CN105079881A - 一种阴道基质材料及其制备方法 - Google Patents
一种阴道基质材料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种阴道基质材料及其制备方法,其载体为猪或牛的阴道组织粘膜层,所述阴道组织粘膜层依次经下述处理:a、以含有苯甲基磺酰氟的去离子水溶液或Tris溶液震荡处理;b、在含十二烷基硫酸钠的水溶液或Tris-HCl缓冲溶液中震荡处理;c、用含Triton?X-100的Tris-HCl缓冲溶液震荡处理;d、在含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl缓冲液震荡处理;e、消毒和冻干。本发明提供的阴道基质材料具有更符合盆底修复或阴道重建的生物活性和生物学力学性能,其克服了阴道壁上皮有许多皱襞、组织结构致密、粘膜层难以剥离的困难,针对性的发明设计了特定的工艺及参数。本发明方法制备的脱细胞阴道基质材料免疫原性及细胞毒性低,生物性能良好,并富含有多种生物活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及细胞外基质及其制备方法,具体的说是涉及一种阴道基质材料及其制备方法。
背景技术
细胞外基质材料(亦称脱细胞基质材料)是由组织或器官脱细胞后剩余的结构和功能蛋白的复合体,其由胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖和多种生长因子等构成,它对细胞黏着,细胞分化和细胞与生物材料之间的连接有着重要的作用。并且,细胞外基质材料移植后会逐渐降解为单肽类物质,其具有很强的生物活性,具有抗菌性,趋化宿主细胞和促其有丝分裂的特性。因其具有来源广泛,无免疫原性,良好生物相容性,生物活性及抗菌性等优点,越来越受到人们的重视。
目前脱细胞基质材料通常采用动物组织或器官经过脱细胞处理后形成具有一定机械性能和生物性能的支架材料。现已公开报道的有关脱细胞基质材料的制备方法有很多。如CN103191466B公开的一种制备人体或动物脱细胞组织的方法,其是以人类或动物组织中的皮肤、胸腹膜、食道粘膜、心脏瓣膜、骨、软骨、肌腱等为基材,经过初步加工制成所需形状后,经过灭活、采用含过氧乙酸、氯化钠、表面活性剂、烧碱的溶液进行两次脱脂,然后采用过氧乙酸、氯化钠、表面活性剂、胰酶或胰蛋白酶的溶液进行脱细胞处理,最后保存、冻干,由此将动物组织或器官进行脱细胞处理。该方法列举了许多具体的人类/动物组织,但采用的都是同一种处理方法。本领域技术人员都知晓,在组织和器官脱细胞方法中,选用的组织不同,其脱细胞方法也不尽相同。每一种处理方法都会对所制备的支架材料的生物学组成以及组织的超微结构、机械性能产生不同的影响。另外,该文献也未曾公开任何一个具体实例,说明其所制的具体材料的生物学特性以及机械性能特点。因此,该文献对本领域技术人员不具有任何指导意义。諅惠等研究人员对脱细胞真皮基质制备及其生物相容性进行了研究,其采用的方法是采用新生小牛背部真皮组织,以0.5%SDS溶液水平振荡脱细胞,然后采用0.5%胰蛋白酶行胶原纤维结构重塑,再用甲醛浸泡进行交联,0.5%硫酸软骨素溶液中超声振荡进行表面修饰。该方法制备的是一种适合软骨细胞生长的生物支架(详见諅惠等.脱细胞真皮基质制备及其生物相容性研究.中国修复重建外科杂志2014年6月第28卷第6期)。CN101366975B(ZL200810150792.5)公开了一种脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法,该方法是以小肠粘膜下层为基材,首先通过刮除小肠粘膜、肌层和浆膜获得粘膜下层,然后放入0.1-1M的NaOH溶液中进行脱细胞处理,脱细胞处理的粘膜下层置入含DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合液中,进行酶处理,将酶处理的粘膜下层于冷冻保护液中浸泡处理后,再经冷冻干燥,形成脱细胞小肠粘膜下层生物材料的膜状产品。由此可见,目前对不同组织来源的材料的处理方法都不尽相同。
目前针对不同的疾病需求,动物组织脱细胞基质材料的研究有多种,如心脏、肝脏、肺脏、膀胱、皮肤、小肠粘膜、胸膜、腹膜、心包膜等等。阴道组织缺失、盆底损伤和机能退化造成的盆腔器官脱垂是妇产科常见的一些疾患。先天性无阴道(MRKH综合征)、两性畸形、创伤、肿瘤术后等均可导致阴道组织缺失。阴道组织缺失给患者躯体带来痛苦的同时,也给患者造成巨大的精神心理压力。盆底损伤和机能退化造成的盆腔器官脱垂(pelvicorganprolapse,POP),严重影响了中老年妇女的健康和生活质量。这两种疾病用到的脱细胞基质材料主要是以动物真皮、小肠粘膜和膀胱为基材,这可能是源于真皮、膀胱固有层或小肠粘膜下层比较容易进行切割、处理的缘故(如:选用真皮可采用机器切割方式或用切割刀,即可除去表皮,获得所需真皮材质;膀胱固有层和小肠粘膜下层由于具有上皮层和肌层且与所取组织连接疏松的生理结构的特性,因此比较容易获得)。并且,虽然已有材料的应用起到了一定的治疗效果,但其生物活性、生物力学性能及其治疗效果还有待进一步提高。研究者希望找到并制备出更适用于盆底修复、阴道重建的脱细胞基质材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更适用于盆底修复或阴道重建的脱细胞阴道基质材料及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的:
本发明所提供的脱细胞阴道基质材料,其载体为猪/牛阴道组织粘膜层,所述载体经以下方式处理:
(a)将猪/牛阴道组织粘膜层在含有苯甲基磺酰氟的去离子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震荡处理24-72小时;其中所述Tris溶液,其浓度为0.01M、pH为8.0;去离子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的浓度为0.1mM/L;
(b)将(a)步骤处理过的粘膜层放置在所含十二烷基硫酸钠的质量体积浓度为0.1-1%的水溶液或Tris-HCl缓冲溶液中震荡处理8-12小时;
(c)将(b)步骤处理过的粘膜层,经磷酸盐缓冲液漂洗,然后用所含TritonX-100的体积浓度为0.1-1%的Tris-HCl缓冲溶液震荡处理6-10天,再经磷酸盐缓冲液漂洗;
上述(c)、(b)步骤中的所有溶液及缓冲溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟;
(d)将(c)步骤处理过的粘膜层,放置在含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl缓冲溶液中,在32℃-37℃温度下震荡处理8-12小时,再经磷酸盐缓冲液漂洗;
(d)步所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.05M、pH值为8.0;其所含脱氧核糖核酸酶的浓度30-70U/mL;所含核糖核酸酶的浓度为1-5U/mL;
(e)将(d)步骤处理过的粘膜层,消毒和冻干,即得阴道基质材料。
本发明还提供了所述阴道基质材料的制备方法,具体包括以下步骤:
(a)将猪/牛阴道组织,采用钝器和锐器交替剥离除去阴道组织的外膜层及肌层,留取厚度均匀、无损伤的阴道粘膜层,漂洗后,放置在含有苯甲基磺酰氟的去离子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震荡处理24-72小时;其中所述Tris溶液的浓度为0.01M、pH为8.0;去离子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的浓度为0.1mM/L;
其中所述的钝器如机械手、机械钳;锐器如切割刀、手术刀、手术剪等,如此采用钝器和锐器交替剥离法,解决了阴道组织皱襞多、质地致密、粘膜层难以剥离的难题;
(b)将(a)步骤处理过的粘膜层放置在所含十二烷基硫酸钠的质量体积浓度为0.1-1%的水溶液或Tris-HCl缓冲溶液中震荡处理8-12小时;
(c)将(b)步骤处理过的粘膜层,经磷酸盐缓冲液漂洗,然后用所含TritonX-100的体积浓度为0.1-1%的Tris-HCl缓冲溶液震荡处理6-10天,再经磷酸盐缓冲液漂洗;
上述(c)、(b)步骤中的所有溶液及缓冲溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟;(c)步和(b)步中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.01M、pH为8.0;
(d)将(c)步骤处理过的粘膜层,放置在含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl缓冲溶液中,在32℃-37℃温度下震荡处理8-12小时,再经磷酸盐缓冲液漂洗;
其中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.05M、pH值为8.0,其所含脱氧核糖核酸酶的浓度30-70U/mL,所含核糖核酸酶的浓度1-5U/mL;
(e)将(d)步骤处理过的粘膜层,消毒和冻干,即得阴道基质材料。
所述阴道基质材料的制备方法中,步骤(e)中所述消毒的优选方案是:使用含过氧乙酸和乙醇的溶液将(d)步骤处理过的粘膜层在25℃条件下震荡处理2小时,振荡速率为80-200rpm,然后依次使用无菌磷酸盐缓冲液和无菌去离子水漂洗;其中,所述含过氧乙酸和乙醇的溶液中,所含过氧乙酸的体积百分含量为0.1%,所含乙醇的体积百分含量为20%。
所述阴道基质材料的制备方法中,步骤(e)中所述冻干的优选方案是:将经消毒处理的粘膜层在-50~-80℃真空冷冻干燥机冻干24~48小时。
所述阴道基质材料的制备方法中,步骤(e)中消毒和冻干处理后,使用γ射线或环氧乙烷再次消毒。
另外:
步骤(a)、(b)、(c)中,震荡处理的条件均为:温度为4℃、振荡速率为80-200rpm;
步骤(d)中,震荡处理时的振荡速率为80-200rpm。
本发明中所用的脱氧核糖核酸酶来源于牛胰腺的脱氧核糖核酸酶Ⅰ,所用核糖核酸酶来源于牛胰腺的核糖核酸酶A。
本发明的创新之处在于提供了一种生物活性和生物学力学性能更符合盆底修复或阴道重建的阴道基质材料,其克服了阴道壁上皮有许多皱襞、组织结构致密、粘膜层难以剥离的困难,同时针对阴道组织发明设计了特定的工艺及工艺参数。
本发明方法特定的工艺及工艺参数确保了本发明所提供的方法能够彻底脱除存在于阴道组织表面及内部的细胞、细胞碎片;所制备的基质材料具有免疫原性及细胞毒性低,生物相容性及生物力学性能良好,并富含有多种生物活性成分。
本发明为盆底修复及阴道重建提供了更多、更好的应用选择。
附图说明
图1为本发明所制阴道基质材料和未经处理的阴道粘膜层的HE染色和DAPI染色结果。
图1中:A、B分别为未经处理的阴道粘膜层(下1/3)的HE和DAPI染色结果;C、D分别为未经处理的阴道粘膜层(上2/3)的HE和DAPI染色结果;E、F分别为本发明实施例1所制阴道基质材料(下1/3)的HE和DAPI染色结果;G、H分别为本发明实施例1所制阴道基质材料(上2/3)的HE和DAPI染色结果。
图2为本发明所制备的阴道基质材料以及对比实施例所制备的脱细胞小肠粘膜下层基质的腔面及外表面的电镜扫描照片(×1000)。
图2中:A、C分别为本发明所制基质材料(下1/3)腔面和外表面;B、D分别为本发明所制基质材料(上2/3)腔面和外表面;E、F分别为对比实施例所制基质材料的腔面和外表面。
图3为本发明所制备的基质材料和对比实施例所制基质材料的生物力学特性检测统计图。
图3中:A为单位长度最大载荷统计结果,B为屈服强度统计结果,C为屈服伸长率统计结果,D为弹性模量统计结果;
图3中,AVMiL表示未经处理的阴道粘膜层下1/3、AVMiU表示未经处理的阴道粘膜层上2/3、AVMviL表示本发明所制备的阴道基质材料下1/3、AVMviU表示本发明所制备的阴道基质材料上2/3、SISi表示未经处理的小肠粘膜下层、SISv表示对比实施例所制备的脱细胞小肠粘膜下层基质。
图4为本发明实施例1所制备的基质和对比实施例1所制备的基质的生物活性因子含量。
图4中:A为VEGF因子含量统计结果,B为FGF因子含量统计结果,C为PDGF-BB因子含量统计结果,D为TGF-β1因子含量统计结果。
图5为经本发明方法处理的和未经处理的阴道粘膜层皮下移植HE染色(×400)结果,以及经对比实施例1的方法处理的和未经处理的小肠粘膜下层皮下移植HE染色(×400)结果。
图5中:
A、C分别为未经处理的阴道粘膜层下1/3和上2/3皮下移植1周时结果,B、D分别为经本发明实施例1所制阴道基质材料下1/3和上2/3皮下移植1周时结果,E、G分别为未经处理的阴道粘膜层下1/3和上2/3皮下移植8周时结果,F、H分别为经本发明实施例1所制阴道基质材料下1/3和上2/3皮下移植8周时结果;
J、L分别为对比实施例1所制小肠粘膜下层基质皮下移植1周、6周时的结果。
图6是本发明实施例1所制备基质材料和对比实施例1所制备的基质材料作为支架材料重建大鼠阴道的大体观察结果。
图6中:A为AVML(本发明所制备的基质材料的下1/3);B为AVMU(本发明所制备的基质材料的上2/3);C为对比实施例1的SIS。
图7是实施例1所制备的阴道基质材料和对比实施例1所制备的小肠粘膜下层基质作为支架材料重建大鼠阴道的HE染色结果。
图7中:A为AVML(本发明所制备的基质材料的下1/3);B为AVMU(本发明所制备的基质材料的下2/3);C为对比实施例1的SIS。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明,但这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
实施例1
猪阴道基质材料制备:
(1)取健康成年猪的阴道组织(热缺血时间小于30分钟),使用无菌生理盐水反复冲洗所得阴道组织,在无菌条件下,先用机械手抓住阴道组织的边缘,然后用切割刀和手术剪将阴道组织的外膜层、肌层与粘膜层进行切割分离,当遇到组织皱褶时,再用机械手进行剥离,由此反复,剥离去除阴道组织外膜层及肌层,留取无损伤、厚度均匀的阴道粘膜层。然后切割成适当大小,如宽7.56±1.42cm,长11.63±1.84cm,厚0.067±0.014cm,漂洗备用。
(2)将经步骤(1)处理后的阴道粘膜层经无菌去离子水在4℃条件下震荡处理48小时,振荡速率为130rpm;
所用的无菌去离子水中含蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟0.1mM/L。
(3)将经过步骤(2)处理后的阴道粘膜层用含十二烷基硫酸钠的无菌Tris-HCl缓冲液在4℃条件下震荡处理12小时,振荡速率为130rpm,然后使用pH7.2-7.4的无菌磷酸盐缓冲液漂洗两次,每次15分钟,再使用无菌去离子水漂洗两次,每次15分钟;
本步骤中,无菌Tris-HCl缓冲液浓度为0.01M,pH为8.0,其所含的十二烷基硫酸钠的质量体积浓度为0.1%;
本步所用的无菌Tris-HCl缓冲液中还含有蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟0.1mM/L。
(4)将经步骤(3)处理后的阴道粘膜层用含TritonX-100(中文名称:聚乙二醇辛基苯基醚)的无菌Tris-HCl缓冲液在4℃条件下震荡处理7天,振荡速率为130rpm,然后使用pH7.2-7.4的无菌磷酸盐缓冲液漂洗两次,每次15分钟,再使用无菌去离子水漂洗两次,每次15分钟;
本步骤中,无菌Tris-HCl缓冲液浓度为0.01M,pH为8.0;其所含的TritonX-100的体积百分浓度为0.1%;
本步所用的无菌Tris-HCl缓冲液中还含有蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟0.1mM/L。
(5)将经步骤(4)处理后的阴道粘膜层用含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的无菌Tris-HCl缓冲液在37℃条件下震荡处理12小时,振荡速率为130rpm,然后使用无菌pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液漂洗两次,每次15分钟,再使用无菌去离子水漂洗两次,每次15分钟,得到阴道基质;
本步骤中,所提到的无菌Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05M,pH为8.0,其所含脱氧核糖核酸酶为来源于牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I,浓度为50U/mL,所含核糖核酸酶为来源于牛胰腺的核糖核酸酶A,浓度为1U/mL。
(6)将步骤(5)所得阴道基质使用含过氧乙酸和乙醇的水溶液在25℃条件下震荡处理2小时,振荡速率为130rpm,然后使用pH7.2-7.4的无菌磷酸盐缓冲液漂洗两次,每次15分钟,再使用无菌去离子水漂洗两次,每次15分钟;
其中,含过氧乙酸和乙醇的水溶液中,过氧乙酸的体积百分含量为0.1%,乙醇的体积百分含量为20%;
(7)将经步骤(6)处理的阴道基质在-50℃真空冷冻干燥机冻干48小时,然后使用25KGy剂量的γ射线再次消毒处理即可,所制备的阴道机制材料于-20℃保存备用。
对比实施例1
本对比实施例采用现有技术中ZL200810150792.5所公开的方法制备脱细胞小肠粘膜下层基质:
1)前置处理:将猪空肠去除肠道内容物,用蒸馏水冲洗干净,切成所需片段,将其置于含有0.2%过氧乙酸和10%乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时,用PBS漂洗干净;机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜,用PBS漂洗干净,获得小肠粘膜下层;
2)脱细胞处理:将前置处理的小肠粘膜下层置入0.5M的NaOH溶液中,于6±20℃条件下浸泡20分钟,用PBS漂洗至中性;
3)酶处理:将脱细胞的粘膜下层置入含有40U/mLDNA酶和10U/mLα-半乳糖苷酶的混合溶液中,于35℃条件下浸泡1小时,用PBS漂洗干净;
4)脱细胞小肠粘膜下层膜状产品的制备:将酶处理后的粘膜下层浸泡于冷冻保护液中30分钟,冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有1%葡聚糖、2%蔗糖、4%聚维酮、2%棉子糖(均为重量比);再将粘膜下层铺展,经真空冷冻干燥后形成脱细胞小肠粘膜下层膜状产品,环氧乙烷灭菌消毒。
实验例1:实施例1与对比实施例1所制备的材料的生物学性能检测与评价:
本实验例通过试验一~试验六对本发明实施例1所制备的阴道基质材料的生物学性能进行检测及评价,并与对比实施例1所制备的脱细胞小肠粘膜下层基质的性能进行了对比。
由于阴道外段1/3(即阴道下1/3)和阴道内段2/3(即阴道上2/3)是由不同的胚层分化而来,所以以下实验均对实施例1所制备的阴道粘膜层的下1/3和上2/3分别检测:
试验一:残留细胞检测
将本发明实施例1制备的阴道基质材料经常规苏木素-伊红染色(×200)和DAPI(×200)染色,结果如图1中A~H所示。A~H所示结果证实所制备的阴道基质材料中无细胞结构存在。
试验二:残留DNA检测
将本发明实施例1制备的阴道基质材料与未处理过的阴道粘膜层经DNA检测试剂盒检测,结果显示,未处理过的阴道粘膜层下1/3和上2/3的DNA含量分别为6163.77±453.98ng/mg和4467.82±209.20ng/mg干重组织,而本发明所制备的阴道基质材料下1/3和上2/3的DNA含量分别为33.64667±2.994417ng/mg和30.73±3.035605ng/mg干重组织。
上述结果经统计学分析有显著差异,证实本发明的方法能显著降低阴道粘膜层中核酸含量,进一步证明本发明的方法能完全去除阴道粘膜层的细胞。
试验三:扫描电镜观察
对本发明实施例1所制备的阴道基质材料(下1/3和上2/3)的腔面及外表面进行扫描电镜观察,结果如图2中A~D所示。由A~D可证实所制备的基质材料无细胞成分残留,腔面较光滑,外表面可见粗大纤维走行。
E和F分别是对比实施例1所制备的脱细胞小肠粘膜下层基质的腔面和外表面电镜扫描结果,由E和F可以看出所制备的小肠粘膜下层基质材料与本发明所制备的基质材料结构差别很大,其内表面比较粗糙,且外表面的纤维较细且稀疏。
试验四:力学性能检测
检测材料:本发明实施例1所制阴道基质材料、未经处理的阴道粘膜层、对比实施例1所制小肠粘膜下层基质、未经处理的小肠粘膜下层。
检测项目:单位长度最大载荷、屈服强度、屈服伸长率、弹性模量、缝线保持能力。
检测结果见图3:
(1)单位长度最大载荷(PeakForce/width(N/cm)):利用万能材料试验机对材料的单位长度最大载荷进行检测,结果如下:
由图3中A可以看出:
①所有检测材料的同一部位的纵向单位长度最大载荷均大于横向单位长度最大载荷,除未经处理的阴道粘膜层的上2/3外其余均有统计学差异(P<0.05);
②本发明实施例1所制阴道基质材料的下1/3的纵向单位长度最大载荷大于上2/3的纵向单位长度最大载荷(P<0.05);
③本发明实施例1所制阴道基质材料的下1/3的纵向单位长度最大载荷大于未经处理的阴道粘膜层的下1/3的纵向单位长度最大载荷(P<0.05)。
④本发明实施例1所制阴道基质材料的纵向单位长度最大载荷大于对比实施例1所制备的脱细胞小肠粘膜下基质(P<0.05)。
以上统计结果表明,本发明所制备的阴道基质材料单位长度最大载荷比对比实施例1所制备的脱细胞小肠粘膜下基质更强,特别是阴道粘膜层下1/3的纵向载荷效果更佳。
(2)屈服强度(stress(MPa)):
由图3中B可以看出:
①所有材料的同一部位的纵向屈服强度大于其横向屈服强度,除未经处理的阴道粘膜层的上2/3外其余均有统计学差异(P<0.05);
②本发明实施例1所制阴道基质材料的下1/3的纵向屈服强度大于上2/3的纵向屈服强度(P<0.05);
③本发明实施例1所制阴道基质材料的下1/3的纵向屈服强度大于未经处理的阴道粘膜层下1/3的纵向屈服强度(P<0.05)。
④本发明实施例1所制阴道基质材料的下1/3的纵向屈服强度大于对比实施例1所制备的脱细胞小肠粘膜下基质(P<0.05)。
以上统计结果表明,本发明所制备的阴道基质材料屈服强度更优。
(3)屈服伸长率(strain(%)):
由图3中C可以看出:
本发明实施例所制阴道基质材料的屈服伸长率好于比实施例所制小肠粘膜下层基质的屈服伸长率。
(4)弹性模量(ElasticModulus(Mpa)):
由图3中D可以看出:
①所有材料的同一部位的纵向的弹性模量大于其横向的弹性模量(P<0.05);
②本发明实施例所制阴道基质材料的下1/3的纵向弹性模量大于上2/3的纵向弹性模量(P<0.05);
③本发明实施例所制阴道基质材料的下1/3的纵向弹性模量大于未经处理的阴道粘膜层下1/3的纵向弹性模量(P<0.05)。
以上统计结果表明:本发明的方法显著提高了阴道粘膜层特别是阴道粘膜层的下1/3的纵向弹性模量。
综上,本发明所制备的阴道基质材料(AVM)特别是阴道基质材料的下1/3(AVML)具有良好的生物力学性能,其各项指标检测结果整体优于对比实施例1所制备的基质材料(SIS)。
试验五:生长因子含量测定
Elisa定量检测实施例1所制备的阴道基质材料和对比实施例1所制脱细胞小肠粘膜下层基质材料冻干后所含VEGF、FGF、PDGF-BB及TGF-β1的含量。
从图4可见本发明所制的阴道基质材料的下1/3部分富含多种生物因子,其中所含PDGF-BB及TGF-β1大大高于SIS材料,其所含VEGF的量大大高于上2/3部分,且下1/3部分所含各种生物因子含量都比较均衡,此种差异更适合盆底修复和阴道重建的微环境,更利于进行盆底修复或阴道的重建。
试验六:皮下移植试验
取4周龄体重160-200g的健康SD大鼠,本发明实施例1所制阴道基质材料的和未经处理的阴道粘膜层各5片,裁剪为1cm2大小,移植到大鼠脊柱两侧皮下,均分别于1、2、4、6和8周后取材,进行常规石蜡包埋,HE染色。
HE染色结果显示:1周时未经处理的阴道粘膜层材料周围有大量炎细胞浸润(图5,A和C),而本发明实施例所制阴道基质材料周围炎细胞浸润相对较少(图5,B和D);随着时间延长,至6周时,本发明实施例所制阴道基质材料已经开始逐渐被吸收,周围炎细胞也在逐渐减少,至8周时未经处理的阴道粘膜层材料仍见少量残存,其周围仍见少量炎细胞浸润(图5,E和G),而本发明实施例所制阴道基质材料吸收完全,未见炎细胞浸润(图5,F和H)。
按照上述同样的方法将对比实施例1所制备的小肠粘膜下层基质进行移植试验。
HE染色结果显示,1周时,对比实施例1所制基质材料周围有炎细胞浸润(图5,J),而到6周时,基质材料已经被完全吸收(图5,L),失去了其作为支架的作用。
以上染色结果及分析表明,本发明所制备的脱细胞阴道基质材料具有良好的生物相容性,且较对比实施例1所制备的小肠粘膜下层基质在移植部位的吸收速率更慢,表明其具有更好的支撑作用,这可能更有利于局部组织的修复和重构,从而减少修复后复发概率。
由以上试验一~试验六的结果可知,本发明的制备方法能彻底脱除存在于阴道粘膜层表面和内部的细胞和细胞碎片,所制备出的阴道基质材料不仅免疫原性及细胞毒性低,且具有良好的生物相容性和生物力学性能,含有多种生物活性因子,具有很好的临床应用前景。
实验例2
应用AVML、AVMU和SIS作为支架材料构建大鼠阴道部分切除后重建模型。用长1.8cm外径为0.4cm的橡胶软管作为阴道模具,将移植试验分为三组:AVML支架组(AVML组)、AVMU支架组(AVMU组)和SIS支架组(SIS组)。取2到3个月健康SD大鼠,雌性,1%戊巴比妥钠以50mg/kg剂量腹腔注射,麻醉成功后,仰卧位固定四肢,暴露下腹部及阴道,备皮,75%酒精消毒皮肤,碘伏消毒阴道。将三组材料分别卷在模具上4-0丝线缝成盲管状。自耻骨联合上约1cm纵行切开皮肤约3cm,分离腹直肌,打开腹膜,切除子宫体及阴道上1/2,将盲管状支架与阴道断端吻合,盲端固定于子宫角残端,关腹,术后每日给予青霉素钠8万单位腹腔注射预防感染,连续3天。术后30天取材,常规石蜡包埋切片,HE染色观察阴道重建情况(结果如图7所示),并肉眼观察阴道重建大体形态(结果如图6所示)。
图6中,白色箭头所示为阴道断端指示缝线,其下为大鼠原阴道下1/2,其上为重建阴道。由图6所示大体结果可知,从外观上看,AVML组和AVMU组的阴道重建结果比SIS组的阴道重建结果更好,重建的阴道粘膜与大鼠正常阴道粘膜更相似,而AVML组与AVMU组相比较后发现,AVML组阴道重建的效果最好。
图7中,两种支架(AVM组和SIS组)所构建的大鼠组织工程阴道均可见复层鳞状上皮形成,但AVM组(包括AVML和AVMU),特别是AVML组所重建的阴道的上皮层细胞排列极性更加规律,固有层新生毛细血管和成纤维细胞更丰富,组织重构更活跃,表明其可形成结构和功能更完善的阴道组织。
Claims (5)
1.一种阴道基质材料,其特征在于,其载体为猪/牛阴道组织粘膜层,所述载体经以下方式处理:
(a)将猪/牛阴道组织粘膜层在含有苯甲基磺酰氟的去离子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震荡处理24-48小时;其中所述Tris溶液,其浓度为0.01M、pH为8.0;去离子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的浓度为0.1mM/L;
(b)将(a)步骤处理过的粘膜层放置在所含十二烷基硫酸钠的质量体积浓度为0.1-1%的水溶液或Tris-HCl缓冲溶液中震荡处理8-12小时;
(c)将(b)步骤处理过的粘膜层,经磷酸盐缓冲液漂洗,然后用所含TritonX-100的体积浓度为0.1-1%的Tris-HCl缓冲溶液震荡处理6-10天,再经磷酸盐缓冲液漂洗;
上述(c)、(b)步骤中的所有溶液及缓冲溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟;
(d)将(c)步骤处理过的粘膜层,放置在含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl缓冲液中,在32℃-37℃温度下震荡处理8-12小时,再经磷酸盐缓冲液漂洗;
其中所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05M、pH值为8.0;其中所含脱氧核糖核酸酶的浓度30-70U/mL,所含核糖核酸酶的浓度含1-5U/mL;
(e)将(d)步骤处理过的粘膜层,消毒和冻干,即得阴道基质材料。
2.权利要求1所述的阴道基质材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)将猪/牛阴道组织,交替采用钝器和锐器剥离除去阴道组织的外膜层及肌层,留取厚度均匀、无损伤的阴道粘膜层;漂洗后,放置在含有苯甲基磺酰氟的去离子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震荡处理24-72小时;其中所述Tris溶液的浓度为0.01M、pH为8.0;去离子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的浓度为0.1mM/L;
(b)将(a)步骤处理过的粘膜层放置在所含十二烷基硫酸钠的质量体积浓度为0.1-1%的水溶液或Tris-HCl缓冲溶液中震荡处理8-12小时;
(c)将(b)步骤处理过的粘膜层,经磷酸盐缓冲液漂洗,然后用所含TritonX-100的体积浓度为0.1-1%的Tris-HCl缓冲溶液震荡处理6-10天,再经磷酸盐缓冲液漂洗;
上述(c)、(b)步骤中的所有溶液及缓冲液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟;
(d)将(c)步骤处理过的粘膜层,放置在含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl缓冲液中,在32℃-37℃温度下震荡处理8-12小时,再经磷酸盐缓冲液漂洗;
其中所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05M、pH值为8.0,其所含脱氧核糖核酸酶的浓度30-70U/mL,所含核糖核酸酶的浓度含1-5U/mL;
(e)将(d)步骤处理过的粘膜层,消毒和冻干,形成阴道基质材料。
3.根据权利要求2所述的阴道基质材料的制备方法,其特征在于,步骤(e)中所述消毒是:使用含过氧乙酸和乙醇的溶液将(d)步骤处理过的粘膜层在25℃条件下震荡处理2小时,振荡速率为80-200rpm,然后依次使用无菌磷酸盐缓冲液和无菌去离子水漂洗;其中,所述含过氧乙酸和乙醇的溶液中,所含过氧乙酸的体积百分含量为0.1%,所含乙醇的体积百分含量为20%。
4.根据权利要求2所述的阴道基质材料的制备方法,其特征在于,步骤(e)中所述冻干是:将经消毒处理的粘膜层在-50~-80℃真空冷冻干燥机冻干24~48小时。
5.根据权利要求2所述的阴道基质材料的制备方法,其特征在于,步骤(e)中消毒和冻干处理后,使用γ射线或环氧乙烷再次消毒。
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