CN102188748A

CN102188748A - 一种新型软骨细胞外基质膜及其制备方法

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Publication number: CN102188748A
Application number: CN2011101115827A
Authority: CN
Inventors: 谭洪波; 徐永清; 丁晶; 林月秋
Original assignee: KUNMING GENERAL HOSPITAL OF CHENGDU MILITARY REGION
Current assignee: KUNMING GENERAL HOSPITAL OF CHENGDU MILITARY REGION
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2031-04-29
Also published as: CN102188748B

Abstract

本发明公开一种新型软骨细胞外基质膜及其制备方法，该膜含有具备生物及细胞活性的细胞外基质成分，主要成分为脱细胞软骨基质中的二型胶原蛋白，其中还包含透明质酸及氨基多糖等软骨细胞外基质成分，按重量百分比，仿生的二型胶原蛋白成分含量为80-95％，透明质酸及氨基多糖含量为10-20％，采用脱细胞软骨基质制备的软骨细胞外基质生物膜，具备仿生的软骨细胞外基质成分，具备良好的细胞相容性，对宿主软骨组织无免疫排斥，可用于关节透明软骨组织损伤修复及重建，也可用于种子细胞接种载体及生长因子缓释载体，另因软骨细胞外基质中含有血管抑制因子成分所以该膜还可用于预防肌腱等组织粘连。

Description

一种新型软骨细胞外基质膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗用生物材料，具体的说，本发明是一种新型的软骨细胞外基质膜及其制备方法。

背景技术

关节软骨活动使用量巨大，容易在创伤及急慢性炎症中导致损伤，文献报道局部软骨损伤在膝关节镜手术的患者中高达63％的发生率。软骨生长代谢的生理机制尚不完全清楚，但目前认为关节软骨无血液，无淋巴、无神经，仅包含单一软骨细胞，细胞外基质含量高，细胞少并且缺少局部祖细胞，导致关节软骨自身修复能力很差。关节软骨损伤晚期终会导致骨软骨剥脱、关节渗出、关节面不完整，给患者造成关节肿胀、疼痛及活动障碍等巨大痛苦。

目前对有症状的关节软骨损伤基本呈现一种复杂的治疗方案选择，针对损伤面积和患者的特征采用保守治疗到修复治疗到表面替换治疗到最终的损失关节功能的关节融合。采用非侵入技术的保守治疗，比如：关节内皮质激素注射，关节液及软骨基质补充，关节灌洗或关节镜下滑膜清理，理疗或改变活动方式等，能缓解部分症状，但是不能产生软骨修复导致疗效不满意。表面替换治疗的人工关节置换术产生了良好的临床效果，但是其仍然存在相当的局限性，比如假体磨损，骨量丢失及翻修带来的并发症，对年轻患者及局部损伤患者具备很大问题。生物的软骨修复方案能够减少或推迟关节的晚期退变，改善关节软骨损伤的症状，其目的至少要达到为中青年患者软骨损伤后到关节置换的过渡期(bridge the gap)改善症状。

合成材料可以任意剪裁和无限量供应的优势，并且不存在天然材料所具备的免疫问题，但是合成材料的缺点是细胞亲和力差，其疏水特性和其酸性降解产物在体内易引起炎症反应，从而不利于细胞的粘附和生长。目前对软骨组织工程关于天然材料的研究有胶原和透明质酸等软骨自身成分。天然材料具备生物相容性好的优点，结构成分为细胞自身的细胞外基质，有利于种子细胞的生长、增殖及分化，对细胞的形态、表型和细胞的运动具备生理作用。理想的软骨组织工程材料研制是尽量满足仿生设计，即模拟天然软骨细胞外基质的成分和结构，为接种的软骨细胞提供仿生的细胞外环境，提供软骨细胞最适宜的生长分化再生环境。目前对脱细胞基质的研究表明，脱细胞基质去除了抗原性的细胞成分，保留了细胞外基质的大部分成分及结构，可能具备更好的应用前景。

目前针对有症状的关节局部软骨缺损修复成为一种趋势，也成为目前骨科医生的一种挑战，越来越多的手术治疗方法在实验室或临床出现。现在可选择或在实验中的方法包括关节镜下骨髓刺激和微骨折技术，包含或不包含细胞因子的合成支架或生物支架植入，粉碎软骨修复技术，自体或同种异体软骨细胞培养并回植技术(组织工程技术)等，尽管这些技术都是软骨修复的可选择的方案，但是仍然没有一种技术完全满意，达到软骨修复技术的“金标准”。以细胞植入的方式修复软骨损伤具备较好的修复效果，但是细胞植入时存在细胞丢失的问题，所以利用细胞外基质膜可以用于封闭细胞，防止细胞的丢失，有利于细胞修复软骨损伤，利用细胞外基质膜也有利于种子细胞种植于细胞膜上。有学者利用I/III型胶原构建的胶原膜接种种子细胞可以观察到软骨修复的效果，但是由于软骨内主要含有II型胶原和氨基多糖及透明质酸等细胞外基质，目前研究发现II型胶原及透明质酸等细胞外基质对维持软骨细胞及间充质干细胞向软骨细胞分化均具备重要作用，所以I/III型胶原构建的胶原膜对软骨修复具备一定的局限性。

发明内容

本发明拟克服I/III型胶原及其他多聚物构建的胶原膜或生物膜无法仿生软骨细胞外基质的缺点，提出一种新型的软骨细胞外基质膜及其制备方法，该细胞外基质膜可用于修复软骨损伤及防治肌腱等组织粘连。

本发明为了确实解决上述技术问题而提出的技术方案是：

一种新型软骨细胞外基质膜，其特征在于：该膜含有具备生物及细胞活性的细胞外基质成分，主要成分为脱细胞软骨基质中的二型胶原蛋白，其中还包含透明质酸及氨基多糖等软骨细胞外基质成分，按重量百分比，仿生的二型胶原蛋白成分含量为80-95％，透明质酸及氨基多糖含量为10-20％。

采用脱细胞软骨基质制备的软骨细胞外基质生物膜，具备仿生的软骨细胞外基质成分，具备良好的细胞相容性，对宿主软骨组织无免疫排斥，可用于关节透明软骨组织损伤修复及重建，也可用于种子细胞接种载体及生长因子缓释载体，另因软骨细胞外基质中含有血管抑制因子成分所以该膜还可用于预防肌腱等组织粘连。

一种新型软骨细胞外基质膜的制备方法，制备步骤如下：

a、取透明软骨组织，以4℃冰PBS液冲洗后将软骨组织置于含蛋白酶抑制剂的10mM Tris-HCl液中，3000转离心机清洗后置于含1mmol/l苯甲基磺酰氟及1％乙二胺四乙酸的蛋白酶抑制剂的10mMTris-HCl(pH7.5)液中备用；

b、将清洗后备用的软骨组织置于含蛋白酶抑制剂的冰Tris-HCl(10mM)液中，在4℃冰低温下于组织粉碎机中粉碎软骨组织，经滤网筛选直径500nm-2mm的软骨微粒；

c、将离心后的软骨微粒加入1％Triton X-100的Tris-HCl缓冲液，pH7.5的缓冲液内含前述的蛋白酶抑制剂，于恒温震荡机上震荡8h，去除细胞成分，7000rmp，4℃，7min，离心后PBS液冲洗3遍；冲洗后软骨微粒在1U/ml RNase A，50U/ml DNase I消化酶液中消化12h，37℃，轻微搅拌，离心后0.01M PBS液反复冲洗，称量软骨微粒湿重，将沉淀配成3-10％(w/v)软骨脱细胞基质浆；

d、取软骨脱细胞基质浆在容器中，静置于4℃环境中24-48h，在风速1-2m/s，脱细胞基质浆自行发生交联形成膜状软骨细胞外基质膜。

所说软骨细胞外基质膜构建的方式采用不损伤细胞外基质生物活性的低温冻干及常温晾干构建。

所述的细胞外基质成分是采用脱细胞方法获得，软骨脱细胞是采用粉碎软骨组织后经过脱细胞处理获得的，通过低温粉碎过程不会损害软骨细胞外基质的微观结构。

所说软骨细胞外基质膜构建时采用不同的胶原蛋白交联剂交联，增加膜之间的生物力学强度。所述的交联是指采用物理的及化学交联剂的交联，化学交联剂包含细胞毒性较小的物质。物理方法可选紫外线交联、重度脱水等；化学交联可选：戊二醛、碳化二亚胺、京尼平、叠氮二苯基膦等。

所说软骨细胞外基质膜的膜厚度通过细胞外基质在单位面积上的含量调节，介于10um～1cm厚度之间。

所说软骨细胞外基质膜的一侧无空隙，膜另一侧空隙通过冻干方式和细胞外基质浆浓度调整，空隙介于50～400um之间；无空隙膜和有空隙膜厚度均可依据细胞外基质浆浓度调整。

所说的脱细胞基质浆来源于人、猪、羊等动物的各种透明软骨组织。本发明提及的软骨来源于天然的关节透明软骨，包括肩、肘、腕、髋、膝、踝及指间关节，也可来源于耳廓及气管等其他部位的透明软骨。因为是生物来源，本发明提及的细胞外基质膜生物相容性及细胞相容性好。

所说的脱细胞基质浆浓度及脱细胞基质浆中的脱细胞颗粒大小在制备时调控。

软骨脱细胞基质是指采用物理、化学洗脱剂及酶消化等方法将粉碎的和片状的透明软骨组织及经处理的骨软骨组织进行脱细胞处理，并且对脱细胞处理后组织进行组织学定性检测及胶原、DNA和GAG成分进行定量检测，了解脱细胞效果和细胞外基质成分保留情况。

软骨组织较其他血供丰富的组织具备较弱的免疫原性，其主要原因在于：缺少血液和淋巴组织供应；细胞外基质对软骨组织的保护作用。但是研究发现软骨细胞存在免疫原性，主要组织相容性决定族基因控制的抗原存在于软骨细胞表面，所以发现游离软骨细胞移植中可以激发细胞介导的免疫反应，类似的免疫反应在同系统间移植就能观察到，但是完整的软骨块移植却未观察到这些免疫反应。这种现象提示细胞外基质具备免疫保护作用，软骨细胞表面抗原暴露时，会导致软骨移植失败。因此，软骨基质想用作异种或异体移植使用，需要剔除其中的抗原成分，其中包含软骨细胞表面的抗原成分。有学者采用冻干、脱水和循环冻融的方法来灭活兔鼻间隔软骨，再接种游离的软骨细胞，体外培养4周，软骨细胞可在显微镜下观察到生长于失活的异体软骨基质上，也说明灭活的软骨组织可作为细胞生长的支架。虽然用照射、冻干等物理方法可部分减低软骨组织的免疫原性，但是，大量细胞的残片仍然残留在软骨组织内，使其仍然具备相当程度的免疫原性，最终会导致其吸收。

本发明的优点和积极效果如下：

1、发明人提供的这种去除软骨组织中细胞成分后的脱细胞基质方法构建的细胞外基质膜不存在生物免疫原性，可以很好的运用于组织再生及组织修复中。

2、软骨脱细胞基质是生物来源的细胞外基质，具备适宜软骨细胞生长和间充质干细胞分化的细胞外基质成分，有利于软骨细胞生长。

3、采用粉碎后再采用脱细胞方法获得的软骨脱细胞基质，能够较大程度的去除软骨基质内的细胞成分及抗原成分，采用蛋白抑制剂保护及采用对蛋白损伤小的脱细胞试剂，能够较好的保存细胞外基质蛋白的生物活性，简化脱细胞方法能够减少脱细胞过程中可溶性分子的丢失。物理粉碎的方法能够保持软骨脱细胞基质周围的胶原蛋白显微结构，有利于提供软骨细胞或间充质干细胞生长的空间微细结构。

4、采用冻干及晾干等胶原物理交联方式能够保持胶原蛋白的生理结构，不会造成化学交联剂带来的细胞毒性。而另外采用化学交联剂可以增加或调控细胞外基质膜的的交联强度，然后经过大量的清洗可以减少化学交联剂的细胞毒性。

5、通过本发明构建的细胞外基质膜可以通过单位面积上脱细胞基质浆的量和浓度来调控细胞外基质膜的厚度和交联时间。通过调控脱细胞基质浆的浓度和冻干时间及冻干速度的控制可以调控细胞外基质膜之间的胶原空隙率和空隙大小。

6、软骨细胞外基质中含有血管生长抑制物质和细胞相容的胶原蛋白，软骨组织的这种特性可以用于预防或治疗组织止血及肌腱及肌肉组织中的粘连的发生。

具体实施方式

实施例1：软骨脱细胞基质浆制备

在无菌超净台条件下用手术刀片切取新鲜尸体膝关节透明软骨，以4℃冰PBS液冲洗3次，将软骨组织置于含蛋白酶抑制剂的10mMTris-HCl液中，3000转离心机清洗3遍后置于含蛋白酶抑制剂含(1mmol/l苯甲基磺酰氟及1％乙二胺四乙酸)的10mM Tris-HCl液中备用。

将清洗后备用的软骨组织置于含蛋白酶抑制剂的冰Tris-HCl(10mM)液中，低温组织粉碎机粉碎组织，经滤网筛选软骨微粒，其直径为500nm-2mm。

将离心后的软骨微粒中加入1％Triton X-100Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，缓冲液内含前述的蛋白酶抑制剂，于恒温震荡机上震荡8h，去除细胞成分，7000rmp，4℃，7min，离心后PBS液冲洗3遍。

冲洗后软骨微粒在消化酶(1U/ml RNase A，50U/ml DNase I)液中消化12h，37℃，轻微搅拌，离心后0.0lM PBS液反复冲洗，称量软骨微粒湿重，将沉淀配成3-10％(w/v)软骨脱细胞基质浆。

实施例2：软骨细胞外基质膜制备

取5％浓度的脱细胞基质浆20ml，置入面积9cm2的玻璃容器中，静置于4℃环境中24h，可适当加速空气流通(风速1-2m/s)，脱细胞基质浆可自行发生交联，48h后可制备成膜状。再将支架置于254nm紫外线下，距离10cm，12h，紫外线交联增加膜机械强度。再将细胞外基质膜还可利用化学交联剂交联(将支架浸入40％乙醇溶液中30min后，采用5.5mM NHS(N-羟基丁二酰亚胺)及14mM EDAC(碳二亚胺)的混合水溶液，常温下将交联支架4h，0.01mmol PBS冲洗3遍后将支架冻干)。PBS清洗后晾干备用。

构建软骨细胞外基质膜，厚度为200um，其厚度可参考单位体积软骨脱细胞浆容量调整加以改变。细胞外基质膜组成材料为脱细胞软骨基质浆，或脱细胞软骨基质浆与透明质酸和葡氨聚糖(GAG)的混合物。最终细胞外基质膜组成材料为：二型胶原蛋白成分含量为80-95％，透明质酸及葡氨聚糖(GAG)含量5-20％。

实施例3

将体外扩增培养的软骨细胞以1*106/cm2接种于软骨缺损区，软骨缺损区可加用生物合成材料或生物来源材料构建的细胞外基质支架，将按照实施例2制备的细胞外基质膜封闭软骨缺损区，用纤维蛋白凝胶封闭或者利用可吸收缝线缝合，术后8周可观察到透明软骨修复。

实施例4

将按照实施例2制备的细胞外基质膜，消毒灭菌后，于手术中包裹修复的肌腱或创伤后的肌腱，细胞外基质膜不予缝合，术后可预防肌腱粘连。

实施例5

先将种子细胞(软骨细胞以1*10⁶/cm²)接种于一层按照实施例2制备的软骨细胞外基质膜上，然后在该接种的膜上放置一层软骨细胞外基质膜再接种种子细胞(软骨细胞以1*10⁶/cm²)，形成“三明治”样结构，利用DMEM培养基在培养皿中培养，4W后可观察到透明样软骨组织形成。

以上对本发明所提供的细胞外基质膜进行了较详细的介绍，本文中应用了具体个案对本发明的原理及实施方式进行阐述，以上实施的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时对本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种新型软骨细胞外基质膜，其特征在于：该膜含有具备生物及细胞活性的细胞外基质成分，按重量百分比，仿生的二型胶原蛋白成分含量为80-95％，透明质酸及氨基多糖含量为10-20％。

2.一种如权利要求1所述的新型软骨细胞外基质膜的制备方法，其特征在于步骤如下：

a、取透明软骨组织，以4℃冰PBS液冲洗后将软骨组织置于含蛋白酶抑制剂的10mM Tris-HCl液中，3000转离心机清洗后置于含1mmol/l苯甲基磺酰氟及1％乙二胺四乙酸的蛋白酶抑制剂的10mM Tris-HCl(pH7.5)液中备用；

c、将离心后的软骨微粒加入1％Triton X-100的Tris-HCl缓冲液，pH7.5的缓冲液内含前述的蛋白酶抑制剂，于恒温震荡机上震荡8h，去除细胞成分，7000rmp，4℃，7min，离心后PBS液冲洗3遍；冲洗后软骨微粒在1U/ml RNase A，50U/ml DNaseI消化酶液中消化12h，37℃，轻微搅拌，离心后0.01M PBS液反复冲洗，称量软骨微粒湿重，将沉淀配成3-10％(w/v)软骨脱细胞基质浆；

3.根据权利要求2所述的新型软骨细胞外基质膜的制备方法，其特征在于：所说软骨细胞外基质膜构建的方式采用不损伤细胞外基质生物活性的低温冻干及常温晾干构建。

4.根据权利要求2所述的新型软骨细胞外基质膜的制备方法，其特征在于：所说软骨细胞外基质膜构建时采用不同的胶原蛋白交联剂交联，增加膜之间的生物力学强度。

5.根据权利要求2所述的新型软骨细胞外基质膜的制备方法，其特征在于：所说软骨细胞外基质膜的膜厚度通过细胞外基质在单位面积上的含量调节，介于10um～1cm厚度之间。

6.根据权利要求2所述的新型软骨细胞外基质膜的制备方法，其特征在于：所说软骨细胞外基质膜的一侧无空隙，膜另一侧空隙通过冻干方式和细胞外基质浆浓度调整，空隙介于50-400um之间；无空隙膜和有空隙膜厚度均可依据细胞外基质浆浓度调整。

7.根据权利要求2所述的新型软骨细胞外基质膜的制备方法，其特征在于：所说的脱细胞基质浆来源于人、猪、羊等动物的各种透明软骨组织。

8.根据权利要求2所述的新型软骨细胞外基质膜的制备方法，其特征在于：所说的脱细胞基质浆浓度及脱细胞基质浆中的脱细胞颗粒大小在制备时调控。