CN110801535A - 一种双层复合结构眼睑仿生支架及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双层复合结构眼睑仿生支架及其制备方法。主要由两层不同仿生眼睑组织材料复合而成,底层为多孔可降解弹性聚酯骨架,表层为天然生物材料海绵;以多孔可降解弹性聚酯为原料,采用明胶模板法制备具有连通孔隙的眼睑骨架材料,将天然生物材料复合于眼睑骨架材料中,获得具有双层复合结构的组织工程眼睑仿生支架。本发明制备的弹性聚酯/天然生物材料复合支架,具匹配的力学强度,维持眼睑形态,同时有良好的生物相容性,能促进成纤维和结膜细胞的生长和功能维持;制备方法简单,重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及界面组织工程分层支架载体及其构建方法,尤其涉及了一种弹性聚酯和天然生物材料复合的仿生眼睑支架及其制备方法。
背景技术
界面组织工程(ITE)是一个新兴领域,以修复或再生不同区域之间的病变或受损区域组织类型,旨在再生功能性组织。组织工程通常使用常规生物材料来设计单个组织(即非界面组织),例如皮肤,软骨,骨和神经,而不是组织界面。实际上,身体中的界面组织由复杂的结构和性质组成,这些结构和性质可能不能通过使用由单相或各向同性生物材料制成的常规支架再生。
眼睑是位于眼球表面的功能化结构,可分为包括皮肤和眼轮匝肌的眼睑前层,和包括睑板和结膜的眼睑后层,睑板的支撑作用及结膜分泌功能可维持眼表组织间生物力学微环境稳定。各种原因造成的较大面积的眼睑缺损修复如果没有植入睑板替代材料以及重建结膜面的缺损,眼睑因缺乏支撑而出现眼睑内翻、眼睑退缩,产生严重的角膜刺激、损伤使得眼睑重建失败及视功能损伤。目前,一些异体组织材料(包括异体主动脉瓣、鼻中隔软骨、硬腭粘膜、异体/异种巩膜、异体/异种脱细胞真皮基质等)、以及人工合成的材料(如多孔聚乙烯,聚四氟乙烯等)被尝试用于眼睑重建治疗。异体/异种组织材料相对容易获得,易于手术操作,比如自体硬腭粘膜作为眼睑后层植入后可以达到较好的修复效果,但它的角化黏膜上皮在上睑修复中会引起角膜损伤;异体/异种软骨硬度较大,具有较好的支撑强度,但韧性较差,很难很好地贴附于眼表。此外因异体/异种移植物与机体的组织抗原性不同,无法完全避免植入后发生免疫排斥反应和传播其他潜在传染病的危险,而且材料易被降解吸收。另一方面,人工合成的材料相比于天然组织材料更容易发生排异和感染,组织相容性相对较差,不可生物降解,且需要同时进行结膜面重建,在眼睑重建上的临床应用受到一定限制。
随着界面组织工程的发展,构建基于眼睑复杂特殊解剖结构和功能的仿生眼睑支架,实现对眼睑缺损的再生与修复成为可能。理想的组织工程眼睑支架要求具有良好的生物相容性,特定的力学强度和微结构及适宜生物降解速度。不饱和聚酯具有很高的反应活性可引入多种共聚单体,调控物理化学性能,并且在生物体内可降解,降解产物通过人体代谢,是理想的生物降解材料。天然生物材料广泛存在与细胞外基质,具有良好的生物相容性和生物活性,可有效的促进细胞黏附生长和维持细胞功能,进而引导组织和器官再生。
发明内容
为了克服背景技术中眼睑缺损缺少理想替代材料的局限,本发明目的在于提供一种以来源广泛的弹性聚酯和天然生物材料为原材料,构建双层复合支架的制备方法,获得可支持眼睑形态,减少眼表刺激,并支持组织长入和结膜再生的眼睑仿生支架。本发明具有良好的生物相容性、特定的力学强度和微结构及适宜生物降解速度。
本发明所采用的技术方案是:
一、一种双层复合结构眼睑仿生支架:支架主要由两层不同仿生眼睑组织材料复合而成,不同仿生眼睑组织材料分别为底层和表层,底层为多孔可降解弹性聚酯骨架,表层为天然生物材料海绵,底层贴近眼睑的深部眼轮匝肌组织,表层贴近角膜。
所述的底层的多孔可降解弹性聚酯骨架厚度为0.7-2mm。
所述的表层的天然生物材料海绵厚度为0.2-0.7mm。
二、一种双层复合结构眼睑仿生支架的制备方法,方法包括以下步骤:
1)将质量浓度为25%-75%的可降解弹性聚酯混合物溶液导入厚度为0.7-2mm的明胶模板中,在85℃温度下交联,自然冷却,然后放入37℃恒温水浴中浸泡,除去明胶模板,得到多孔可降解弹性聚酯骨架;
2)以步骤1)制得的多孔弹性聚酯支架为骨架,在其孔隙内部填充并在表面注入200-500μL的质量浓度为0.5%-8%的天然生物材料溶液,置于37℃的温度下交联4小时以上,然后在低于-20℃的温度下冷冻,冻干取出后得到底层为多孔可降解弹性聚酯骨架、表层为天然生物材料海绵覆盖的双层复合眼睑仿生支架。
所述的可降解弹性聚酯溶液是聚富马酸丙二醇酯(PPF)与甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)反交联应形成的共聚物。
所述步骤1)中,可降解弹性聚酯溶液的质量浓度为25%-75%。
所述步骤1)中,采用以下方式获得明胶模板:在聚乙烯模板中加入厚0.7-2mm、粒径为180-480μm的明胶颗粒,然后注入体积浓度为85%的乙醇水溶液,放入温度为40℃的恒温烘箱,待溶液完全烘干,明胶颗粒形成粘结后取出得到0.7-2mm厚度的明胶模板薄片,作为明胶模板。
所述的天然生物材料是Ⅰ型胶原、明胶、糖胺聚糖或纤维蛋白原。
所述步骤2)中注入的天然生物材料浓度为0.5%-8%,注入的量为200-500μL。
本发明以可降解弹性聚酯为原料,采用明胶模板法制备具有连通孔隙的眼睑骨架材料,将天然生物材料复合于骨架材料,获得具有双层复合结构的组织工程眼睑仿生支架,是弹性聚酯/天然生物材料复合支架。
本发明将多种不同浓度共聚单体引入具有反应活性的不饱和聚酯,调控物理化学性能,获得了生物降解材料,在生物体内可降解,降解产物通过人体代谢。
本发明的优点和有益效果是:
本发明通过复合两层分别仿生眼睑不同组织的材料,获得一种具有双层复合结构的眼睑仿生支架。
底层是以生物可降解聚酯与不同单体交联形成的弹性共聚物为原料,通过明胶模板法制备的具有一定弹性和多孔微结构的聚酯支架,作为眼睑的支撑骨架,维持外观形态。
表层则以天然生物材料为原料,通过冻干法获得的海绵状支架作为结膜面,保护角膜,减少眼表刺激。
两层材料具有不同的生物降解速率,适应两种组织的修复和再生周期。在修复初期,结膜组织沿着支架表层再生,实现再上皮化,封闭创面,减少外来致病因素对组织修复的干扰,为内层睑板修复提供稳定的微环境。
本发明的眼睑仿生支架的原材料来源广泛,生物相容性良好,制备方法简便,所构建的支架可用于眼睑多层组织缺损的重建和修复,是界面组织工程在眼睑重建的首次尝试,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为双层复合结构眼睑仿生支架的表面的扫描电镜图。
图2为双层复合结构眼睑仿生支架的横截面的扫描电镜图。
图3为双层复合结构眼睑仿生支架的孔径分布图。
图4为双层复合结构眼睑仿生支架湿态下拉伸实验的应力-应变曲线图。
图5为双层复合结构眼睑仿生支架湿态下压缩实验的应力-应变曲线图。
图6为免疫荧光染色的接种人结膜基质细胞和上皮细胞的人工睑板仿生支架的图。
图7为双层复合结构眼睑仿生支架原位植入兔眼睑缺损模型2周后眼睑形态及组织切片染色结果图:(A)眼睑皮肤面照片,(B)结膜面修复效果照片,(C)组织切片结果,白色箭头表示再生的结膜,黑色星号为支架。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明。
本发明的实施例如下:
实施例1:
1)在聚乙烯模板中加入厚1mm、粒径为180-280μm的明胶颗粒,然后注入体积浓度为85%的乙醇溶液,放入温度为40℃的烘箱,待溶液完全烘干,明胶颗粒形成粘结后取出得到1mm厚度的明胶模板薄片,形成明胶模板。
然后将聚富马酸丙二醇酯(PPF)与甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)质量比为1:2的共混物(含1%过氧化苯甲酰作为引发剂)作为可降解弹性聚酯共混物导入明胶模板中,置于85℃的温度下交联4小时,然后放入37℃恒温水浴中浸泡,除去明胶模板,得到多孔的聚富马酸丙二醇酯/甲基丙烯酸羟乙酯弹性支架,即为多孔弹性聚酯支架。
2)以步骤1)制得的多孔弹性聚酯支架为骨架,在其孔隙内部充分导入质量浓度为0.5%的Ⅰ型胶原溶液,并表面注入400μL胶原溶液(胶原溶液中含终浓度为0.04%的戊二醛),在37℃的温度下交联4小时,然后在低于-20℃的温度下冷冻2小时,冻干,取出后得到底层为胶原填充的聚富马酸丙二醇酯/甲基丙烯酸羟乙酯共聚物支架,表层为Ⅰ型胶原海绵覆盖的双层复合眼睑仿生支架。
如图1、图2和图3所示,支架表面为孔结构较小的片层状胶原海绵,可以支持结膜上皮细胞的增殖和黏附,从而促进上皮化的完成。底层则为孔结构较大的共聚物支架,孔隙内填充有胶原海绵,有利于成纤维细胞的黏附和迁移,从而促进纤维组织长入支架内部。
图4和图5为分别为实例1制备的人工眼睑仿生支架的拉伸和压缩实验中的应力-应变曲线。图4可见支架具有良好的抗拉伸性能,图5中A点为双层支架的界面处的应力与应变值,以该点为界,分别代表两层支架对应的不同力学性能。表层胶原层用于结膜这种较软的组织的修复与再生,具有较低的模量,而底层用于睑板这种较硬组织的修复,具有较高的模量,用于眼睑的支撑。图6为在眼睑仿生支架上先后种植人结膜基质细胞和上皮细胞经免疫荧光染色的共聚焦显微镜照片。
实施例2
制备方法同实施例1,区别在于:将步骤2)中0.5%的Ⅰ型胶原溶液替换为40mg/mL的纤维蛋白原溶液,加入工作浓度为25U/mL的凝血酶,37℃的温度下交联1小时,冷冻干燥,取出后得到表层孔隙更小,更为致密的聚富马酸丙二醇酯/纤维蛋白胶双层支架。
实施例3
制备方法同实施例1,区别在于:将步骤1明胶颗粒粒径改为280-450μm,步骤2中-20℃的温度下冷冻2小时改为-80℃冷冻1小时,通过改变致孔剂大小,冷冻温度,调控支架的孔径大小及孔隙率。
动物实验测试
本发明选用清洁级雄性新西兰白兔,重量2.5-3.0Kg,由浙江大学医学动物实验中心提供,所有动物实验操作均遵守浙江大学医学院动物实验伦理学规定。按戊巴比妥纳30mg/Kg实施耳缘静脉注射麻醉,常规消毒铺巾。在下睑中央皮肤面距睑缘2mm用4-0线缝两针作为牵引线,暴露睑板。在睑结膜面距睑缘1-2mm处平行睑缘作一长约6mm切口。向下分离睑板,在睑板中央区域全层切除睑板及结膜范围约6mm×5mm,植入双层复合支架,供体与两侧断端用7-0可吸收线间断缝;结膜下注射阿卡米星注射液0.2mg,局部涂可乐必妥眼膏,眼罩包眼;术后立即肌注青霉素40万单位,第2天用可乐必妥滴眼液,一天4次,连续1周。2周后处死新西兰白兔,观察结膜在植入物表面的生长情况,以及眼睑形态有无畸形,有无植入物感染、暴露,有无睑球粘连,眼球运动等。发现仿生支架表面被新生结膜组织覆盖,眼睑形态正常,角膜透明,支架内部有周围组织长入(图7)。
由此上述实施可见,本发明制备的弹性聚酯/天然生物材料复合支架,具匹配的力学强度,维持眼睑形态,具有良好的生物相容性,能促进成纤维和结膜细胞的生长和功能维持。并且制备方法简单,重复性好,在眼睑重建中具有良好的应用前景。
Claims (9)
1.一种双层复合结构眼睑仿生支架,其特征在于:主要由两层不同仿生眼睑组织材料复合而成,不同仿生眼睑组织材料分别为底层和表层,底层为多孔可降解弹性聚酯骨架,表层为天然生物材料海绵,底层贴近眼睑的深部眼轮匝肌组织,表层贴近角膜。
2.根据权利要求1所述的一种双层复合结构眼睑仿生支架,其特征在于:
所述的底层的多孔可降解弹性聚酯骨架厚度为0.7-2mm。
3.根据权利要求1所述的一种双层复合结构眼睑仿生支架,其特征在于:
所述的表层的天然生物材料海绵厚度为0.2-0.7mm。
4.根据权利要求1-3任一所述双层复合结构眼睑仿生支架的制备方法,其特征在于:方法包括以下步骤:
1)将可降解弹性聚酯混合物溶液导入厚度为0.7-2mm的明胶模板中,在85℃温度下交联,冷却至常温,然后放入37℃恒温水浴中浸泡,除去明胶模板,得到多孔可降解弹性聚酯骨架;
2)以步骤1)制得的多孔弹性聚酯支架为骨架,在其孔隙内部填充并在表面注入天然生物材料溶液,置于37℃的温度下交联4小时以上,然后在低于-20℃的温度下冷冻,冻干取出后得到底层为多孔可降解弹性聚酯骨架、表层为天然生物材料海绵覆盖的双层复合眼睑仿生支架。
5.根据权利要求3所述的具有双层复合结构的眼睑仿生支架的制备方法,其特征在于:所述的可降解弹性聚酯是聚富马酸丙二醇酯(PPF)与甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)交联形成的共聚物。
6.根据权利要求3所述的具有双层复合结构的眼睑仿生支架的制备方法,其特征在于:所述步骤1)中,可降解弹性聚酯溶液的质量浓度为25%-75%。
7.根据权利要求3所述的具有双层复合结构的眼睑仿生支架的制备方法,其特征在于:所述步骤1)中,采用以下方式获得明胶模板:在聚乙烯模板中加入厚0.7-2mm、粒径为180—480μm的明胶颗粒,然后注入体积浓度为85%的乙醇水溶液,放入温度为40℃的恒温烘箱,待溶液完全烘干,明胶颗粒形成粘结后取出得到0.7-2mm厚度的明胶模板薄片,作为明胶模板。
8.根据权利要求3所述的具有双层复合结构的眼睑仿生支架的制备方法,其特征在于:所述的天然生物材料是Ⅰ型胶原、明胶、糖胺聚糖或纤维蛋白原。
9.根据权利要求3所述的具有双层复合结构的眼睑仿生支架的制备方法,其特征在于:所述步骤2)中注入的天然生物材料浓度为0.5%-8%,注入的量为200-500μL。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200218 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |