CN103893825B - 含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法。涉及一种组织工程生物材料的制备技术。包括：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～50wt%的种子醪液与含有胶原溶液的培养基混合后置于培养容器中静置培养得到细菌纤维素/胶原膜；取羊膜细胞外基质膜浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面；继续静置培养1～6h，经纯化、干燥得一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，得到的复合材料具有良好的空间三维网络结构、生物相容性好、力学强度高，可作为组织工程支架材料应用于组织重建中。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程生物材料领域，特别是指一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法。
背景技术
羊膜是从细胞滋养层衍化而来，是两层胎膜的内层。正常羊膜薄而明，不含有血管、神经和淋巴管等结构，厚度为20～500μm。羊膜具有5层结构可分为：上皮层、基底膜层、致密层、纤维母细胞层、海绵层。去除细胞后的羊膜细胞外基质材料中含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分，表达多种生长因子及其mRNA的相关蛋白，能为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分，有利于细胞的生长繁殖；基底膜层较厚，有利于细胞的贴附和迁移，促进上皮化，防止其凋亡；致密层与海绵层的胶原纤维形成疏松的三维立体构型；组织相容性好，不表达人类白细胞抗原，羊膜异体移植后不诱导排斥反应；容易得到，且可塑性好，易于加工处理。因此羊膜是组织工程支架的理想材料，在临床上有良好的应用前景。目前，羊膜已作为胶原纤维支架、生物敷料、植入材料、黏膜替代材料等应用于组织工程重建黏膜、血管、尿道和皮肤组织。但由于羊膜薄而柔软，难以构建复层组织，同时生物力学性能较差，使用时极易褶皱撕裂不易缝合，使操作有一定难度，且移植后的羊膜易脱落溶解，作用期较短，使其在组织重建中受到限制。
细菌纤维素是一种天然的生物高聚物，具有超精细网状结构，由直径3～4纳米的微纤组合成40～60纳米粗的纤维束，并相互交织形成发达的超精细网络结构。且其化学纯度非常高，可作为理想的可降解载体材料应用于伤口敷料、药物载体材料等诸多领域。由于细菌纤维素具有良好的生物相容性、湿态时高的机械强度、良好的液体和气体透过性，使其在医学生物材料发展中表现出极大的优势。细菌纤维素的三维多孔网络结构符合组织工程材料的三维构建条件，且力学性能优异，湿态下为透明凝胶状，各种组织细胞在细菌纤维素中生长良好。综上所述，将细菌纤维素与羊膜细胞外基质材料结合构建具有三维网络结构的复合材料，有望制备出兼具组织相容性、机械性能良好的组织工程支架材料。
本专利采用微生物发酵培养方法原位复合羊膜细胞外基质材料。含胶原蛋白的细菌纤维素材料与羊膜细胞外基质材料，通过细菌纤维素纳米纤维及附着其上的胶原蛋白，与羊膜细胞外基质材料致密层与海绵层的胶原纤维相互作用且纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。在保证复合材料的组织相容性、生物活性的前提下，有效提高了羊膜细胞外基质材料的机械性能。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，得到的复合材料具有良好的空间三维网络结构、生物相容性好，力学强度高，可作为组织工程支架材料应用于眼科、皮肤科、血管外科、泌尿科、整形外科等重建角膜、皮肤、血管、尿道等组织中。
发明内容
本发明的目的是提供，一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法。涉及一种组织工程生物材料制备技术。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，得到的复合材料具有良好的空间三维网络结构、生物相容性好，力学强度高，可作为组织工程支架材料应用于眼科、皮肤科、血管外科、泌尿科、整形外科等重建角膜、皮肤、血管、尿道等组织中。
本发明公开了一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，包括：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～50wt%的种子醪液与含有胶原溶液的发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养得到细菌纤维素/胶原膜；取羊膜细胞外基质膜浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面；继续静置培养1～6h，经纯化处理，干燥处理得一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料。
作为优选的技术方案：
其中，如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的能分泌细菌纤维素的菌株是指木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。
如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的含有胶原溶液的发酵培养基是指将胶原溶于1～2wt%的醋酸水溶液中并与培养基混合得到的混合液体，其中胶原含量为0.5～2wt%。
如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的静置培养是指种子醪液与含有胶原溶液的发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养1～3d，其中种子醪液与含有胶原溶液的发酵培养基混合后在培养容器内的液面高度为0.5～2cm。通常情况下，细菌纤维素膜漂浮于培养液的上方，细菌纤维素在发酵培养过程中会消耗一部分培养基，同时一部分培养基通过蒸发失去。本专利中所述的方法通过控制培养液用量在合理范围，培养基用量过少将影响细菌纤维素的生物合成，过多则影响羊膜细胞外基质材料平铺于细菌纤维素膜上表面的步骤。
如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的细菌纤维素/胶原膜是指静置培养得到的水凝胶状细菌纤维素/胶原膜，厚度为0.5～1cm，其中细菌纤维素的三维网络纳米纤维上均匀附着有胶原蛋白。发酵过程中细菌首先在培养基中大量扩增并生物合成纤维素微纤，胶原蛋白分子黏附在纤维素微纤上；随着发酵时间延长形成纤维素纳米纤维，并且在纳米纤维上均匀附着胶原蛋白分子；最终形成水凝胶状细菌纤维素/胶原膜。
如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的羊膜细胞外基质材料是指来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的脱细胞生物羊膜。新鲜羊膜取自健康剖宫产产妇的胎盘，产前血清学检查排除乙肝、丙肝、梅毒及获得免疫缺陷综合征，取材处理均在无菌操作下完成；经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原，一般采用冷冻干燥法进行干燥并经辐照灭菌。
如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的铺于细菌纤维素/胶原膜上表面是指羊膜细胞外基质材料的海绵层与细菌纤维素/胶原膜上表面相接触。羊膜细胞外基质材料具有5层结构可分为：上皮层、基底膜层、致密层、纤维母细胞层、海绵层。其中致密层与海绵层的胶原纤维形成疏松的三维立体构型，有利于细菌纤维素/胶原膜中的纤维素纳米纤维与其形成相互贯穿的网络结构。基底膜层含有Ⅳ型和Ⅴ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及各种螯合蛋白，能够促进种子细胞的分化、增殖和迁移。因此，在形成复合材料时，将羊膜细胞外基质材料的海绵层与细菌纤维素/胶原膜上表面相接触，有利于细菌纤维素/胶原膜的纤维素纳米纤维进入海绵层的疏松胶原纤维内部，同时保持了基底膜层的生物活性。
如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的纯化处理是指复合材料在30～60℃ 1～3wt%的氢氧化钠水溶液中浸泡12～24h，并用去离子水清洗至中性。本专利中选用较低浓度的氢氧化钠在低温下对复合材料进行处理，氢氧化钠溶液浸泡能够彻底去除菌体蛋白和粘附在细菌纤维素膜上的残余培养基，确保复合材料的内毒素符合医用植入性材料的要求，同时低浓度氢氧化钠可以防止在处理过程中影响羊膜细胞外基质材料中含有的诸多蛋白及生长因子，防止细菌纤维素/胶原膜中均匀分布在三维网络纳米纤维上的胶原蛋白在处理时脱落。
如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的干燥处理是指冷冻干燥，将纯化处理后的复合材料在-20℃～-80℃下冷冻12～24h，然后真空干燥24～48h。冷冻干燥目的在于维持复合材料的三维网络微观结构。
如上所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料是指细菌纤维素/胶原膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于复合材料的上层，细菌纤维素/胶原膜位于复合材料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与细菌纤维素/胶原膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
本发明的另一目的是提供一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料，其特征是：包含细菌纤维素、胶原蛋白和羊膜细胞外基质。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本专利采用微生物发酵培养方法原位复合羊膜细胞外基质材料。含胶原蛋白的细菌纤维素材料与羊膜细胞外基质材料，通过细菌纤维素纳米纤维及附着其上的胶原蛋白，与羊膜细胞外基质材料致密层与海绵层的胶原纤维相互作用且纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。在保证复合材料的组织相容性、生物活性的前提下，有效增强了材料的机械性能，又为细胞生长提供了足够的三维空间结构，并且这些成分的存在有利于种植于复合材料上细胞的黏附和生长。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，得到的复合材料具有良好的空间三维网络结构、生物相容性好，力学强度高，可作为组织工程支架材料应用于眼科、皮肤科、血管外科、泌尿科、整形外科等重建角膜、皮肤、血管、尿道等组织中。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌活化制备成菌株浓度为30%的种子醪液。将胶原溶于1wt%的醋酸水溶液中并与培养基混合得到含有胶原0.5wt%的发酵培养基。将种子醪液与含有胶原的发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为0.5cm，静置培养1d得到膜厚度为0.5cm的水凝胶状细菌纤维素/胶原膜。
取来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与细菌纤维素/胶原膜上表面相接触。继续静置培养6h，得到的复合材料置于60℃ 1wt%的氢氧化钠水溶液中浸泡12h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-20℃下冷冻24h，然后真空干燥48h。得到细菌纤维素/胶原膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于复合材料的上层，细菌纤维素/胶原膜位于复合材料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与细菌纤维素/胶原膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
实施例2：
选取能分泌细菌纤维素的根瘤菌属和假单胞菌属活化制备成菌株浓度为40wt%的种子醪液。将胶原溶于1.5wt%的醋酸水溶液中并与培养基混合得到含有胶原1wt%的发酵培养基。将种子醪液与含有胶原的发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为1cm，静置培养2d得到膜厚度为0.6cm的水凝胶状细菌纤维素/胶原膜。
取来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与细菌纤维素/胶原膜上表面相接触。继续静置培养3h，得到的复合材料置于50℃ 2wt%的氢氧化钠水溶液中浸泡12h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-30℃下冷冻20h，然后真空干燥36h。得到细菌纤维素/胶原膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于复合材料的上层，细菌纤维素/胶原膜位于复合材料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与细菌纤维素/胶原膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
实施例3：
选取能分泌细菌纤维素的八叠球菌属和产碱菌属活化制备成菌株浓度为50wt%的种子醪液。将胶原溶于2wt%的醋酸水溶液中并与培养基混合得到含有胶原2wt%的发酵培养基。将种子醪液与含有胶原的发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为2cm，静置培养1d得到膜厚度为1cm的水凝胶状细菌纤维素/胶原膜。
取来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与细菌纤维素/胶原膜上表面相接触。继续静置培养1h，得到的复合材料置于30℃ 3wt%的氢氧化钠水溶液中浸泡16h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-40℃下冷冻18h，然后真空干燥30h。得到细菌纤维素/胶原膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于复合材料的上层，细菌纤维素/胶原膜位于复合材料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与细菌纤维素/胶原膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
实施例4：
选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌、气杆菌属和固氮菌属活化制备成菌株浓度为30wt%的种子醪液。将胶原溶于1wt%的醋酸水溶液中并与培养基混合得到含有胶原2wt%的发酵培养基。将种子醪液与含有胶原的发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为0.5cm，静置培养3d得到膜厚度为0.5cm的水凝胶状细菌纤维素/胶原膜。
取来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与细菌纤维素/胶原膜上表面相接触。继续静置培养6h，得到的复合材料置于30℃ 1wt%的氢氧化钠水溶液中浸泡24h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-60℃下冷冻16h，然后真空干燥24h。得到细菌纤维素/胶原膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于复合材料的上层，细菌纤维素/胶原膜位于复合材料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与细菌纤维素/胶原膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
实施例5：
选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌和无色杆菌属活化制备成菌株浓度为40wt%的种子醪液。将胶原溶于1wt%的醋酸水溶液中并与培养基混合得到含有胶原0.5wt%的发酵培养基。将种子醪液与含有胶原的发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为1cm，静置培养2d得到膜厚度为0.8cm的水凝胶状细菌纤维素/胶原膜。
取来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与细菌纤维素/胶原膜上表面相接触。继续静置培养4h，得到的复合材料置于40℃ 2wt%的氢氧化钠水溶液中浸泡20h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-80℃下冷冻12h，然后真空干燥24h。得到细菌纤维素/胶原膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于复合材料的上层，细菌纤维素/胶原膜位于复合材料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与细菌纤维素/胶原膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
实施例6
将实施例4制备的含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料用于细胞相容性实验，方法为：将实施例4制备的含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料用培养液预湿，植入人成纤维细胞，种植密度为8万，在DMEM/HamsF12（Dulbecco改良细胞培养液）培养液，pH 7.2，5％CO2的条件下饱和湿度培养，每2天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞的黏附、生长情况。结果发现：人成纤维细胞复合于材料4小时后，倒置相差显微镜下观察可见细胞紧密贴附于材料表面，仅少数细胞流落到培养瓶底贴壁生长。加入DMEM/HamsF12培养液继续培养8小时后观察，人成纤维细胞已经伸展，有多个突起。18小时后细胞大多呈梭形。培养2天后，贴附于材料的细胞数量增加。培养6天后细胞两侧突起伸长，贴附于材料。继续培养，细胞数量和形态无明显变化。由此说明，人成纤维细胞能黏附于含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料表面，保持良好的形态，并在材料上正常生长。
实施例7：
含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的皮下埋置实验
实验方法：取健康SD大鼠30只，性别不限，分为实验组和对照组，消毒，采用乙醚吸入麻醉，常规无菌操作，切开背部皮肤，实验组背部植入5张1×1cm2材料（分别取实施例1-5所制备的含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料），对照组切开后即缝合。观察动物术后一般情况和伤口愈合情况。术后6、12、20天处死各组动物，取出植入材料戊二醛固定，常规包埋切片，HE染色，光镜观察植入物周围淋巴细胞、巨噬细胞浸润情况。
实验表明：手术当天动物清醒后即可正常进食，伤口无红肿、渗液等炎性反应，所有创面均可良好愈合，手术切口无1例发生感染，动物无死亡、惊厥、中风等毒性反应，植入物周围软组织未见发黑、坏死、化脓、积液等表现，组织学观察术后6天，植入物周围有大量淋巴细胞，12天时，仅少量淋巴细胞，20天时，基本无淋巴细胞存在。证实本发明的材料无生物学毒性，有良好的组织相容性。
实施例8：
将实施例3-5制备的含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料用于兔角膜大面积碱烧伤的修复实验，并与未烧伤组（正常组）、烧伤未治疗组（阴性对照组）进行对照，其方法与常规角膜的移植实验相同，结果见表1。由该实验及其结果可知，在移植1周、2周和4周的过程中，该材料始终保持着良好的透明度，并稳定存在于植床，与植床逐渐整合，生物相容性好，无不良反应。
分级标准：1级-透明度很差、生物相容性很差、角膜病情恶化；2级-透明度较差、生物相容性较差、角膜病情恢复程度<5%；3级-透明度较好、生物相容性较好、角膜病情恢复程度<50%；4级-透明度良好、生物相容性好、角膜病情恢复程度>80%。
表1 兔角膜大面积碱烧伤的修复实验（n=3）
实施例9：
含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的医院临床实验
本发明实施例1制备的含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料经医院临床实验治疗共153例。其中涉及刀伤68例、烧烫伤52例、虫兽伤33例，其治疗效果详见表2。
表2中各种刀伤、烧烫伤、虫兽伤的疗效判定标准为：
1.痊愈：全身症状消失，局部肿胀消散，或脓液吸收消散，血白细胞总数正常。
2.显效：全身症状消失，肿胀、脓肿或疮口缩小了70%以上，血白细胞总数正常。
3.有效：全身症状减轻，肿胀、脓肿或疮口缩小了30%以上，70%以下，血白细胞总数接近正常。
4.无效：未达到有效标准。
表2 含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的临床实验
| 病例类型 | 病例数 | 痊愈 | 显效 | 有效 | 无效 | 治愈率 |
| 糖尿病足溃疡 | 68 | 65 | 2 | 1 | 0 | 95.59% |
| 下肢静脉性溃疡 | 52 | 50 | 1 | 1 | 0 | 96.15% |
| 疮疡或痈疖 | 33 | 32 | 1 | 0 | 0 | 96.97% |
Claims (10)
1. 一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征是：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～50wt%的种子醪液与含有胶原溶液的发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养得到细菌纤维素/胶原膜；取羊膜细胞外基质膜浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面；继续静置培养1～6h，经纯化处理，干燥处理得一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料。
2. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的能分泌细菌纤维素的菌株是指木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。
3. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的含有胶原溶液的发酵培养基是指将胶原溶于1～2wt%的醋酸水溶液中并与培养基混合得到的混合液体，其中胶原含量为0.5～2wt%。
4. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的静置培养是指种子醪液与含有胶原溶液的发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养1～3d，其中种子醪液与含有胶原溶液的发酵培养基混合后在培养容器内的液面高度为0.5～2cm。
5. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的细菌纤维素/胶原膜是指静置培养得到的水凝胶状细菌纤维素/胶原膜，厚度为0.5～1cm，其中细菌纤维素的三维网络纳米纤维上均匀附着有胶原蛋白。
6. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的羊膜细胞外基质膜是指来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的脱细胞生物羊膜。
7. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的平铺于细菌纤维素/胶原膜上表面是指羊膜细胞外基质膜的海绵层与细菌纤维素/胶原膜上表面相接触。
8. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的纯化处理是指复合材料在30～60℃ 1～3wt%的氢氧化钠水溶液中浸泡12～24h，并用去离子水清洗至中性。
9. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的干燥处理是指冷冻干燥，将纯化处理后的复合材料在-20℃～-80℃下冷冻12～24h，然后真空干燥24～48h。
10. 如权利要求1所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述的一种含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料是指细菌纤维素/胶原膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于复合材料的上层，细菌纤维素/胶原膜位于复合材料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与细菌纤维素/胶原膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
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