液B，由以下体积百分比的物质构成：基础培养液DMEM 60％～85％；基础培养液HAM’s F-1210％～40％；以下成分5％～15％：青霉素、链霉素双抗1～5000U/ml；两性霉素B 0.5～6000ng/ml；腺嘌呤0.06～370ng/ml；胰岛素0.02～530ug/ml；氢化可的松0.05～490ug/ml；三碘甲腺原氨酸0.03～280ng/ml；转铁蛋白0.07～460ug/ml；三者体积百分比之和为100％，制成细胞培养液；

(3)采用步骤(2)配制的细胞培养液用于成纤维细胞和表皮细胞的分离与培养；

(4)将步骤(3)所得成纤维细胞接种于步骤(1)的医用生物膜上，形成含成纤维细胞的人工活性组织；然后将步骤(3)所得表皮细胞接种到医用生物膜上，形成含表皮细胞的人工活性组织；将步骤(3)所得成纤维细胞和表皮细胞接种到医用生物膜上，形成含成纤维细胞和表皮细胞的人工活性组织。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)具体为：首先将医用生物膜消毒灭菌处理，并置于组织细胞培养器皿中，固定住，置于等离子清洗机处理3秒钟到1小时。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述成纤维细胞分离与培养具体包括如下步骤：

1)取材：人成纤维细胞源自多种组织，包括男性新生儿包皮、真皮、腱、肺、脐带、软骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜和肠；经手术分离的以上皮源，置入无菌生理盐水中，送入细胞培养室；

2)消化：去除皮下脂肪组织、筋膜及毛细血管，用磷酸盐缓冲盐水1×PBS漂洗两次，剪成条状，浸于0.05％胰蛋白酶中4℃过夜；消化4～24小时后，将皮肤倒入无菌平皿，观察皮肤降解情况，用镊子剥离表皮和真皮，刀片刮拭真皮正面和背面，1×PBS漂洗三次；将真皮切碎，移入含0.1％胶原酶的无菌平皿中，37℃消化2～24小时，离心，弃去上清，收集沉淀；

3)原代培养：将沉淀用少量细胞培养液A悬浮，放入细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂,100％相对湿度的培养箱中培养，一周后观察是否有成纤维细胞游离，若有成纤维细胞，3～4天换液，使细胞达到一定密度；

4)传代培养：当细胞培养密度达到60～100％时，经1×PBS漂洗三次，0.25％胰蛋白酶消化，37℃，1～5分钟；加入细胞培养液A终止消化，移入离心管中，离心，弃去上清液，加入10ml细胞培养液A培养液，混匀，台盼蓝染色计数，计数后制成单细胞悬液，按5×10³～5×10⁵/cm²接种于细胞培养瓶中；3～4天换液，直到细胞培养密度达到60～100％时，再传代培养。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述表皮细胞分离具体包括如下步骤：

1)取材：人表皮细胞源自多种组织，包括男性新生儿包皮、真皮、腱、肺、脐带、软骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜和肠；经手术分离的以上皮源，置入无菌生理盐水中，送入细胞培养室；

2)消化：去除皮下脂肪组织、筋膜及毛细血管，用1×PBS漂洗两次，剪成条状，浸于0.05％胰蛋白酶中4℃过夜；

3)分离表皮细胞：消化4～24小时后，将皮肤倒入无菌平皿中，观察皮肤降解情况，将皮肤移入无菌平皿中，用镊子剥离表皮和真皮，刀片刮拭表皮背面和真皮正面，反复用镊子揉捏表皮，经200目不绣钢滤网过滤，收集滤液，离心，加入细胞培养液B 10ml，混匀，台盼蓝染色计数，检测细胞活力，分离的细胞用于构建人工活性组织。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，形成含成纤维细胞的人工活性组织具体为：将传代培养的成纤维细胞，经1×PBS漂洗三次，0.25％胰蛋白酶消化，37℃，5分钟；终止消化，移入离心管中，离心，弃去上清液，加入10ml细胞培养液A，混匀，台盼蓝染色计数；计数后制成单细胞悬液，按5×10³～5×10⁵/cm²接种于含医用生物膜的细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养2～7天，形成具有成纤维细胞的人工活性组织。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，形成含表皮细胞的人工活性组织具体为：将新鲜分离，具有60～100％活性的表皮细胞，用细胞培养液B悬浮，接种到医用生物膜上，接种细胞密度为5×10³～5×10⁵/cm²，37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时，更换新鲜细胞培养液B，继续培养2～7天，形成含表皮细胞的人工活性组织。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，形成含成纤维细胞和表皮细胞的人工活性组织具体为：将具有60～100％活性的成纤维细胞和表皮细胞，用细胞培养液B悬浮，接种到处理过的医用生物膜上，接种细胞密度为5×10³～5×10⁵/cm²，37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时，更换新鲜细胞培养液B，继续培养2～7天，形成含成纤维细胞和表皮细胞的人工活性组织。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述人成纤维细胞选自男性新生儿包皮和自体皮中成纤维细胞，包括干细胞、皮肤或口腔来源的成纤维细胞、皮肤毛乳头细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、角膜细胞以及基因工程改造的上述细胞。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述人表皮细胞选自皮肤或口腔粘膜来源的自体表皮细胞，包括成人皮肤干细胞、黑色素细胞、角膜上皮细胞、角膜干细胞、肠粘膜表皮细胞、尿道上皮细胞、膀胱上皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、肝细胞和表皮细胞以及基因工程改造的上述细胞。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述医用生物膜选自下列高聚生物医用材料：胶原、透明质酸膜、壳聚糖或聚乳酸、聚羟基乙酸、聚丙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰亚胺、聚酯、环氧树脂。

11.一种采用权利要求1-10任一项所述方法构建得到的创口贴式人工活性组织。

12.一种细胞培养液，其特征在于，由以下体积百分比的物质构成：基础培养液DMEM60％～85％；基础培养液HAM’s F-12 10％～40％；以下成分5％～15％：青霉素、链霉素双抗1～5000U/ml；两性霉素B 0.5～6000ng/ml；腺嘌呤0.06～370ng/ml；胰岛素0.02～530ug/ml；氢化可的松0.05～490ug/ml；三碘甲腺原氨酸0.03～280ng/ml；转铁蛋白0.07～460ug/ml；三者体积百分比之和为100％，制成细胞培养液，该细胞培养液不包括：胎牛血清和牛垂体提取物。