CN103816571B - 用于角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法。涉及一种组织工程生物材料的制备技术。包括：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～50wt%的种子醪液置入培养基中静置培养得到细菌纤维素膜；取经脱细胞处理并灭菌的干燥羊膜浸泡在培养基中，待羊膜完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养1～3d，再经纯化、干燥得到一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，得到的复合材料具有良好的空间三维网络结构、透明度高、生物相容性好，力学强度高，可作为组织工程角膜重建支架材料修复各种角膜损伤。

Description

用于角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程生物材料领域，特别是指一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)发布的报告，角膜疾病已成为仅次于白内障的第二大致盲眼病，我国约有500万患者，并以每年150～200万的速度递增。外伤、感染、遗传因素均能导致角膜结构损伤，引起视力下降甚至失明，角膜盲是致盲的主要原因之一。目前异体角膜移植是临床上治疗角膜盲的常用方法，但其存在角膜供体来源严重受限、术后免疫排斥反应强烈和并发医源性散光等缺陷难以克服。对于异体角膜移植失败及各种原因所导致的严重角膜血管翳患者，组织工程化角膜是一种很有希望的治疗方法。组织工程化角膜利用可降解的生物性支架材料复合种子细胞，通过细胞的扩增获得类似正常角膜性能和结构的人工供体角膜，从而能够有效地避免非生物性角膜材料植入后的严重并发症。在构建组织工程化角膜上皮的过程中，支架材料是种子细胞增殖的场所，引导细胞的生长并决定所构建组织的形态。人们一直在寻找真正适合构建组织工程角膜上皮的支架材料，但研制出兼具组织相容性、透光性、机械性能良好的材料仍是一个难题。

羊膜是一层半透明膜，不含血管、神经和淋巴管等结构，具有抗新生血管、免疫原性低、抑制成纤维化以及减少瘢痕形成等特点，是组织工程角膜较为理想的载体材料。羊膜基底膜含有Ⅳ型和Ⅴ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及各种螯合蛋白，能够促进种子细胞的分化、增殖和迁移。大量的研究已经成功地构建出角膜上皮层、基质层和内皮层。但由于羊膜薄而柔软，无法构建复层角膜组织，同时生物力学性能较差，使用时极易褶皱撕裂不易缝合，使操作有一定难度，且移植后的羊膜易脱落溶解，作用期较短，常常达不到治疗的效果。

细菌纤维素是一种天然的生物高聚物，具有超精细网状结构，由直径3～4纳米的微纤组合成40～60纳米粗的纤维束，并相互交织形成发达的超精细网络结构。且其化学纯度非常高，可作为理想的可降解载体材料应用于伤口敷料、药物载体材料等诸多领域。由于细菌纤维素具有良好的生物相容性、湿态时高的机械强度、良好的液体和气体透过性，使其在医学生物材料发展中表现出极大的优势。细菌纤维素的三维多孔网络结构符合角膜基质的三维构建条件，且力学性能优异，湿态下为透明凝胶状，角膜基质细胞在细菌纤维素中生长良好，并呈规律的极性排列，与正常角膜基质相似。综上所述，将细菌纤维素与羊膜材料结合构建具有三维网络结构的复合材料，可以制备出兼具组织相容性、透光性、机械性能良好的组织工程角膜重建材料。

本专利采用微生物发酵培养方法原位复合羊膜材料，在保证复合材料的组织相容性、透光性的前提下，有效提高了羊膜材料的机械性能，且复合材料具有与角膜基质相似的三维网络结构。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，得到的复合材料且具有良好的空间三维网络结构、透明度高、生物相容性好，力学强度高，可作为组织工程角膜重建支架材料修复各种角膜损伤。可用于角膜移植各种供体材料的替代物，治疗角膜外伤及化学烧伤疾病，角膜肿瘤及增生性疾病，角膜血管化和瘢痕疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反应疾病等角膜病变中应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法。涉及一种组织工程生物材料制备技术。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，得到的复合材料且具有良好的空间三维网络结构、透明度高、生物相容性好，力学强度高，可作为组织工程角膜重建支架材料修复各种角膜损伤。

本发明公开了一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，包括：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～50wt%的种子醪液置入发酵培养基中静置培养得到细菌纤维素膜；取经脱细胞处理并灭菌的干燥羊膜浸泡在培养基中，待羊膜完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养1～3d，经纯化处理，干燥处理得到一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料。

作为优选的技术方案：

其中，如上所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，所述的能分泌细菌纤维素的菌株是指木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。

如上所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，所述的静置培养得到细菌纤维素膜是指种子醪液与发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养1～3d，得到水凝胶状细菌纤维素膜，其中种子醪液与发酵培养基体积为在培养容器中达到0.5～2cm的液面高度，得到的细菌纤维素膜厚度为0.5～2cm。发酵过程中细菌首先在培养基中大量扩增并生物合成纤维素微纤，随着发酵时间延长形成纤维素纳米纤维最终形成水凝胶状细菌纤维素膜。通常情况下，细菌纤维素膜漂浮于培养液的上方，细菌纤维素在发酵培养过程中会消耗一部分培养基，同时一部分培养基通过蒸发失去。本专利中所述的方法通过控制培养液用量在合理范围，培养基用量过少将影响细菌纤维素的生物合成，过多则影响羊膜平铺于细菌纤维素膜上表面的步骤。

如上所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，所述的羊膜是指来源安全，经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原并且辐照灭菌的脱细胞生物羊膜。新鲜羊膜取自健康剖宫产产妇的胎盘，产前血清学检查排除乙肝、丙肝、梅毒及获得免疫缺陷综合征，取材处理均在无菌操作下完成；经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原，一般采用冷冻干燥法进行干燥并经辐照灭菌。本专利所述羊膜为市售脱细胞生物羊膜产品。

如上所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，所述的纯化处理是指复合材料经1～3wt%的氢氧化钠水溶液30～60℃浸泡12～24h，并用去离子水清洗至中性。本专利中选用较低浓度的氢氧化钠在低温下对复合材料进行处理，氢氧化钠溶液浸泡能够彻底去除菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，确保复合材料的内毒素符合医用植入性材料的要求，同时低浓度氢氧化钠可以防止在处理过程中影响羊膜中含有的各种胶原及蛋白。

如上所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，所述的干燥处理是指冷冻干燥，将纯化处理后的复合材料在-20℃～-80℃下冷冻12～24h，然后真空干燥24～48h，冷冻干燥目的在于维持复合材料的三维网络微观结构。

如上所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料是指细菌纤维素与羊膜的复合膜，其中羊膜位于复合材料的中间层，且羊膜与上、下层的细菌纤维素膜结合紧密。羊膜材料的内部也存在细菌纤维素的微纤，并且这些微纤与上、下层的细菌纤维素膜相连接成为整体。

本发明的另一目的是提供一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料，其特征是：其组成包含细菌纤维素和经脱细胞处理并灭菌的干燥羊膜。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本专利采用微生物发酵培养方法原位复合羊膜材料，在细菌纤维素生物发酵的过程中原位添加脱细胞生物羊膜，在保证复合材料的组织相容性、透光性的前提下，有效提高了羊膜材料的机械性能，且复合材料具有与角膜基质相似的三维网络结构。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，得到的复合材料具有良好的空间三维网络结构、透明度高、生物相容性好，力学强度高，可作为组织工程角膜重建支架材料修复各种角膜损伤。可用于角膜移植各种供体材料的替代物，治疗角膜外伤及化学烧伤疾病，角膜肿瘤及增生性疾病，角膜血管化和瘢痕疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反应疾病等角膜病变中应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30wt%的种子醪液与发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为0.5cm，静置培养1d得到膜厚度为0.5cm的细菌纤维素膜。

取来源安全，经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原并且辐照灭菌的脱细胞生物羊膜（市售脱细胞生物羊膜产品）浸泡在培养基中，待羊膜完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养1d，得到的复合材料置于1wt%的氢氧化钠水溶液30℃浸泡12h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-20℃℃下冷冻24h，然后真空干燥24h。得到细菌纤维素与羊膜的复合材料，其中羊膜位于复合材料的中间层，且羊膜与上、下层的细菌纤维素膜结合紧密。羊膜材料的内部也存在细菌纤维素的微纤，并且这些微纤与上、下层的细菌纤维素膜相连接成为整体。

实施例2：

选取能分泌细菌纤维素的根瘤菌属和八叠球菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30wt%的种子醪液与发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为1cm，静置培养2d得到膜厚度为1cm的细菌纤维素膜。

取来源安全，经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原并且辐照灭菌的脱细胞生物羊膜（市售脱细胞生物羊膜产品）浸泡在培养基中，待羊膜完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养1d，得到的复合材料置于3wt%的氢氧化钠水溶液30℃浸泡12h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-80℃下冷冻12h，然后真空干燥24h。得到细菌纤维素与羊膜的复合材料，其中羊膜位于复合材料的中间层，且羊膜与上、下层的细菌纤维素膜结合紧密。羊膜材料的内部也存在细菌纤维素的微纤，并且这些微纤与上、下层的细菌纤维素膜相连接成为整体。

实施例3：

选取能分泌细菌纤维素的假单胞菌属和无色杆菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为40wt%的种子醪液与发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为2cm，静置培养3d得到膜厚度为2cm的细菌纤维素膜。

取来源安全，经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原并且辐照灭菌的脱细胞生物羊膜（市售脱细胞生物羊膜产品）浸泡在培养基中，待羊膜完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养3d，得到的复合材料置于2wt%的氢氧化钠水溶液40℃浸泡24h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-40℃下冷冻24h，然后真空干燥28h。得到细菌纤维素与羊膜的复合材料，其中羊膜位于复合材料的中间层，且羊膜与上、下层的细菌纤维素膜结合紧密。羊膜材料的内部也存在细菌纤维素的微纤，并且这些微纤与上、下层的细菌纤维素膜相连接成为整体。

实施例4：

选取能分泌细菌纤维素的气杆菌属和固氮菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为50wt%的种子醪液与发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为1cm，静置培养2d得到膜厚度为2cm的细菌纤维素膜。

取来源安全，经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原并且辐照灭菌的脱细胞生物羊膜（市售脱细胞生物羊膜产品）浸泡在培养基中，待羊膜完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养2d，得到的复合材料置于3wt%的氢氧化钠水溶液30℃浸泡24h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-80℃下冷冻24h，然后真空干燥48h。得到细菌纤维素与羊膜的复合材料，其中羊膜位于复合材料的中间层，且羊膜与上、下层的细菌纤维素膜结合紧密。羊膜材料的内部也存在细菌纤维素的微纤，并且这些微纤与上、下层的细菌纤维素膜相连接成为整体。

实施例5：

选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌和产碱菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为50wt%的种子醪液与发酵培养基混合后置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为0.5cm，静置培养1d得到膜厚度为1cm的细菌纤维素膜。

取来源安全，经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原并且辐照灭菌的脱细胞生物羊膜（市售脱细胞生物羊膜产品）浸泡在培养基中，待羊膜完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养1d，得到的复合材料置于2wt%的氢氧化钠水溶液50℃浸泡18h，并用去离子水清洗至中性。然后复合材料在-60℃下冷冻18h，然后真空干燥24h。得到细菌纤维素与羊膜的复合材料，其中羊膜位于复合材料的中间层，且羊膜与上、下层的细菌纤维素膜结合紧密。羊膜材料的内部也存在细菌纤维素的微纤，并且这些微纤与上、下层的细菌纤维素膜相连接成为整体。

实施例6：

将实施例1-3制备的细菌纤维素增强羊膜复合材料用于兔角膜大面积碱烧伤的修复实验，并与未烧伤组（正常组）、烧伤未治疗组（阴性对照组）进行对照，其方法与常规角膜的移植实验相同，结果见表1。由该实验及其结果可知，在移植1周、3周和6周的过程中，该复合材料始终保持着良好的透明度，并稳定存在于植床，与植床逐渐整合，生物相容性好，无不良反应。

分级标准：1级-透明度很差、生物相容性很差、角膜病情恶化；2级-透明度较差、生物相容性较差、角膜病情恢复程度<5%；3级-透明度较好、生物相容性较好、角膜病情恢复程度<50%；4级-透明度良好、生物相容性好、角膜病情恢复程度>80%。

表1 兔角膜大面积碱烧伤的修复实验（n=3）

实施例7

将实施例3制备的细菌纤维素增强羊膜复合材料用于细胞相容性实验，方法为：将实施例3制备的细菌纤维素增强羊膜复合材料用培养液预湿，植入人成纤维细胞，种植密度为5万，在DMEM/HamsF12（Dulbecco改良细胞培养液）培养液，pH 7.3，6％CO₂的条件下饱和湿度培养，每2天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞的黏附、生长情况。结果发现：人成纤维细胞复合于细菌纤维素增强羊膜复合材料6小时后，倒置相差显微镜下观察可见细胞紧密贴附于复合材料表面，仅少数细胞流落到培养瓶底贴壁生长。加入DMEM/HamsF12培养液继续培养12小时后观察，人成纤维细胞已经伸展，有多个突起。24小时后细胞大多呈梭形。培养2天后，贴附于复合材料的细胞数量增加。培养4天后细胞两侧突起伸长，贴附于复合材料。继续培养，细胞数量和形态无明显变化。由此说明，人成纤维细胞能黏附于复合材料表面，保持良好的形态，并在复合材料上正常生长。

Claims (7)

1. 一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，其特征是：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～50wt%的种子醪液置入发酵培养基中静置培养得到细菌纤维素膜；取经脱细胞处理并灭菌的干燥羊膜浸泡在培养基中，待羊膜完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养1～3d，经纯化处理，干燥处理得到一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料。

2.如权利要求1所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，其特征在于：所述的能分泌细菌纤维素的菌株选自木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属和固氮菌属中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，其特征在于：所述的静置培养得到细菌纤维素膜是指种子醪液与发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养1～3d，得到水凝胶状细菌纤维素膜，其中种子醪液与发酵培养基体积为在培养容器中达到0.5～2cm的液面高度，得到的细菌纤维素膜厚度为0.5～2cm。

4.如权利要求1所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，其特征在于：所述的羊膜是指来源安全，经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原并且辐照灭菌的脱细胞生物羊膜。

5.如权利要求1所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，其特征在于：所述的纯化处理是指复合材料经1～3wt%的氢氧化钠水溶液30～60℃浸泡12～24h，并用去离子水清洗至中性。

6.如权利要求1所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，其特征在于：所述的干燥处理是指冷冻干燥，将纯化处理后的复合材料在-20℃～-80℃下冷冻12～24h，然后真空干燥24～48h。

7.如权利要求1所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料的制备方法，其特征在于：所述的一种用于组织工程角膜重建的细菌纤维素增强羊膜复合材料是指细菌纤维素与羊膜的复合材料，其中羊膜位于复合材料的中间层，且羊膜与上、下层的细菌纤维素膜结合紧密，羊膜材料的内部也存在细菌纤维素的微纤，并且这些微纤与上、下层的细菌纤维素膜相连接成为整体。