JP5993387B2 - コラーゲンバイオ繊維、ならびにその調製方法および使用 - Google Patents
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Description
胎盤嚢(placental sac)は、疎性結合組織により密接した二層からなる。これらは、羊膜および漿膜層として知られている(図1を参照)。羊膜層は、二層の最も内側にあり、胎児を囲む羊水と接触し、それらが一緒になって羊膜嚢を形成する。羊膜層は血管がなく、基底膜を覆う単層円柱上皮により覆われ、30〜60ミクロンの厚みを有する。漿膜は嚢の外側の層であり、密に細胞化(cellularize)されている。血管樹(tree)は胎盤から始まり、漿膜層を介して胎盤膜まで延伸する。漿膜層は、疎性結合組織によって羊膜層と分離されており、一緒になると二層で120〜180ミクロンの厚みを有する。胎盤膜は、ムコ多糖類で満たされたコラーゲンマトリックスを有し、これらは、発達胎児のための保護嚢として主に作用すると考えられている。膜はまた、母体循環系に存在する感染物質および免疫物質に対するバリアを維持する。胎盤膜は、能動的および受動的輸送機関の両方を有する。最も小さい分子およびタンパク質は、これらを通って自由に移動できるが、IgM等の大きなタンパク質は基底膜を通ることができない。
動物原性感染症を持つかまたは異種間拒絶を生じる異種組織(他の種に由来する組織)の可能性のある問題により、これらの組織はあまり望まれていなかった。同種移植片、または同種の異なる個体からの移植片が、依然としてヒト移植材料の好ましい由来源である。移植用のヒトドナー組織の不足は、高まりを見せる問題であり、組織移植用の新規材料の開発を促進している。生物学的原材料用のこれらの由来源は、ほとんどの場合に乏しく、入手困難で、非常に費用がかかる。しかし、ヒト羊膜からのコラーゲンシートは、組織移植用途において有用な、望ましい生物力学的特徴を有する。従って、羊膜は、同種移植材料として優良な由来源である。
本発明は、本明細書においてコラーゲンバイオ繊維と称するコラーゲン性羊膜を提供する。本発明のコラーゲンバイオ繊維は、天然未処理羊膜の構造的完全性を維持する(すなわち、コラーゲン、エラスチン、そして可能性的にフィブロネクチン等の組成において構造タンパク質の天然の三次および四次構造を保持する)。従って、本発明のコラーゲンバイオ繊維は、天然または未処理羊膜と同じ構造タンパク質からなる。従来技術の羊膜の調製方法は、プロテアーゼの使用または高熱処理を必要とし、その結果、膜はそれらの組成中で構造タンパク質の三次および四次構造を維持しない。
本発明は、本発明のコラーゲンバイオ繊維を調製する方法を提供する。特に、本発明は、羊膜および漿膜を含む胎盤を得ること;該漿膜から該羊膜を分離すること;ならびに該羊膜を脱細胞化することを含む、コラーゲンバイオ繊維を調製する方法を包含する。具体的な実施形態では、本方法は、脱細胞化した羊膜を洗浄および乾燥することをさらに含む。
乾燥させるための脱細胞化羊膜のアセンブリ.脱細胞化羊膜を滅菌溶液から取り出し、過剰な水分は緩く搾り出す。次いで、例えばトレイ上で、胎児側面を下にして、脱細胞化羊膜を平坦になるまで優しく引き伸ばす。次いで、脱細胞化羊膜を裏返して胎児側面を上に向け、乾燥フレーム、好ましくはプラスチックメッシュ乾燥フレーム(例えば、Quick Count(登録商標)プラスチックキャンバス、Uniek, Inc., Waunakee, WI)上に置く。他の実施形態では、乾燥フレームは、加熱滅菌可能なステンレススチールメッシュである。最も好適な実施形態では、羊膜の約0.5センチが乾燥フレームの端部と重なる。特定の実施形態では、乾燥フレームを超えた重複羊膜部分は、(例えば、クランプまたは鉗子(hemostat)を使用して)フレームの上部をくるむようにする。羊膜を乾燥フレーム上に配置した後、熱ドライヤー(またはジェルドライヤー)(例えば、モデル583、Bio-Rad Laboratories, 200 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)の乾燥プラットホーム上に滅菌ガーゼを置き、プラスチックメッシュ乾燥フレーム上に置かれた羊膜よりも僅かに大きな面積が覆われるようにする。ガーゼ層の全体厚みは、2枚に折りたたまれた(one folded)4×4ガーゼの厚みを超えないことが好ましい。シート様材料を乾燥させるのに適したあらゆる熱乾燥装置が使用され得る。乾燥フレームは、プラスチックフレームの端がガーゼ端を好ましくは0.1〜1.0 cm、より好ましくは0.5〜1.0 cm超えるように、乾燥プラットホーム上のガーゼの上に置かれる。最も好適な実施形態では、羊膜を有する乾燥フレームを、羊膜の胎児側面を上にして、滅菌ガーゼの上に置く。一部の実施形態では、別のプラスチックフレームメッシュを羊膜の上に置く。メッシュフレームおよびその中で乾燥される膜の様子を図4に示す。別の実施形態では、薄いプラスチックのシート(例えば、SW 182、透明PVC、AEP Industries Inc., South Hackensack, NJ 07606)、または生適合性シリコンを、膜で覆われたメッシュの上に置いて、シートが全ての端を十分に超えるようにする。この実施形態では、第2のメッシュフレームは必要ない。
本発明は、本発明のコラーゲンバイオ繊維を含む、三次元足場、三次元構造および積層板の調製方法を提供する。
本発明は、脱水状態シートとして、室温(例えば、25℃)にて、本発明のコラーゲンバイオ繊維を保存することを包含する。特定の実施形態では、本発明のコラーゲンバイオ繊維は、少なくとも10℃、少なくとも15℃、少なくとも20℃、少なくとも25℃、または少なくとも29℃の温度にて保存され得る。本発明のコラーゲンバイオ繊維は冷蔵されないことが好ましい。一部の実施形態では、本発明のコラーゲンバイオ繊維は、約2〜8℃の温度にて冷蔵され得る。他の実施形態では、本発明のコラーゲンバイオ繊維は、任意の上記温度にて長期間保存され得る。最も好適な実施形態では、本発明のバイオ繊維は、滅菌かつ非酸化条件下で保存される。本発明の方法により作製したバイオ繊維は、特定の温度にて12ヶ月間以上、コラーゲンバイオ繊維の生化学または構造完全性を変化させること無く(例えば、劣化させること無く)、そして生化学的または生物物理学的特性を変化させること無く保存され得る。本発明の方法により作製したバイオ繊維は、コラーゲンバイオ繊維の生化学または構造完全性を変化させること無く(例えば、劣化させること無く)、そして生化学的または生物物理学的特性が変化すること無く数年間保存され得る。本発明の方法により調製した本発明のバイオ繊維は、無限に保たれることが期待される。バイオ繊維は、長期保存に適した任意の容器に保存され得る。本発明のコラーゲンバイオ繊維は、滅菌二重剥離パウチパッケージに入れられて保存されることが好ましい。
本発明のバイオ繊維の滅菌は、当業者に公知の方法を使用して電子ビーム照射により行われることが好ましい(例えば、Gorham, D. Byrom(編), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122)。細菌またはその他の汚染している可能性のある生物の少なくとも99.9%を殺すのに十分な照射線量は全て本発明の範囲内にある。好適な実施形態では、少なくとも18〜25 kGyの線量を使用して、本発明のバイオ繊維の最終的な滅菌を達成する。しかし、本発明のバイオ繊維の滅菌は、抗生物質またはグリセロール中での保存は含まない。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、一部にその物理的性質(例えば、当該分野で使用されている従来膜と比較した場合の生体力学的強度、柔軟性、縫合性、低い免疫原性等)から、医療および外科分野において多数の利用用途を有する。例えば、本発明のコラーゲンバイオ繊維は、従来技術の膜(例えば、ゴアテックスTM等の合成非再吸収PTFE膜;グリコリド(glycolide)およびラクチドコポリマーから形成される合成非再吸収膜;WO-88/08305、DE-2631909、米国特許第5,837,278号に開示されている膜)と比べて、組織再生誘導法のための治療利用性が向上していると予想される。
5.4.1.1 皮膚症状の治療方法
ヒト皮膚は、表皮および真皮からなる複合物質である。表皮の上部は角質層であり、これは皮膚の最も堅い層であると共に、周囲環境によって最も影響を受けるものである。角質層の下は、表皮の内部部分がある。表皮の下は真皮乳頭層があり、これは皮膚の微起伏を規定する比較的疎性の結合組織からなる。真皮乳頭層の下にある真皮網状層は、空間的に編成された密な結合組織である。真皮網状層はまた、粗いしわを伴う。真皮の下には皮下層がある。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、一部にその物理的性質により、、当該分野で公知の他の生体材料(例えば、米国特許第3,157,524号;同第4,320,201号;同第3,800,792号;同第4,837,285号;同第5,116,620号に記載のもの)と比べて、創傷包帯として、硬組織および/または軟組織修復を補強するのに臨床的用途が向上している。本発明のコラーゲンバイオ繊維は、コラーゲンの天然の四次構造を保持するために、コラーゲンマトリックスの間隙への細胞移動を介した組織内部成長が改善されている。本発明のバイオ繊維は、細胞がコラーゲンマトリックスに付着し成長し、それら自体の高分子を合成することを可能にする。これにより、細胞は新しいマトリックスを生成し、これは新しい組織の成長を可能にする。このような細胞発達は、繊維、フリースおよび可溶性コラーゲン等の他の公知コラーゲン形態上では見とめられない。
本発明は、(例えば、上皮成長および分化を支持するための)培養皮膚細胞の輸送用のビヒクルとしての、本発明のコラーゲンバイオ繊維の使用を包含する。特定の実施形態では、バイオ繊維を細胞で密集させて、組織および/または(身体の器官または腺の構造と表面的外見または構造が似ている)類器官を形成するために、バイオ繊維を細胞接着因子で処置して、バイオ繊維を新しい細胞で再密集させる処理の間の細胞とバイオ繊維との付着を増強できる。特定の実施形態では、細胞の付着の程度は、羊膜を血清(例えば、ヒトまたはウシ胎仔血清)で処置することにより高まる。他の実施形態では、細胞の付着の程度は、羊膜をフィブロネクチンで処置することにより高める。
本発明は、手術移植片としての本発明のコラーゲンバイオ繊維の使用を包含する。本発明は、本発明のコラーゲンバイオ繊維またはその積層板を含む手術移植片を包含する。本発明は、手術用移植片の調製および使用方法をさらに包含する。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、眼関連疾患または障害の治療における臨床的および治療的利用性を有する。本発明のバイオ繊維は、眼球表面疾患(潰瘍形成/せん孔、水疱性角膜症、眼球類皮/腫瘍、原発性翼状片、永久性角膜上皮欠損、急性および慢性アルカリ火傷、熱傷、無虹彩、アトピー性角膜炎、特発性輪部幹細胞欠損、角膜パンヌス、新血管形成、リウマチ様角膜溶解、眼性瘢痕性類天疱瘡、漏出ろ過胞、露出型アハメッド弁管、後に瞼球癒着症を伴うセラチア蜂巣炎、ならびに急性および慢性スティーブンソン・ジョンソン症候群が挙げられるがこれらに限定されない)の治療および/または予防のために特に有用である。本発明のコラーゲンバイオ繊維は、潰瘍形成を伴う永久性角膜上皮欠損の治癒を促進するために;上皮形成を促進するために;上皮および幹細胞の成長を促進するために;炎症および痛みを低減するために;血管形成および瘢痕化を阻害するために;上皮表現型を復元するために;ならびに翼状片の「露出した(bare)強膜」の除去の間の結膜自家移植片の基質代用物として、特に有効である。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、歯科において特定の利用性を有する(例えば、歯周手術、歯周組織を再生させるための組織再生誘導法、骨再生誘導法、および歯根被覆(root coverage))。本発明は、歯周骨内欠損(整合(matched)両側性歯周欠損、歯間骨内欠損、深部(deep)3壁性骨内欠損、2壁性骨内欠損、および骨内欠損2および3が挙げられるがこれらに限定されない)の再生を促進するための本発明のコラーゲンバイオ繊維の使用を包含する。本発明のコラーゲンバイオ繊維は、当該分野で公知の他の技術(例えば、Quteishら, 1992, J. Clin. Periodontol. 19(7): 476-84;Chungら, 1990, J. Periodontol. 61(12): 732-6;Mattsonら, 1995, J. Periodontol. 66(7): 635-45;Benqueら, 1997, J. Clin. Periodontol. 24(8): 544-9;Mattsonら, 1999, J. Periodontol. 70(5): 510-7に開示されるような架橋コラーゲン膜の使用)と比べて、歯周骨内欠損の治療において向上した治療利用性および向上した臨床パラメーターを有すると予想される。本発明のコラーゲンバイオ繊維を使用して向上する臨床パラメーターの例としては、当業者に公知の、歯垢および歯肉指数スコア、プロービングポケット深さ、プロービング付着深さ、ならびに分岐部関与(furcation involment)および骨欠損の分類が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、損傷神経を修復、特に切断された抹消神経の修復、および神経手術過程においても有用である。本発明は、例えば、硬膜置換および末梢神経修復における、コラーゲンバイオ繊維の使用を包含する。本発明のコラーゲンバイオ繊維は、上述した理由のために、当該分野で使用される他の方法(例えば、Bergerら, 1970, Acta. Neurochir. 23: 141;Duckerら, 1968, Mil. Med. 133: 298;米国特許第4,778,467号; 同第4,883,618号;同第3,961,805号; 同第5,354,305号)とは対照的に、硬膜代用物としてまたは神経修復において向上した臨床利用性を有する。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、尿失禁の矯正において特に利用性を有する。尿失禁は、尿貯蔵中に尿道を閉じたままにすることに不具合を有することから生じる。原因は、外因性のものであり得る(例えば、尿道および膀胱頚部の身体構造的支持が乏しいと、失禁を生じ、骨盤底再懸垂(resuspension)に反応する)。あるいはまた、尿道不具合は内因性であり得る(すなわち、尿道機能が乏しい)。従来、コラーゲン、脂肪、シリコン等の充填剤を使用して矯正される(Lightner, 2002, Current Opinion in Urology, 12(4): 333-8の概論を参照)。本発明のコラーゲンバイオ繊維は、当該分野で記載される充填剤と比べて、利用性が向上している(すなわち、排尿の抑制を改善する)。さらに、本発明のコラーゲンバイオ繊維は、治療的利用性が向上している(例えば、局所合併症の低下、尿路感染の低下、宿主反応が無い、確かな耐久性、およびより高い安全性)。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、整形手術過程において使用され得る。特定の実施形態では、コラーゲンバイオ繊維は、整形外科的欠陥(例えば、後天性または先天性欠陥)のために使用され得る。骨腫瘍の外傷または外科的再発(surgical resurrection)により生じる局所欠陥の再構築は、整形外科または顎顔面手術における主要な課題である。典型的に、合成骨代用物、またはコラーゲン性膜は、一部に、骨誘発活性(osteoinductive activities)により使用されてきた(例えば、Raoら, 1995, J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 7(7):623-45を参照)。しかし、共通した問題は、移植材料により生じる全身性感染であった。しかし、本発明のコラーゲンバイオ繊維は、整形外科的欠陥において使用する骨代用物として、特に免疫原性が低いために、当該分野で使用される材料よりも有利である。一部の実施形態では、コラーゲンバイオ繊維は、腱、靭帯、および軟骨を再構築するための人工器官として使用され得る。他の実施形態では、本発明のコラーゲンバイオ繊維は、骨代用物としての人工器官として使用され得る。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、例えば、(血管の先天性奇形および疾患弁の矯正のために)大血管および小血管を構築するための人工器官として、心臓血管手術過程において使用され得る。
本発明のコラーゲンバイオ繊維は、薬剤(例えば、治療薬)の制御された送達のための薬剤送達ビヒクルとして使用され得る。一部の実施形態では、コラーゲンバイオ繊維は、1つ以上の治療薬を被験体(好ましくはヒト)に送達する。本発明の範囲内に包含される治療薬は、タンパク質、ペプチド、多糖類、多糖コンジュゲート、遺伝子利用型ワクチン、弱毒生ワクチン、全細胞である。本発明の方法において使用する薬剤の限定しない例としては、抗生物質、抗癌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤;ワクチン;麻酔薬;鎮痛剤;抗ぜんそく薬;抗炎症剤;抗抑制剤;抗関節炎薬;抗糖尿病薬;抗精神病薬;中枢神経系刺激薬;ホルモン;免疫抑制剤;筋肉弛緩剤;プロスタグランジンがある。
材料
コラーゲンバイオ繊維の調製において、以下の材料を使用した。
・送達記録のコピー
・材料/家族病歴/インフォームドコンセントのコピー
・由来源バーコードラベル(ドナーID番号)
・回収番号(入ってくる材料に連番をつける)
・組織処理記録(書類ID #ANT-19F);各ロット番号の処理の詳細記録を維持する
・ヒト胎盤(処理開始時において48時間未満のもの)
・滅菌外科クランプ/鉗子
・滅菌ハサミ
・滅菌外科用メス
・滅菌細胞スクレーパー(Nalgene NUNC Int. R0896)
・滅菌ガーゼ(非滅菌PSS 4416を滅菌)
・濯ぎ用滅菌ステンレススチールトレイ
・処理用消毒ステンレススチールトレイ
・消毒プラスチックビン
・滅菌0.9%NaCl溶液(Baxter 2F7124)
・滅菌水(Milli Q plus 09195またはBaxter 2F7113)
・滅菌標本容器(VWR 15704-014)
・個人保護用用具(滅菌および非滅菌グローブを含む)
・認定済みクリーンルーム
・予め調製した脱細胞化溶液(D-細胞);0.01〜1%デオキシコール酸ナトリウム塩水和物
・消毒ビン
・揺動プラットホーム(VWRモデル100)
・タイマー(VWR 21376890)
・消毒プラスチックフレームメッシュ
・PVCラップフィルム
・真空ポンプ(Schuco-Vac 5711-130)
・ジェルドライヤー(すなわち、熱ドライヤー;BioRadモデル583)
・消毒ステンレススチールカッティングボード
・パッケージ用パウチ
・滅菌ステンレススチール定規(General Tools MFG. Co 1201)
・追跡可能デジタル温度計(モデル61161-364、Control Company)
・Accu-Seal自動密封機(Accu-Seal、モデル630-1B6)
妊婦を、出産時に、HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMVおよびその他のウイルス等の伝染病、ならびに回収する胎盤組織を汚染しうるその他の病原体についてスクリーニングした。上記病原体に対して母体が陰性または無反応とテストされた母親を持つドナーから回収した組織のみ使用してコラーゲンバイオ繊維を産生した。
滅菌Steri-Wrapシートおよび以下の器具で滅菌フィールドを設け、処理用の付属品をその上に配置した。
・滅菌細胞スクレーパー
・滅菌外科用メス
・処理用消毒トレイ
滅菌パックID番号を処理記録に記録した。
羊膜を、標本容器から一片ずつ取り出し、消毒ステンレススチールトレイ上に載せた。他の片は、洗浄できるようになるまで、滅菌水の入った別の滅菌ステンレススチールトレイに入れた。処理トレイから羊膜の余分な片を取り出し、滅菌水の入った別の濯ぎ用滅菌ステンレススチールトレイに入れた。
濯ぎ用トレイ(または保存容器)から羊膜を取り出し、過剰な液体を指で優しく絞り、膜を滅菌標本容器に入れた。150 mlの印まで、D細胞溶液で容器を満たし、全ての羊膜が覆われていることを確認し、容器を密封した。
ステップIVに進む前に、組織状態検査をチェックして、全ての適用テスト結果が陰性であることを確認した。
本発明のバイオ繊維の手術取扱い、水和時間、および縫合性に関する質的および量的フィードバックを作成するために、本発明の方法により調製した羊膜サンプルを、4人の経験豊富かつよく評価されている眼球表面外科医に渡して評価してもらった。ブタ眼標本上に組織移植を施すことにより、本発明のバイオ繊維の取扱い性質および縫合性を決定して、サンプルを外科医が評価する。
(1) ブタの眼の単一の四分円(single quadrant)に合うようにバイオ繊維を切断乾燥する;
(2)切断したバイオ繊維を、ブタの眼の表面上に載せる;
(3)バイオ繊維を滅菌食塩溶液で水和し、2、5、10および20分間の水和時間の間、ブタの眼の上で移植片を活性化(すなわち、再水和)させる;
(4)バイオ繊維を、数針の9〜0ビクリル(vicryl)縫合により、ブタの眼の上皮に縫合する;ならびに
(5)水和羊膜の組織品質、一貫性、および縫合性に関する質的内容を外科医が書き留める。
本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。実際、記載したものに加えて本発明の様々な改変が、上記記載および添付の図面から、当業者に明らかになる。このような改変は、請求の範囲内にあることを意図する。
Claims (15)
- 羊膜および漿膜を有する胎盤から羊膜積層板を調製する方法であって:
(a)羊膜を漿膜から分離するステップ;
(b)界面活性剤含有溶液を使用して該羊膜を脱細胞化するステップ;および
(c)該脱細胞化した羊膜の少なくとも2枚を互いと接触させて積層し、羊膜積層板を形成するステップ
を含み、前記脱細胞化は、羊膜調製中のどの時点においても冷凍したり、または膜をプロテアーゼと接触させることはない、上記方法。 - 前記脱細胞化した羊膜を、ステップ(b)の後かつステップ(c)の前に少なくとも1回洗浄するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記脱細胞化した羊膜積層版を乾燥させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも2枚の前記羊膜積層板を複合三次元足場にアセンブルするステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 脱水状態で、脱細胞化され、かつ基板を含まず、天然三次および四次構造を有する羊膜を少なくとも2層含む、羊膜積層板。
- 前記羊膜がコラーゲン、エラスチン、およびフィブロネクチンを含む、請求項5に記載の羊膜積層板。
- 1つ以上のヒドロゲル組成物をさらに含む、請求項5に記載の羊膜積層板。
- 前記ヒドロゲル組成物が、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、デキストラン、およびそれらの誘導体または類似体からなる群より選択されるポリマーを含む、請求項7に記載の羊膜積層板。
- 前記積層板がシート、管又は球体に成形される、請求項5〜8のいずれか一項に記載の羊膜積層板。
- 被験体の皮膚症状を治療または予防する方法に使用するための請求項5に記載の羊膜積層板を含む医薬組成物。
- 前記皮膚症状が、皮膚外傷、しわ、小じわ、皮膚の薄層化、皮膚の弾力性の低下、肌荒れ、にきび痕、眉間のしわ、切除傷、軟組織不具合、先天性皮膚症状、変性皮膚症状、コラーゲンVII欠損、および日焼けで損傷した肌からなる群より選択される、請求項10に記載の医薬組成物。
- 被験体の創傷を治療する方法に使用するための請求項5に記載の羊膜積層板を含む医薬組成物。
- 前記創傷が、表皮創傷、皮膚創傷、床ずれ、慢性創傷、急性創傷、外部創傷、内部創傷、先天性創傷、火傷創傷、手術創傷、および創傷感染からなる群より選択される、請求項12に記載の医薬組成物。
- 被験体の火傷を治療する方法に使用するための請求項5に記載の羊膜積層板を含む医薬組成物。
- 前記火傷が、第1度火傷、第2度火傷、第3度火傷、感染火傷創傷、および火傷創傷膿痂疹からなる群より選択される、請求項14に記載の医薬組成物。
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