CN115581811A - 一种自体组织工程活细胞睑板替代物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自体组织工程活细胞睑板替代物及其制备方法和应用，涉及生物医学组织工程领域。本发明通过获取原代耳软骨进行扩增培养，可获得足量的自体耳软骨细胞，并进一步种植于I型胶原海绵支架上进行培养，最终得到本发明所述的睑板替代物。本发明通过一系列体内外实验证明了所述的睑板替代物具有高生物相容性和高稳定性，验证了其作为人睑板替代物的应用潜能；另外，本发明制备方法简单，来源易得，数量充足，有效避免了传统方法中自体移植的供区消耗和损伤，值得临床应用和推广。

Description

一种自体组织工程活细胞睑板替代物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学组织工程领域，具体涉及一种自体组织工程活细胞睑板替代物及其制备方法和应用。

背景技术

眼睑是人体兼具功能和美学的重要器官。由于外伤、肿瘤、免疫性疾病等导致的眼睑缺损给患者造成很大的痛苦和心理负担。眼睑在解剖学上可以分为前板(由皮肤和眼轮匝肌构成)和后板(由睑板和睑结膜构成)。其中，睑板是眼睑后板的重要结构，它主要由致密的结缔组织、丰富的弹力纤维和大量睑板腺所组成，为眼睑提供力学支撑，对于眼睑功能和外观的维持具有重要作用。当眼睑缺损累及睑板时，常常需要使用睑板替代物在缺损处进行修补。临床上，理想的睑板替代品应具有合适的厚度、机械强度、弹性，还有良好的组织相容性和可获得性。

目前在临床上常用的睑板替代物主要包括自体移植物(自体睑板、耳软骨、鼻软骨、硬腭移植物等)、合成大分子材料(多孔聚乙烯、聚己内酯等)以及异体脱细胞真皮等，但它们都存在一定的局限性，具体如下：

(1)供区有限及供区损伤：自体移植物取材于自身的组织和器官，存量十分有限。对于大面积眼睑缺损患者，在自体眼睑、耳廓、鼻中隔、硬腭等供区取材，可能导致供区发生出血、瘢痕、畸形等并发症，从而影响患者的生活质量和外观。

(2)生物相容性差：由于来源于化学物质及现有工艺水平的限制，合成大分子材料普遍具有较低的生物相容性和较高的免疫排斥性，植入人体内后可能发生移植物暴露、炎症反应、局部的疼痛与功能障碍等不良反应。

(3)稳定性低：异体脱细胞真皮作为在理论上存在传播传染性疾病的风险，并且具有高达50％以上的收缩率，移植体内后往往出现挛缩与吸收，无法很好的起到支撑眼睑的作用。

因此，本领域亟需寻找一种高稳定性、高生物相容性且能避免供区损伤的新型睑板替代物。

发明内容

本发明的目的是提供一种自体组织工程活细胞睑板替代物及其制备方法和应用，本发明制得的睑板替代物，不仅稳定性高、生物相容性高，且制备方法简单，来源易得，数量充足，解决了现有技术中存在的供区有限及供区损伤、生物相容性差、稳定性低等问题。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，包括以下步骤：

S1，获取患者来源的耳软骨，经抗生素消毒、清洗后，分离去除耳软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为耳软骨碎片；

S2，在步骤S1得到的耳软骨碎片中加入胶原酶进行消化处理，得到软骨细胞悬液；

S3，取步骤S2得到的软骨细胞悬液进行传代培养；

S4，取传代至第2～4代的软骨细胞，以3×10⁴～4×10⁴个细胞/cm³的密度种植于I型胶原海绵支架上，加入软骨培养基培养2～4周，形成基于胶原海绵支架的组织工程软骨。

优选地，步骤S2中，根据所述耳软骨碎片的质量加入一定体积的胶原酶，具体为：每1g耳软骨碎片加入1mL胶原酶，胶原酶的浓度为1～2mg/mL。

优选地，所述的胶原酶为NB4胶原酶或II型胶原蛋白酶。

优选地，步骤S3中，传代培养的接种密度为5000个细胞/cm²，传代培养基为DMEM+10％FBS+1～10ng/mlTGF-β1+1～10ng/mlFGF-2。

优选地，步骤S4中，所述的I型胶原海绵支架的孔径为50-500μm。

优选地，所述的I型胶原海绵支架的大小为：长度1～20mm，宽度1～10mm，厚度0.5～2mm；更优选地，I型胶原海绵支架的大小为20mm×10mm×1mm。

优选地，所述的软骨培养基的配方如下：DMEM培养基、胎牛血清10％、青霉素-链霉素-谷氨酰胺100U/ml、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸10mM、丙酮酸钠10mM、重组人转化生长因子β310ng/ml、胰岛素10μg/mL、抗坏血酸2-磷酸三钠盐0.1mM。

优选地，步骤S1中，所述的耳软骨直径为2～4mm，耳软骨碎片的大小为1mm×1mm。

优选地，步骤S1中，所述的抗生素为0.25％氯霉素溶液。

本发明另一方面还提供了一种根据前面任一项所述的制备方法制得的自体组织工程活细胞睑板替代物。

本发明另一方面还提供了前面所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的用途：用于制备眼睑缺损修复的医用产品。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)减少对供区的获取和损伤：本发明通过获取原代耳软骨进行扩增培养，可获得足量的自体耳软骨细胞用于构建组织工程软骨，而对耳廓的结构和功能的影响甚微，有效避免了供区的消耗和损伤。

(2)较高的生物相容性：本发明提出的睑板替代物的制备方法，采用自体耳软骨细胞来构建组织工程软骨后进行自体移植，相较于传统方法中的异体脱细胞移植物与合成材料移植物，具有更高的生物相容性和更低的免疫排斥性。

(3)较高的体内稳定性：本发明提供的自体组织工程活细胞睑板替代物，不仅具有良好的机械特性，可以较好的维持眼睑的功能与形状，且裸鼠背部植入6个月后，仍具有相对完整的形状和较低的收缩率，表现出优于传统替代物的稳定性。

附图说明

图1为本发明提供的自体组织工程活细胞睑板替代物的制备流程图。

图2为未接种细胞的I型胶原海绵支架(Empty)和实施例1制备的组织工程软骨(2weeks)的扫描电镜图片。

图3为实施例1制备的组织工程软骨的番红O(SafranineO)、II型胶原蛋白(ColII)、X型胶原蛋白(ColX)染色结果。

图4为未接种细胞的I型胶原海绵支架(collagenscaffold，CS)和实施例1制备的组织工程软骨(Tissue-engineeredcartilage，TeC)的力学性能对比，其中：

A表示最大伸长率对比结果；

B表示拉伸断裂强度对比结果；

C表示杨氏模量对比结果。

图5为未接种细胞的I型胶原海绵支架(Empty)、实施例1制备的组织工程软骨(2weeks)、以及植入裸小鼠背部皮下2个月(2months)、4个月(4months)和6个月(6months)的组织工程软骨的大体观照片。

图6为未接种细胞的I型胶原海绵支架(Empty)、实施例1制备的组织工程软骨(2weeks)、以及植入裸小鼠背部皮下2个月(2months)、4个月(4months)和6个月(6months)的组织工程软骨的长度及厚度对比。

图7为实施例1制备的组织工程软骨植入裸小鼠背部皮下2个月(2months)、4个月(4months)和6个月(6months)后的Bern评分结果。

图8为实施例2中术后8周兔双眼照片。

图9为实施例2中正常眼睑、术后8周实验组和术后8周对照组眼睑的H&E染色、II型胶原蛋白、X型胶原蛋白免疫组织化学染色结果。

图10为实施例2中正常眼睑、术后8周实验组和术后8周对照组睑结膜的CK4、MUC5AC免疫荧光染色结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

术语

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所述的“耳软骨”、“耳软骨组织片”可互换使用；本文所述的“组织工程软骨”即为本发明制备提供的“自体组织工程活细胞睑板替代物”。

SafranineO染色：又称番红O染色，是一种常用的软骨染色方法。Saf-O染色的原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色；番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖阴离子基团(硫酸软骨素或硫酸角质素)结合。

COL-II染色：COL-II即II型胶原蛋白，它是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网状结构，产生一定的机械强度。II型胶原蛋白主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织。

COL-X染色：COL-II即X型胶原蛋白，是肥大软骨细胞的标志物，不仅参与新骨的矿化框架构建，而且调控钙化的过程。

CK4(角蛋白4)染色：角蛋白是纤维结构蛋白家族之一，它是构成头发、角、爪和人体皮肤外层的主要蛋白质。结膜上皮细胞CK4阳性。

MUC5AC(黏糖蛋白5AC)染色：一组高分子量的糖蛋白，其合成和分泌是腺上皮组织的特征之一。MUC5AC正常表达于胃、卵巢、支气管等组织中，在黏膜表面形成一层凝胶，保护黏膜。结膜杯状细胞分泌的粘液也表达MUC5AC。

本申请发明人为解决现有技术中睑板替代物存在的供区有限及供区损伤、生物相容性差、稳定性低等问题，经过深入研究，首次提供了一种自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，制备流程如图1所示，具体包括以下步骤：

S1，获取患者来源的耳软骨，经抗生素消毒、清洗后，分离去除耳软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为耳软骨碎片；

S2，在步骤S1得到的耳软骨碎片中加入胶原酶进行消化处理，得到软骨细胞悬液；

S3，取步骤S2得到的软骨细胞悬液进行传代培养；

S4，取传代至第2～4代的软骨细胞，以3×10⁴～4×10⁴个细胞/cm³的密度种植于I型胶原海绵支架上，加入软骨培养基培养2～4周，形成基于胶原海绵支架的组织工程软骨，即所述的自体组织工程活细胞睑板替代物。

优选地，步骤S2中，根据所述耳软骨碎片的质量加入一定体积的胶原酶，具体为：每1g耳软骨碎片加入1mL胶原酶，胶原酶的浓度为1～2mg/mL。

一些实施例中，所述的胶原酶为NB4胶原酶；另一些实施例中，所述的胶原酶为II型胶原蛋白酶。

优选地，步骤S3中，传代培养的接种密度为5000个细胞/cm²，传代培养基为DMEM+10％FBS+1～10ng/mlTGF-β1+1～10ng/mlFGF-2。

优选地，步骤S4中，所述的I型胶原海绵支架的孔径为50～500μm。

优选地，所述的I型胶原海绵支架的大小为：长度1～20mm，宽度1～10mm，厚度0.5～2mm；一些实施例中，I型胶原海绵支架的大小为20mm×10mm×1mm。

优选地，所述的软骨培养基的配方如下：DMEM培养基、胎牛血清10％、青霉素-链霉素-谷氨酰胺100U/ml、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸10mM、丙酮酸钠10mM、重组人转化生长因子β310ng/ml、胰岛素10μg/mL、抗坏血酸2-磷酸三钠盐0.1mM。

优选地，步骤S1中，所述的耳软骨直径为2～4mm，耳软骨碎片的大小为1mm×1mm。

优选地，所述的抗生素为0.25％氯霉素溶液。

本发明另一方面还提供了一种根据前面任一项所述的制备方法制得的自体组织工程活细胞睑板替代物。

本发明另一方面还提供了一种如前面所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的用途：用于制备眼睑缺损修复的医用产品。该医用产品在具体应用时，通过修剪成与受体缺损一致的形状、大小后，即可移植回眼睑缺损处。

本发明通过一系列实验评价了本发明方法制得的自体组织工程活细胞睑板替代物的组织学特性、生物力学性能、生物相容性、体内稳定性等，验证了其作为人睑板替代物的应用潜能。

下面对本发明的实验材料实验过程及实验结果进行详细的说明。本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。

实施例1自体组织工程活细胞睑板替代物的制备及性能测定

本实施例中获取的耳软骨来自上海交通大学附属第九人民医院整复外科确诊的睑板缺损患者。

1、试剂的配制

软骨培养基：含10％胎牛血清(FBS，Gibco，USA)、100U/mL青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG，Invitrogen，USA)、10mMN-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES，Gibco，USA)、1mM丙酮酸钠(Sodiumpyruvate，Gibco，USA)、10ng/mL重组人转化生长因子β3(TGF-β3，R&Dsystems，USA)、10μg/mL胰岛素(NovoNordisk，丹麦)、0.1mM抗坏血酸2-磷酸三钠盐(ascorbicacid2-phosphate，sigma，USA)的Dulbecco的改良Eagle培养基。

传代培养基：DMEM+10％FBS+1～10ng/mlTGF-β1+1～10ng/mlFGF-2。

上述两种培养基经0.22μm无菌过滤器进行消毒，4℃保存备用，至多保存2个月后需重新制备。

2、组织工程软骨的制备

(1)在无菌手术条件下使用活检钻取来源于患者的直径2mm的耳软骨组织片，经0.25％氯霉素溶液消毒与无菌PBS清洗后，在超净台内，分离去除软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为1mm×1mm的耳软骨碎片。

(2)在所述耳软骨碎片中加入1.5mg/mL的NB4胶原酶溶液消化6h，得到软骨细胞悬液，其中，每1g耳软骨碎片加入1mL所述的NB4胶原酶溶液；

(3)取适量步骤(2)得到的软骨细胞悬液，以5000个细胞/cm²的接种密度，加入培养基进行传代培养；

(4)取传代至第2代的软骨细胞，以4×10⁴个细胞/cm³的密度种植于I型胶原海绵支架(大小为20mm×10mm×1mm，购自北京益尔康生物工程有限公司)上，加入软骨培养基，置于37℃、5％二氧化碳条件培养箱中培养2周，形成基于胶原海绵支架的组织工程软骨，即本发明所述的自体组织工程活细胞睑板替代物。

3、性能测定

对本实施例制备得到的组织工程软骨进行组织学特性、生物力学性能、生物相容性、稳定性等测定，从而达到质控目的。

(1)I型胶原海绵支架的生物相容性测定

通过电镜扫描，观察未接种细胞的I型胶原海绵支架和接种软骨细胞制备的组织工程软骨的结构和形貌，评价I型胶原海绵支架的生物相容性。

结果如图2所示，未接种细胞的I型胶原海绵支架(Empty)在低倍扫描电镜下显示出疏松多孔的结构，高倍镜下可见平滑的胶原表面；而组织工程软骨在低倍镜下可见胶原海绵原有的孔隙被封闭，形成光滑的细胞外基质涂层，高倍镜下可见黏附于胶原海绵的软骨细胞，并可见其分泌的大量细胞外基质。由此表明，本发明采用的I型胶原蛋白海绵支架可以充分支持软骨细胞的生长、增殖及软骨细胞外基质的分泌，具有良好的生物相容性。

(2)组织工程软骨的组织学特性测定

采用番红O染色、II/X型胶原蛋白染色，结合Bern评分，综合评价本实施例制备的组织工程软骨的组织学特性。

结果如图3所示，本实施例构建的组织工程软骨有清晰的软骨细胞结构，番红O染色阳性，说明具有丰富的糖胺聚糖；II型胶原蛋白阳性，X型胶原蛋白阴性，表明本实施例制备的组织工程软骨是在组织学上没有发生肥大的稳定软骨。

(3)组织工程软骨的力学性能测定

采用拉伸应力试验测试本实施例制备的组织工程软骨的力学性能，以未接种细胞的I型胶原海绵支架作为对照。

结果如图4所示，与未接种细胞的I型胶原海绵支架(collagenscaffold，CS)相比，本实施例制备的组织工程软骨(Tissue-engineeredcartilage，TeC)，的最大伸长率(Maximumstrain)明显增高(图4的A)，且拉伸断裂强度(Tensilebreakingstrength)和杨氏模量(Young’smodulus)均明显下降(图4的B、C)，说明接种细胞后的组织工程软骨具有更大的弹性，从而可以更好地包裹眼球，维持眼睑的正常活动。

(4)组织工程软骨的体内稳定性测定

本发明实验动物购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，本发明动物实验符合上海交通大学医学院附属第九人民医院医学实验动物伦理审查等规定。

将本实施例制备的组织工程软骨植入4周龄的裸小鼠背部皮下，分别于2、4、6个月后取出，测定其面积、厚度改变，计算其收缩率，并计算Bern评分，以评价本实施例制备的组织工程软骨的体内稳定性。

结果如图5和图6所示，在植入裸鼠背部皮下6个月后，本实施例制备的组织工程软骨仍然基本保持原有形状，未发生明显的断裂、扭曲及变形(图5)；另外，组织工程软骨长度收缩率约为20％-25％，厚度改变无统计学意义(图6)。在植入裸鼠背部皮下2、4、6个月后，组织工程睑板替代物Bern评分改变无统计学意义(图7)。

以上体内实验结果表明，本实施例制备的组织工程软骨在裸鼠背部植入6个月后，仍具有相对完整的形状和较低的收缩率，表现出优于传统替代物的稳定性。

实施例2

本发明还通过制备兔来源的组织工程活细胞睑板替代物，并植入兔子睑板缺损处，用以评价本发明制备方法制得的睑板替代物的治疗性能。

1、兔子自体组织工程活细胞睑板替代物的制备

(1)在无菌手术条件下使用活检钻取来源于新西兰白兔的直径2mm的耳软骨组织片，经0.25％氯霉素溶液消毒与无菌PBS清洗后，在超净台内，分离去除软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为1mm×1mm的耳软骨碎片。

(2)在所述耳软骨碎片中加入1.8mg/mL的NB4胶原酶溶液消化8h，得到软骨细胞悬液，其中，每1g耳软骨碎片加入1mL所述的NB4胶原酶溶液；

(3)取适量步骤(2)得到的软骨细胞悬液，以5000个细胞/cm²的接种密度，加入培养基进行传代培养；

(4)取传代至第3代的软骨细胞，以4×10⁴个细胞/cm³的密度种植于I型胶原海绵支架(大小为20mm×10mm×1mm)上，加入软骨培养基，置于37℃、5％二氧化碳条件培养箱中培养3周，形成兔子自体组织工程软骨。

(5)在同一只新西兰兔的双眼下眼睑分别制造距离睑缘2mm的、大小为8×4mm的睑板缺损，将步骤(4)培养好的自体组织工程软骨修剪为合适的大小，缝合于兔的右眼缺损处，作为实验组；左眼不做处理，作为对照组。8周后观察兔子眼睑的恢复情况，拍照记录，然后处死兔子取双侧眼睑组织进行包埋切片和组织学染色。

2、实验结果

如图8所示，术后8周，实验组右眼外观正常，睑缘线条流畅清晰，弧度正常；对照组左眼睑缘不平整，弧度欠流畅，局部有凹陷瘢痕形成(红色箭头示)。

如图9所示，正常眼睑的睑板由致密的纤维组织和丰富的睑板腺构成，可为眼睑提供足够的支撑；实验组眼睑的睑板位置由植入的自体组织工程软骨替代，ColII染色阳性，ColX染色阴性，表明软骨内存在丰富的II型胶原和基质，为眼睑提供充分的支撑；而对照组眼睑的睑板缺失，睑板处由瘢痕样纤维组织取代。

如图10所示，正常眼睑的睑结膜由3～6层复层结膜上皮细胞(CK4阳性)和分散的杯状细胞(MUC5AC阳性)组成；术后8周，实验组睑结膜由1～3层连续的结膜上皮细胞构成，其间分散着杯状细胞；而对照组的睑板上无法形成单层连续上皮，并且没有杯状细胞存在。

由以上结果可知，实验组通过在睑板缺损处植入自体组织工程软骨作为自体活细胞组织工程睑板替代物，为眼睑提供足够的支撑，保证了结膜上皮的稳定性和杯状细胞的活性，有效的修复了睑板缺损。

综上所述，本发明提供了一种组织工程活细胞睑板替代物及其制备方法和应用，本发明通过获取原代耳软骨进行扩增培养，可获得足量的自体耳软骨细胞，并进一步种植于I型胶原海绵支架上进行培养，最终得到本发明所述的组织工程活细胞睑板替代物，其作为新型睑板替代物，不仅具有高生物相容性和高稳定性，且制备方法简单，数量充足，有效避免了传统方法中自体移植的供区消耗和损伤。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获取患者来源的耳软骨，经抗生素消毒、清洗后，分离去除耳软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为耳软骨碎片；

S2，在步骤S1得到的耳软骨碎片中加入胶原酶进行消化处理，得到软骨细胞悬液；

S3，取步骤S2得到的软骨细胞悬液进行传代培养；

S4，取传代至第2～4代的软骨细胞，以3×10⁴～4×10⁴个细胞/cm³的密度种植于I型胶原海绵支架上，加入软骨培养基培养2～4周，形成基于胶原海绵支架的组织工程软骨，即所述的自体组织工程活细胞睑板替代物。

2.如权利要求1所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，根据所述的耳软骨碎片的质量加入一定体积的胶原酶，具体为：每1g耳软骨碎片加入1mL胶原酶，胶原酶的浓度为1～2mg/mL。

3.如权利要求2所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，其特征在于，所述的胶原酶为NB4胶原酶或II型胶原蛋白酶。

4.如权利要求1所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述的I型胶原海绵支架的孔径为50-500μm。

5.如权利要求4所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，其特征在于，所述的I型胶原海绵支架的大小为：长度1～20mm，宽度1～10mm，厚度0.5～2mm。

6.如权利要求1所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，其特征在于，所述的软骨培养基的配方如下：

DMEM培养基、胎牛血清10％、青霉素-链霉素-谷氨酰胺100U/ml、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸10mM、丙酮酸钠10mM、重组人转化生长因子β310ng/ml、胰岛素10μg/mL、抗坏血酸2-磷酸三钠盐0.1mM。

7.如权利要求1所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述的耳软骨直径为2～4mm，耳软骨碎片的大小为1mm×1mm。

8.如权利要求1所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述的抗生素为0.25％氯霉素溶液。

9.一种根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法制得的自体组织工程活细胞睑板替代物。

10.一种如权利要求9所述的自体组织工程活细胞睑板替代物的用途，其特征在于，用于制备眼睑缺损修复的医用产品。

Images