CN103127549A - 一种脱细胞睑板及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱细胞睑板及其制备方法。该脱细胞睑板是以异种动物或同种异体的睑板为原料，经过去细胞处理，得到脱细胞睑板。其包括两侧的睑板，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层，在胶原纤维板层之间具有若干个睑板腺管，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。本发明的脱细胞睑板可用于修补眼睑组织缺损、重建及塑形眼睑组织、治疗眼睑疾病和用作构建组织工程化生物睑板的载体，移植后可以长期存在，具有受体的睑板腺功能，神经、血管及淋巴管可以长入、受体细胞可以在其表面长期附着生长、免疫原性低和组织相容性佳的特点，具有广泛的应用前景。

Description

一种脱细胞睑板及其制备方法

技术领域

本发明属于医疗器械领域，具体地说是涉及一种脱细胞睑板及其制备方法。

背景技术：

肿瘤、感染、外伤及先天异常等各种病因导致的眼睑疾病、缺损，进而造成眼表面组织不同程度的继发性损伤，如眼睑内翻倒睫，暴露性角膜炎，角膜溃疡等，由于目前睑板替代物只能提供睑板的结构，缺乏睑板腺，使许多病人术后存在不同程度的睑板腺功能缺陷，不能得到有效地治疗。此外，合成材料制作的睑板替代物由于生物相容性差，移植后难以和眼周组织融合，易产生脱失、暴露、融解及感染等并发症。

沙眼是一种常见的眼表疾病，具有晚期出现并发症多的特点，尤其是发生眼睑瘢痕化导致睑板腺功能障碍，造成眼表继发性损伤。

眼表的稳定要求包括角膜、结膜上皮和泪膜三个部分的健康。针对不同原因引起的眼表疾病的治疗即包括对这三个方面健康的有效维持和重建。其中正常眼睑功能是保持眼表稳定性的主要方面之一。

组织工程的支架材料起着为细胞提供营养、为细胞增殖提供场所以及决定所修复组织的形状大小的作用。天然高分子材料如胶原、透明质酸、甲壳素及其衍生物及多糖类高分子物质其力学性能欠佳，疏水性太强，降解过快，不利于细胞营养物质向材料内扩散。人工合成的高分子材料(如聚乳酸、聚乙醇酸)等也用于作为组织工程眼睑的载体，其组织相容性和稳定性较差，无菌性炎性反应率较高，不适于临床试验。羊膜组织虽可提供连续的基底膜，含有胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及各种整合蛋白，这些成分利于上皮细胞的分化移行，但因材料本身太薄并不适于构建眼睑；异体巩膜、脱细胞真皮，硬脑膜、筋膜、韧带及软骨等也作为眼睑的替代物，但存在易脱失，融解，降解，暴露，尤其是不含有睑板腺管及睑板腺，不能实现睑板腺分泌功能恢复。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有睑板腺管，能帮助患者克服睑板腺功能缺陷实现睑板腺分泌功能恢复，生物安全性好的脱细胞睑板及其制备方法，该脱细胞睑板可用于修补眼睑组织缺损、重建及塑形眼睑组织、治疗眼睑疾病和用作构建组织工程化生物睑板的载体，以为临床眼睑手术提供充足的组织工程化人工生物睑板材料来源。

一种脱细胞睑板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以异种动物或同种异体的睑板为原料，经过去细胞处理，得到脱细胞睑板。

所述的睑板可以为异种动物或同种异体的部分眼睑组织或全部眼睑组织或连有皮肤、肌肉或/和结膜的眼睑组织。这些眼睑组织可以是新鲜组织也可以是经过保存的组织。其在一定作用条件下(如：经酶处理、破膜剂处理)，完全脱去材料内的细胞成分，最大限度地去除组织内的病原微生物，降低或消除组织的抗原性，但保留其正常的眼睑组织纤维排列的三维结构。

所述的去细胞处理可以采用细胞分离法(如过滤、离心、沉降等)，也可以采用细胞破碎法(如机械破碎之高压匀浆、珠磨、超声破碎等、化学和生物化学渗透之酸碱处理、化学试剂处理、酶溶等、物理渗透之渗透压冲击、冻结-融化法等)。

优选，所述的去细胞处理为使用阴离子表面活性剂SDS（十二烷基磺酸钠）或去垢剂Tritonx-100去除细胞膜成分，进行去细胞处理。

进一步优选，所述的使用阴离子表面活性剂SDS去除细胞膜成分进行去细胞处理，其步骤为：将睑板浸泡于质量百分数0.05~5%的阴离子表面活性剂SDS溶液中，在温度为4~45℃，处理4~24小时，由此得到脱细胞睑板。

进一步优选，所述的使用去垢剂Triton X-100去除细胞膜成分进行去细胞处理，其步骤为：将睑板浸泡于质量百分数0.01~5％的去垢剂Triton X-100溶液中，在温度为4~45℃，处理24~48小时，由此得到脱细胞睑板。更进一步优选，在经过Triton X-100处理后，然后以胰酶消化2~12小时，由此得到脱细胞睑板。

所述的去细胞处理，优选为：在10℃震荡条件下，将睑板置入碳酸盐缓冲液中，清洗睑板后转移至水中浸泡1h，然后在37℃震荡条件下，将睑板浸入脱细胞溶液Ⅰ中处理6h，10℃震荡条件下，再用碳酸盐缓冲液中清洗睑板，37℃震荡条件下，将清洗后的睑板浸入脱细胞溶液II中处理2h，10℃震荡条件下，再用碳酸盐缓冲液清洗处理后的睑板，再将清洗后的睑板固定于人工前房上，置于恒温干燥器中，在25℃，相对湿度为20%的条件下，干燥至睑板的初重，由此得到脱细胞睑板；

所述的碳酸盐缓冲液为含105mM NaCl，5.5mM KCl，1.8mM CaCl₂，0.8mM MgCl₂，5mM葡萄糖，35mMNaHCO₃，余量为水，pH8.3，渗透压为322mosmol/kg，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青霉素、链霉素和两性霉素，使其终浓度为100IU/ml，100μg/ml和0.625μg/ml；

脱细胞溶液Ⅰ为含磷脂酶A₂（Phospholipase A₂，PLA₂）200U/ml，0.5%（w/v）脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate，SD）的碳酸盐缓冲液，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青霉素、链霉素和两性霉素，使其终浓度为100IU/ml，100μg/ml和0.625μg/ml；

脱细胞溶液II为含PLA₂200U/ml的碳酸盐缓冲液，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青霉素、链霉素和两性霉素，使其终浓度为100IU/ml，100μg/ml和0.625μg/ml。

脱细胞睑板在使用时必须灭菌处理，如将脱细胞睑板密封于无菌塑料袋中，用钴⁶⁰（25kGey）照射灭菌后，4℃下保存备用。

上述三种去细胞处理方法能完全去除眼睑组织细胞的同时，并未构成对眼睑组织三维立体结构及其基质成分的破坏，使眼睑组织最重要的特性-睑板腺管和支撑韧性得以充分保留。

本发明的脱细胞睑板，包括两侧的睑板，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层，在胶原纤维板层之间具有若干个睑板腺管，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。

所述的睑板腺管优选为1~50个，进一步优选为20~50个。

所述的脱细胞睑板，其基本成分包括胶原纤维、睑板基质(包括粘多蛋白及糖蛋白等)、睑板腺管以及脱细胞处理后残留的胞膜和胞浆成分。

所述的脱细胞睑板的厚度优选为0.01~10.0mm。

所述的脱细胞睑板优选为直径是0.5mm~40mm的圆形、方形或不规则形。

所述脱细胞睑板还可以携带药物、细胞、睑板腺管、睑板腺和/或细胞因子。

通过在本发明制作的脱细胞睑板的睑板腺管负载相应细胞，可以构建出组织工程化生物睑板。由于脱细胞睑板具有一定的硬度和韧性，因此具有可加工性，能形成三维立体结构；可以加工成各种形状，如：圆形、月牙形等。可以制作成具有一定弧度，也可以呈平面状。也可以制作成与待修复的受体眼表缺损厚度相一致的厚度。

本发明所述的脱细胞睑板移植后，可以长期存在，并呈活性状态，由于具有睑板腺管，因此有睑板腺体分泌功能形成；具有受体的神经可以长入、受体细胞可以在其表面长期附着生长、免疫原性低和组织相容性佳的特点；还可以在制作加工或使用复水时，使其携带相关药物和/或细胞因子，起到抑制新生血管长入和/或治疗原发疾病的作用；在移植后神经可以长入基质内，受体的上皮细胞可以在眼睑组织表面附着生长；该脱细胞睑板还具有与受体眼表组织相似的热稳定性。

另外，本发明的脱细胞睑板的浸提液通过MTT检测，证实其对角膜上皮细胞，角膜内皮细胞及结膜上皮细胞增殖活性无显著性影响（图7），混合淋巴细胞培养实验证实其对免疫细胞不产生刺激性影响，皮下移植后未出现任何淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润现象（图8），证实该脱细胞睑板符合生物学评价标准，对受体安全可靠，不会构成对受体局部及全身的生物学危害。

本发明的脱细胞睑板的制备方法简单，易操作，所制备的脱细胞睑板具有以下优点：

1.本发明的脱细胞睑板源于生物材料，具有良好的支架作用，可作为安全、有效的生物学材料长期植入眼内。

2.由于本发明的脱细胞睑板具有睑板腺管，因此移植后能帮助患者克服睑板腺功能缺陷实现睑板腺分泌功能恢复，修复因病变切除的眼睑组织，缓解供体材料不足的矛盾。

3.利用本发明的脱细胞睑板可以构建全层睑板，即可作为纤维胶原支架，提供上皮生长的、健康的基质和基底膜，可用于重建眼表。

4.利用本发明的脱细胞睑板，可在改变眼的外观形态时，通过改变眼睑组织的厚度，使其具有不同的形状，以满足不同的需要。

因此本发明的脱细胞睑板可用于修补眼睑组织缺损、重建及塑形眼睑组织、治疗眼睑疾病和用作构建组织工程化生物睑板的载体，移植后可以长期存在，具有受体的睑板腺功能，神经、血管及淋巴管可以长入、受体细胞可以在其表面长期附着生长、免疫原性低和组织相容性佳的特点，具有广泛的应用前景。

附图说明：

图1是本发明的脱细胞睑板的结构示意图；

图2是利用本发明的脱细胞睑板构建的全层睑板的结构示意图；

图3是实施例1中术前去除病变部分的眼睑组织的示意图；

图4是实施例1中手术中将脱细胞睑板固定于植床和包眼图；

图5是实施例2中术前制作植床的示意图；

图6是实施例2中手术中将脱细胞睑板固定于植床和固定图；

图7是实施例1制备的脱细胞睑板浸提液对角膜上皮细胞、角膜内皮细胞和结膜上皮细胞增殖活性的影响；

图8是实施例1制备的脱细胞睑板皮下移植2周后，HE染色情况，（A）自体睑板、（B）脱细胞睑板；

其中1、睑板；2、胶原纤维板层；3、睑板腺管；4、睑结膜；5、眼睑肌肉；6、皮肤。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

化学渗透法制作脱细胞睑板：取兔的睑板，浸泡于浓度为质量百分数为0.1%的阴离子表面活性剂SDS水溶液中，在37℃的条件下处理睑板7小时，得到脱细胞睑板。制作石蜡切片行病理组织学观察，结果显示基质内细胞成分被脱去，组织观察显示，如图1所示，该脱细胞睑板包括两侧的睑板1，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层2，在胶原纤维板层之间具有20~50个睑板腺管3，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。该脱细胞睑板的基本成分包括胶原纤维、睑板基质(包括粘多蛋白及糖蛋白等)、睑板腺管以及脱细胞处理后残留的胞膜和胞浆成分。其厚度为0.1mm-10mm左右，形状规则。具体形状、直径和厚度可视临床病例情况而加工，如可以是直径0.5mm~40mm的圆形、方形或不规则形。制备的脱细胞睑板密封于无菌塑料袋中，用钴⁶⁰（25kGey）照射灭菌后，4℃下保存备用。

进一步可以利用该脱细胞睑板制作成带睑结膜4、眼睑肌肉5与皮肤6的全层睑板，其具体结构如图2所示，皮肤6、眼睑肌肉5、脱细胞睑板和睑结膜4依次相叠。

将上述制备的脱细胞睑板用于下述试验：

将所述脱细胞睑板用于部分眼睑缺损移植

眼睑肿瘤、外伤或眼睑缺损病人，用环钻或角膜切削刀去除病变部分的眼睑组织后，用缝线或生物胶将相应规格的脱细胞睑板植片固定于植床，包眼（图3，图4）。术后结果显示，植入脱细胞睑板后可不同程度的恢复眼睑组织的完整性及其部分或全部睑板腺分泌功能，通过使用高效液相色谱法或质谱测定法检测泪液的厚度及中极性和中性脂类成分与含量，及对挤出的睑板腺液进行成份与含量分析，确实含有蜡酯占32.3%，胆固醇酯占27.3%，极性脂肪占15%，二酯占7.7%，甘油三酯占3.7%，游离脂肪酸占2.0%，游离胆固醇占1.6%等。

亦可同时将此脱细胞睑板通过不同载体(如脂质体、乳剂、毫微球等)携带不同作用的药物、细胞、睑板腺或细胞因子，如抗新生血管的VEGF、促进上皮黏附的ICAM-1以及抗生素等，以改善部分眼睑组织移植术后新生血管形成、上皮生长缓慢以及继发感染等并发症。

实施例2

化学渗透法制作脱细胞睑板：取猪的睑板，该睑板附带有眼睑组织上的皮肤、肌肉和结膜，将其浸泡于浓度为质量百分数为1%的去垢剂Triton X-100水溶液中，在37℃的条件下处理睑板24小时，得到脱细胞睑板。制作石蜡切片行病理组织学观察，结果显示基质内细胞成分被脱去，组织观察显示，如图1所示，该脱细胞睑板包括两侧的睑板1，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层2，在胶原纤维板层之间具有20~50个睑板腺管3，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。该脱细胞睑板的基本成分包括胶原纤维、睑板基质(包括粘多蛋白及糖蛋白等)、睑板腺管以及脱细胞处理后残留的胞膜和胞浆成分。该脱细胞睑板为直径范围在1~40mm左右的圆形，其厚度为0.1mm-10.0mm左右。具体形状、直径和厚度可根据患眼的病变情况塑形。制备的脱细胞睑板密封于无菌塑料袋中，用钴⁶⁰（25kGey）照射灭菌后，4℃下保存备用。

将上述制备的脱细胞眼睑组织用于下述试验：

将所述脱细胞睑板用于构建组织工程化生物眼睑：

眼睑组织工程构建时，在脱细胞睑板的后表面种植结膜上皮细胞，睑板腺管中种植睑板腺细胞，前表面种植皮肤细胞，形成有睑板腺功能的眼睑的三维立体结构，将该生物眼睑固定于植床上（图5，图6）。术后结果显示，移植该生物眼睑后，术眼能修复全层缺损的眼睑组织（包括眼睑皮肤、肌肉、睑板、睑板腺及睑结膜），具有睑板腺分泌功能。通过检测泪液的厚度及中极性和中性脂类成分与含量，及对挤出的睑板腺液进行成份与含量分析，确实含有蜡酯占32.3%，胆固醇酯占27.3%，极性脂肪占15%，二酯占7.7%，甘油三酯占3.7%，游离脂肪酸占2.0%，游离胆固醇占1.6%等。

实施例3：

化学渗透法制作脱细胞睑板：取猴的睑板，浸泡于浓度为质量百分数为0.05%的阴离子表面活性剂SDS水溶液中，在45℃的条件下处理睑板4小时，得到脱细胞睑板。制作石蜡切片行病理组织学观察，结果显示基质内细胞成分被脱去，组织观察显示，如图1所示，该脱细胞睑板包括两侧的睑板1，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层2，在胶原纤维板层之间具有1~50个睑板腺管3，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。该脱细胞睑板的基本成分包括胶原纤维、睑板基质(包括粘多蛋白及糖蛋白等)、睑板腺管以及脱细胞处理后残留的胞膜和胞浆成分。其厚度为0.01mm-10mm左右，形状规则，具体形状、直径和厚度视临床病例之情况而定，如可以是直径是0.5mm~40mm的圆形、方形或不规则形。制备的脱细胞睑板密封于无菌塑料袋中，用钴⁶⁰（25kGey）照射灭菌后，4℃下保存备用。

将上述制备的脱细胞睑板用于下述试验：

将所述脱细胞睑板用于部分眼睑缺损移植

眼睑肿瘤、外伤或眼睑缺损病人，用环钻或角膜切削刀去除病变部分的眼睑组织后，用缝线或生物胶将相应规格的脱细胞睑板植片固定于植床，包眼。术后结果显示，移植本实施例的脱细胞睑板后可不同程度恢复眼睑组织的完整性及其部分或全部睑板腺分泌功能。通过检测泪液的厚度及中极性和中性脂类成分与含量，及对挤出的睑板腺液进行成份与含量分析，确实含有蜡酯占32.3%，胆固醇酯占27.3%，极性脂肪占15%，二酯占7.7%，甘油三酯占3.7%，游离脂肪酸占2.0%，游离胆固醇占1.6%等。

实施例4：

化学渗透法制作脱细胞睑板：取猪的睑板，浸泡于浓度为质量百分数为5%的阴离子表面活性剂SDS水溶液中，在4℃的条件下处理睑板24小时，得到脱细胞睑板。制作石蜡切片行病理组织学观察，结果显示基质内细胞成分被脱去，组织观察显示，如图1所示，该脱细胞睑板包括两侧的睑板1，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层2，在胶原纤维板层之间具有1~50个睑板腺管3，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。该脱细胞睑板的基本成分包括胶原纤维、睑板基质(包括粘多蛋白及糖蛋白等)、睑板腺管以及脱细胞处理后残留的胞膜和胞浆成分。其厚度为0.1mm-10mm左右，形状规则，具体形状、直径和厚度视临床病例之情况而定，如可以是直径是0.5mm~40mm的圆形、方形或不规则形。制备的脱细胞睑板密封于无菌塑料袋中，用钴⁶⁰（25kGey）照射灭菌后，4℃下保存备用。

将上述制备的脱细胞睑板用于下述试验：

将所述脱细胞眼睑板用于部分眼睑缺损移植

眼睑肿瘤、外伤或眼睑缺损病人，用环钻或角膜切削刀去除病变部分的眼睑组织后，用缝线或生物胶将相应规格的脱细胞睑板植片固定于植床，包眼。术后结果显示，移植本实施例的脱细胞睑板后可不同程度恢复眼睑组织的完整性及其部分或全部睑板腺分泌功能。通过检测泪液的厚度及中极性和中性脂类成分与含量，及对挤出的睑板腺液进行成份与含量分析，确实含有脂肪酸，蜡脂，甘油三脂，甘油二脂等。

实施例5：

化学渗透法制作脱细胞睑板：取猴的睑板，将其浸泡于浓度为质量百分数为0.01%的去垢剂Triton X-100水溶液中，在45℃的条件下处理睑板24小时，得到脱细胞睑板。制作石蜡切片行病理组织学观察，结果显示基质内细胞成分被脱去，组织观察显示，如图1所示，该脱细胞睑板包括两侧的睑板1，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层2，在胶原纤维板层之间具有1~50个睑板腺管3，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。该脱细胞睑板的基本成分包括胶原纤维、睑板基质(包括粘多蛋白及糖蛋白等)、睑板腺管以及脱细胞处理后残留的胞膜和胞浆成分。该脱细胞睑板为直径范围在1~40mm左右的圆形，其厚度为0.1mm-10.0mm左右。具体形状、直径和厚度可根据患眼之病变情况塑形。制备的脱细胞睑板密封于无菌塑料袋中，用钴⁶⁰（25kGey）照射灭菌后，4℃下保存备用。

将上述制备的脱细胞睑板用于下述试验：

将所述脱细胞睑板用于构建组织工程化生物眼睑：

眼睑组织工程构建时，在脱细胞睑板的后表面种植结膜上皮细胞，睑板腺管中种植睑板腺细胞，前表面种植皮肤细胞，形成有睑板腺功能的眼睑的三维立体结构，将该生物眼睑固定于植床上。术后结果显示，移植该生物眼睑后，术眼能修复全层缺损的眼睑组织（包括眼睑皮肤、肌肉、睑板、睑板腺及睑结膜），具有睑板腺分泌功能。通过检测泪液的厚度及中极性和中性脂类成分与含量，及对挤出的睑板腺液进行成份与含量分析，确实含有脂肪酸，蜡脂，甘油三脂，甘油二脂等。

实施例6：

化学渗透法制作脱细胞睑板：取兔的睑板，将其浸泡于浓度为质量百分数为5%的去垢剂Triton X-100水溶液中，在4℃的条件下处理睑板48小时，得到脱细胞睑板。制作石蜡切片行病理组织学观察，结果显示基质内细胞成分被脱去，组织观察显示，如图1所示，该脱细胞睑板包括两侧的睑板1，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层2，在胶原纤维板层之间具有1~50个睑板腺管3，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。该脱细胞睑板的基本成分包括胶原纤维、睑板基质(包括粘多蛋白及糖蛋白等)、睑板腺管以及脱细胞处理后残留的胞膜和胞浆成分。该脱细胞睑板为直径范围在1~40mm左右的圆形，其厚度为0.1mm-10.0mm左右。具体形状、直径和厚度可根据患眼之病变情况塑形。制备的脱细胞睑板密封于无菌塑料袋中，用钴⁶⁰（25kGey）照射灭菌后，4℃下保存备用。

将上述制备的脱细胞睑板用于下述试验：

将所述脱细胞睑板用于构建组织工程化生物眼睑：

眼睑组织工程构建时，在脱细胞睑板的后表面种植结膜上皮细胞，睑板腺管中种植睑板腺细胞，前表面种植皮肤细胞，形成有睑板腺功能的眼睑的三维立体结构，将该生物眼睑固定于植床上。术后结果显示，移植该生物眼睑后，术眼能修复全层缺损的眼睑组织（包括眼睑皮肤、肌肉、睑板、睑板腺及睑结膜），具有睑板腺分泌功能。通过检测泪液的厚度及中极性和中性脂类成分与含量，及对挤出的睑板腺液进行成份与含量分析，确实含有蜡酯占32.3%，胆固醇酯占27.3%，极性脂肪占15%，二酯占7.7%，甘油三酯占3.7%，游离脂肪酸占2.0%，游离胆固醇占1.6%等。

实施例7：

采用碳酸盐缓冲液：含105mM NaCl，5.5mM KCl，1.8mM CaCl₂，0.8mM MgCl₂，5mM葡萄糖，35mM NaHCO₃，pH8.3，渗透压为322mosmol/kg；脱细胞溶液Ⅰ为含磷脂酶A₂（Phospholipase A₂，PLA₂）₂00U/ml，0.5%（w/v）脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate，SD）的碳酸盐缓冲液。脱细胞溶液II为含PLA2200U/ml的碳酸盐缓冲液，上述液体均经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入抗生素（终浓度为：100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素和0.625μg/ml两性霉素）室温下放置备用。将取出的睑板组织按以下述操作步骤制备脱细胞睑板。

（1）室温下，每个睑板样本称取初重。

（2）10℃，水浴震荡条件下，将睑板样本置入碳酸盐缓冲液中，清洗睑板（10min/次×3次）后，转移至纯水中浸泡1h。

（3）37℃，水浴震荡条件下，每个睑板样本浸入10ml脱细胞溶液Ⅰ中处理6h。

（4）10℃，水浴震荡条件下，碳酸盐缓冲液中清洗（10min/次×3次）。

（5）37℃，水浴震荡条件下，每个睑板样本浸入10ml脱细胞溶液II中处理2h。

（6）10℃，水浴震荡条件下，碳酸盐缓冲液清洗样本（30min/次×6次）。

（7）将样本固定于人工前房上，置于恒温干燥器中（25℃，20%空气湿度），干燥至起始初重，由此得到脱细胞睑板。

（8）制备的脱细胞睑板密封于无菌塑料袋中，用钴⁶⁰（25kGey）照射灭菌后，4℃下保存备用。

将上述制备的脱细胞睑板用于下述试验：

将所述脱细胞睑板用于构建组织工程化生物眼睑：

眼睑组织工程构建时，在脱细胞睑板的后表面种植结膜上皮细胞，睑板腺管中种植睑板腺细胞，前表面种植皮肤细胞，形成有睑板腺功能的眼睑的三维立体结构，将该生物眼睑固定于植床上。术后结果显示，移植该生物眼睑后，术眼能修复全层缺损的眼睑组织（包括眼睑皮肤、肌肉、睑板、睑板腺及睑结膜），具有睑板腺分泌功能。通过检测泪液的厚度及中极性和中性脂类成分与含量，及对挤出的睑板腺液进行成份与含量分析，确实含有蜡酯占32.3%，胆固醇酯占27.3%，极性脂肪占15%，二酯占7.7%，甘油三酯占3.7%，游离脂肪酸占2.0%，游离胆固醇占1.6%等。

Claims (10)

1.一种脱细胞睑板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以异种动物或同种异体的睑板为原料，经过去细胞处理，得到脱细胞睑板。

2.根据权利要求1所述的脱细胞睑板的制备方法，其特征在于，所述的睑板为异种动物或同种异体的部分眼睑组织或全部眼睑组织或连有皮肤、肌肉或/和结膜的眼睑组织。

3.根据权利要求1或2所述的脱细胞睑板的制备方法，其特征在于，所述的去细胞处理为使用阴离子表面活性剂SDS或去垢剂Triton x-100去除细胞膜成分，进行去细胞处理。

4.根据权利要求3所述的脱细胞睑板的制备方法，其特征在于，所述的使用阴离子表面活性剂SDS去除细胞膜成分进行去细胞处理，其步骤为：将睑板浸泡于质量百分数0.05~5%的阴离子表面活性剂SDS溶液中，在温度为4~45℃，处理4~24小时，由此得到脱细胞睑板。

5.根据权利要求3所述的脱细胞睑板的制备方法，其特征在于，所述的使用去垢剂Triton X-100去除细胞膜成分进行去细胞处理，其步骤为：将睑板浸泡于质量百分数0.01~5％的去垢剂Triton X-100溶液中，在温度为4~45℃，处理24~48小时，由此得到脱细胞睑板。

6.根据权利要求3所述的脱细胞睑板的制备方法，其特征在于，所述的去细胞处理为：在10℃震荡条件下，将睑板置入碳酸盐缓冲液中，清洗睑板后转移至水中浸泡1h，然后在37℃震荡条件下，将睑板浸入脱细胞溶液Ⅰ中处理6h，10℃震荡条件下，再用碳酸盐缓冲液中清洗睑板，37℃震荡条件下，将清洗后的睑板浸入脱细胞溶液II中处理2h，10℃震荡条件下，再用碳酸盐缓冲液清洗处理后的睑板，再将清洗后的睑板固定于人工前房上，置于恒温干燥器中，在25℃，相对湿度为20%的条件下，干燥至睑板的初重，由此得到脱细胞睑板；

所述的碳酸盐缓冲液为含105mM NaCl，5.5mM KCl，1.8mM CaCl₂，0.8mM MgCl₂，5mM葡萄糖，35mM NaHCO₃，余量为水，pH8.3，渗透压为322mosmol/kg，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青霉素、链霉素和两性霉素，使其终浓度为100IU/ml，100μg/ml和0.625μg/ml；

所述的脱细胞溶液Ⅰ为含磷脂酶A₂200U/ml，0.5%（w/v）脱氧胆酸钠的碳酸盐缓冲液，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青霉素、链霉素和两性霉素，使其终浓度为100IU/ml，100μg/ml和0.625μg/ml；

所述的脱细胞溶液II为含PLA2200U/ml的碳酸盐缓冲液，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青霉素、链霉素和两性霉素，使其终浓度为100IU/ml，100μg/ml和0.625μg/ml。

7.一种脱细胞睑板，包括两侧的睑板，在睑板之间具有数个相互走向的胶原纤维板层，在胶原纤维板层之间具有若干个睑板腺管，胶原纤维板层之间还具有细胞被脱去后形成的空隙。

8.根据权利要求7所述的脱细胞睑板，其特征在于，所述的睑板腺管为1~50个。

9.根据权利要求8所述的脱细胞睑板，其特征在于，所述的睑板腺管为20~50个。

10.根据权利要求7所述的脱细胞睑板，其特征在于，所述的脱细胞睑板的厚度为0.01~10.0mm，直径为0.5mm~40mm的圆形、方形或不规则形。

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