JP5051424B2 - 人工角膜 - Google Patents

Description

本発明は、透明な人工材料と生体分子からなる人工角膜に関する。

角膜上皮疾患に由来する症例に対する新しい医療として角膜上皮シートの移植（非特許文献１）や角膜輪部のステムセル移植（非特許文献２）などが始まりすばらしい成績を収めているが、角膜実質部分に疾患を抱える場合は適応とならず、実質の再生の研究も進められているが、未だ臨床に足る材料は開発されていない。このような症例には、視力回復の手段として人工角膜の適応が選択されることとなる。
人工角膜の研究開発の歴史は古く、１９世紀にさかのぼる。フランス、ドイツ、日本の眼科医の発案とその研究成果として散見され（非特許文献３〜５）、材料としてはガラスや水晶を用いたものであった。これらの人工角膜は、４−５ヶ月程度の視力回復が報告されているが、感染症などにより失明に至っている。その後、合成高分子であるＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）を素材とした人工角膜が、１９４４年はじめてＷuｎｓｃｈｅ らにより試みられ、その後多数の研究者により透明な合成高分子を用いた人工角膜の研究が進められている。近年、再生医療の進歩に伴い、組織工学技術と人工材料を組み合わせたハイブリッド型の人工角膜の研究も始まっている。

人工材料に組織適合性を付与して長期安定的に視力回復を図る試みとてポリハイドロキシメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シリコーン、などの透明でｂｉｏｉｎｅｒｔな素材を光学部分に用いた人工角膜の試みが数多く行われてきた（非特許文献６〜８）。初期に開発されたデバイスの最大の問題点は、高率に眼内炎、緑内症、房水漏出、感染症などの合併症が発生することであった。これらを引き起こす原因としては、生体組織と人工材料の接着性が悪いこと、デバイスの形状のミスマッチや材料と組織の機械的コンプライアンスが一致していないために発生するメカニカルストレスなどが挙げられた。角膜は、言うまでもなく無血管組織であるがために、酸素や栄養の供給は涙液或いは房水液から角膜組織を拡散して行われている。そのため、使用する材料に物質の透過性がない場合は、酸素や栄養等の供給阻害が発生しそれに伴い角膜組織の皮薄化や膨潤が進行して組織破壊につながる。これらの要因が複合的に働くことが、人工角膜を適応した際に高率で合併症が発生した原因と考えられる。
全層置換型の人工角膜では、そのデバイスは生体内と生体外の界面に位置することとなる。つまり、カテーテルなど経皮デバイスで感染の発生が問題となっており効果的な経皮デバイスの開発が望まれているが、人工角膜においてもまったく同様の課題を抱えていることになる。材料と生体組織が接着しない状態では、その間隙からバクテリアやバイラスの侵入が起こり、上記の合併症が発生することになる。また、デバイスと組織の接着が不十分であると、瞬目や外部からの物理的な力が加わることで間隙が生じ感染を誘発したり、眼圧に耐えることが出来ずにデバイスの脱落を生じたりする。人工角膜の開発の歴史は、いかにデバイスを組織に固定するかの研究の歴史であった。固定性を改良するために、Ｈｅｒｎａｎｄ Ｃａｒｄｏｎａｒａらにより考案された光学部分と支持部分からなるＯｐｔｉｃｓ−ａｎｄ−ｓｋｉｒｔ タイプ人工角膜^９）の更なる固定性の改良や一体式で周辺部位に細孔構造を有する人工角膜、歯根部を利用した人工角膜など各種開発されて、脱落等の合併症の発生頻度が減少しつつあるが、未だ改良の必要がありこの挑戦は現在も続いている。

以下に、現在臨床的に検討が進められている代表的な人工角膜を紹介する。
全層角膜移植が適用となる症例の中には、初回移植において移植片の機能不全、角膜内へ血管侵入、緑内障などを起こし角膜移植術が失敗に終わるハイリスク症例が存在する。また、免疫抑制剤などの投与が出来ない症例が存在する。これらの症例を適応としたＰＨＥＭＡ（Ｐｏｌｙ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｒａｔｅ ）製の人工角膜が、オーストラリアのＤｒ． Ｔｒａｉａｎ Ｖ． Ｃｈｉｌｉｒａのグループにより開発され（非特許文献１０）^）、ＡｌｐｈａＣｏｒ^ＴＭ の商標名でＡｒｇｕｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｔｙ 社より販売されている。この人工角膜は、光学部分と支持部分が同一の素材からできた一体型である。一体式であるメリットは、ツーピースタイプのものでは光学部位と固定部位をネジ込み式で固定するが、一体式であるためこの操作が不要であり、接着剤などの使用が不要な点、凹凸が構造上少ないために組織に対するメカニカルストレスが少ない点などが挙げられる。材質的にも含水性素材であるＰｏｌｙ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｒａｔｅを使用しているため、柔軟性があり、物理的強度と柔らかさを備えることで周囲組織との機械的なコンプライアンスも近い設計となっている。ＩＰＮ（相互貫入高分子網目構造）の手法を取り入れて、光学部分とポーラス部分の連続構造を形成し信頼性を向上させている。また、ポア構造部分も細胞や組織の侵入しやすいサイズに制御されている。この人工角膜には、埋入手術の手技も特別に考案されており、特許として登録されている（特許文献１）。手術を２度行わなければならない点、デバイスの表面を角膜上皮が覆うことはなく、表面の涙液の濡れ性、上皮のダウングロースの問題は完全に解決されたわけではない。また、より広範な症例へ適応可能な設計とすること（現在は、スティーブン・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、眼球結膜異常、重症ドライアイなどは禁忌）、角膜融解防止のためのホルモン点眼薬（Ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）の点眼等からの離脱、術後の温存期間の短縮などの改善の必要が挙げられる。

歯根部を利用した人工角膜（Ｏｓｔｅｏ−ｄｏｎｔｏ−ｋｅｒａｔｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ：ＯＯＫＰ）は、歯根部分の軟組織−硬組織傾斜機能を利用して人工角膜の光学部分を組織に固定する方法であり、１９６３年にイタリアのＳｔｒａｍｐｅｌｌｉ教授らにより開発（非特許文献１１）され、Ｆａｌｃｉｎｅｌｌｉ教授たにより改良された（非特許文献１２）ものである。概要を図３に示した。手術は、２−４ヶ月かけて２度に渡り行われる。第１段階では、移植母床作成、歯根部を片面に持ち片面が骨の薄板状移植片（Ｏｓｔｅｏ−ｄｏｎｔｏ−ｌａｍｉｎａ）の作製と移植片への光学部分の固定を行う。直径約３ｃｍの口腔粘膜を採集し、外眼筋付着部位付近で強膜に逢着し新規眼表面を形成し移植母床とする。犬歯とその周囲骨は歯根部まで摘出し、上記板状移植片を作製し、中央部にドリルで３−４ｍｍ径の穴をあけ光学部分であるＰＭＭＡシリンダーを歯科用セメントで固定する。このようにして作製した移植片を反対側眼球下方の眼輪筋内への挿入し肉芽の形成を待つ。第２段階では、肉芽が十分に侵入した移植片を取り出し、不要な肉芽を除去処理しのち、移植母床として形成した口腔粘膜に切開を加えフラップとし、ホスト角膜中央部分にＰＭＭＡシリンダーと同サイズの直径の穴をあけ、光学部分を挿入した後、Ｏｓｔｅｏ−ｄｏｎｔｏ−ｌａｍｉｎａ を角膜、強膜へ縫合し固定する。最後に口腔粘膜フラップに光学部分先端に合わせて切開を加えＰＭＭＡシリンダーを突出させ、口腔粘膜をホスト強膜、結膜に逢着して完成させる手技である。この人工角膜の長期成績は良好で、スティーブンソン・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、角膜化学熱傷、トラコーマ、ドライアイなどにも適応できる。平均９年の経過観察で生着率９５％と高く、重篤な合併症で失明に至るケースは、１０％以下に抑えられている。しかし、この歯根部を利用した人工角膜に関しては、口腔内の正常組織に障害を与える点、視野が限られる点、審美性にかける点、全ての患者がまぶしさを訴える点、術中の網膜剥離や硝子体内出血、術後の緑内障などの合併症が問題とされている。

ドナー角膜と人工角膜を組み合わせたＤｏｈｌｍａｎ−Ｄｏａｎｅ タイプの人工角膜も臨床に応用されてきた（非特許文献１３）。この人工角膜は、カラーボタンタイプと呼ばれフロントプレートとバックプレートでドナー角膜を挟み込むデザインで、術式が比較的易しく使用実績が長いなどの理由で用いられてきたが、術後合併症として緑内障、網膜剥離、眼内炎の発生が認められ、バンコマイシン点眼による細菌感染や眼窩外シャント術などの併用が必要である。
上述の人工角膜に共通して存在する問題は、光学部分には高分子材料がむき出しの状態となるため（角膜上皮細胞がその表面に生着出来ないため）、蛋白質の吸着、変性が起こり不透明化したり、角膜上皮のように涙液膜を保持する能力がなく光学的平滑面を維持することが出来なかったりする。

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再生医工学の技術を用いたアプローチでは、コラーゲン、各種プロテオグリカンなどの細胞外マトリクスや水溶性の合成ポリマーなどと角膜を構成する細胞を組み合わせて角膜類似組織を再生する試みが成されている（非特許文献１４、１５）。カナダのＧｒｉｆｉｔｈらは、ＴｙｐｅＩコラーゲンとコンドロイチン硫酸をグルタールアルデヒドを用いて架橋処理をしたものに、角膜実質細胞を播種し培養した後に、角膜上皮と角膜内皮細胞をそれぞれの面に播種して培養を行った。その結果、透明性に優れた角膜類似構造体の作製に成功している。また、榛村らは、合成高分子とコラーゲンをブレンドして人工角膜実質を合成しホスト角膜からの良好な上皮遊走を達成した。これら角膜再生の試みでは、見かけ上は角膜類似構造の形成に成功しているが、物理的な強度、光学特性を維持できるだけの高次構造制御、神経の再生、長期安定性などに課題を残している。特に、その物理的強度の弱さ、材料の不透明化などの長期安定性に大きな問題を有している。

そこで筆者らは、合成高分子、生体由来蛋白、組織、細胞をハイブリッドした人工角膜の開発を試みている（非特許文献１６〜１８）。
上述したこれまでの人工角膜には備わっていない、人工角膜の光学面に類液膜の保持する機能と細菌の侵入のバリア機能を付与するため、角膜上皮層を形成させる研究を行っている。
また、デバイスの固定性を改善するためにデバイスの辺縁部分に用いる組織と強固に接着することが可能な新規材料の開発を行っている。光学部分に用いる透明な合成高分子の素材としてはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を選択した。ＰＶＡの溶液を不凍溶媒に溶解し低温に保持し物理架橋ゲルを形成すると強靭で透明性に優れた含水率約８０％のハイドロゲルを作成することが可能である。この透明性と物理強度に優れたＰＶＡハイドロゲル表面上に上皮形成を促し、涙液膜を保持し長期的な光学的平滑面を維持できる材料とするために、Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ をゲル表面に共有結合を介して固定化した材料を開発した（特許文献１）。この材料表面上には、良好な角膜上皮の接着と多層上皮化がｉｎ−ｖｉｔｒｏ の系で確認された。また、材料とホスト角膜との接着の増強を目指して生体適合性に優れ、軟組織との接着性を有するハイドロキシアパタイトと上記コラーゲン固定化ＰＶＡハイドロゲルとの複合体を形成する形成する技術を開発した（非特許文献１１）。この角膜実質代替材料は、家兎角膜を用いた短期間の埋入試験で良好な適合性が示されたが、長期安定性に関しては未だに解決すべき点が山積しているのが現状である。特に、材料表面上に形成した上皮層が長期安定的は維持されず詳細な検討が必要である。これらの問題を解決するために、羊膜と上記コラーゲン固定化ＰＶＡの複合化などを試み更なる上皮層の安定性向上を目指しているが未だ長期性長期成績に問題があるのが現状である。

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本発明は、本発明は、臨床上問題となっている上皮のダウングロースによる眼球の感染、人工角膜の脱落の問題を解決することである。

発明１の人工角膜は、表面近傍に生体分子を導入した透明材料のナノファイバーをシート状に集合させてなり、前記ナノファイバーはＰＶＡよりなることを特徴とする構成を採用した。

このようにすることによって、良好な角膜実質細胞の接着、伸展、増殖が行えるようになり、その結果、上皮のダウングロースによる眼球の感染、人工角膜の脱落を無くすことが出来るようになった。

以下に本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明がこれらによって限定されるものではない。

本発明の人工角膜を構成できる材料としては、たとえば、ＰＶＡに限らず、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシメタアクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン系高分子誘導体、ポリカーボネート、ポリスルフォンであってもよい。また、これら単独或いは生体高分子との複合体であってもよい。

これら人工的に構築された繊維状の構成物が、角膜実質細胞の複合体及び細胞複合体を形成可能な構造物である。また、構成するファイバーの直径が50ミクロン以下、好ましくは実施例4に示すように、ナノファイバーから構成された素材で、角膜実質細胞との複合化が容易に達成できる密度，繊維間隙が平均200ミクロン-５ミクロンの繊維状素材を用いることができる。

生体分子としては、実施例にはコラーゲンを示したが、細胞接着分子、たとえばコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、等の細胞接着性蛋白質、糖蛋白質、RGD,RGDS,GRGDS, YIGSR,IKVAV等の細胞接着性オリゴペプチド、ポリ−L−リジン等、
生体接着性蛋白質、糖蛋白質、糖、ペプチド、核酸などでもよい。

人工角膜実質の主成分となる繊維状の高分子は、エレクトロスピニング法を用いて形成した。PVＡを用いた実施例を示す。スピニングの条件を選定することで、マイクロメーターからナノメーターサイズまでの各種太さのPVAファイバーの形成が可能であった。作製したファイバーシートに細胞接着性を付与するために、ＴｙｐｅＩコラーゲンを共有結合により固定化を行った。反応の詳細は以下のとおりである。
図１に示したＰＶＡファイバー不織布を高温脱気乾燥ののち、窒素雰囲気化で表面修飾反応を行った。（図2）ＰＶＡの表面ＯＨを化学等量に比して大過剰のヘキサメチレンジイソシアナート（ＨＭＤＩ）を加え室温にて1時間ＰＶＡ表面に反応活性基を導入し、未反応を除去した後に０．５ｍｇ／ｍｌの酸可溶化コラーゲン溶液中に1時間浸漬することでコラーゲンをＰＶＡファイバー表面に導入した。コラーゲンの固定化量は、ファイバーの表面積換算値で約0.5μｇ／平方センチであった。
コラーゲン固定化ＰＶＡファイバーシートに家兎角膜より分離した実質細胞を播種し、接着試験を行った結果を図３に示す。コラーゲンの固定化処理を行わないＰＶＡファイバーシート上では、細胞の接着伸展増殖が著しく悪いのに対して、コラーゲン修飾ＰＶＡファイバーシート上では、良好な角膜実質細胞の接着、伸展、増殖が確認された。

生体角膜実質の厚みに近い、500ミクロンの細胞複合構造体を実現するために、約100ミクロンの厚みのＰＶＡナノファイバー不織布上に一定量の角膜実質細胞を播種し、それを5枚積層することで細胞複合構造体を作成し、長期間培養を継続し、ファイバー状不織布内で角膜実質細胞が生存するかを検討した。模式図を図４と5に示した。
図４に示したように細胞―複合化積層体を形成させた後、1ヶ月間細胞培養装置内で培養を継続し、その後、サンプルを取り出し、ＳＥＭ、組織染色などを用いて内部細胞の生存状態の検証を行った。（図6から図15 参照）
この結果、最外表層に比べて内部では細胞数が少ないものの、1ヶ月の後も、角膜実質細胞の存在と生存が確認された。このことは、ファイバーシート構造を積層することで層間に角膜実質細胞を維持した角膜実質類似構造体の形成が可能であることが判明した。

従来のコラーゲン固定化ゲル材料と本コラーゲン固定化PVAファイバーシートの比較検討と行った。
その結果を表１に示した。
当該比較検討の結果、従来のコラーゲン固定化PVAゲルシートでは、低分子物質の透過性は確保されるものの、分子量の大きな蛋白質等の投下は阻害されてしまうのに対して、ファイバーから構成されるシート状コラーゲン固定化PVAでは、分子量の大きな蛋白質も十分に透過することが確認された。細胞の接着増殖性を比較したところ、ナノファイバー形状を有するコラーゲン固定化PVAナノファイバーシートの方が顕著な細胞の伸展が認められた。細胞の増殖性では、従来のコラーゲン固定化PVAゲル材料と本コラーゲン固定化PVAファイバーシートの間に差はなく、いずれも良好な細胞増殖性を示した。

ファイバーとゲルの比較

高分子の繊維径を変化させて細胞との接着を評価した。繊維の平均直径10-20ミクロン、3-5ミクロン、0.5ミクロンのファイバーを調製し、繊維芽細胞との付着じょたいを検証した。結果を表２に示す。（図16〜18参照）、平均繊維径0.5ミクロンのファイバーが非常に良好な接着伸展を示した。

ファイバー径と細胞の伸展状態

本発明は、眼科治療技術を大きく伸展させ、従来では闇に閉ざされざるを得ない人々に光明を与えるものである。

実施例1のエレクトロスピニング法により調製されたPVA ファイバーシートの拡大写真 実施例1のPVAファイバーシートへのコラーゲン固定化反応を示す模式図 実施例1のコラーゲン固定化PVAファイバーシート上への角膜実質細胞の付着状態を示す拡大写真 実施例2の積層構造を示す分解模式図 実施例2の積層構造の培養状態を示す模式図 実施例2の培養後の第一層の組織染色拡大写真 実施例2の培養後の第二層の組織染色拡大写真 実施例2の培養後の第三層の組織染色拡大写真 実施例2の培養後の第四層の組織染色拡大写真 実施例2の培養後の第五層の組織染色拡大写真 実施例2の培養後の第一層のSEM像写真 実施例2の培養後の第二層のSEM像写真 実施例2の培養後の第三層のSEM像写真 実施例2の培養後の第四層のSEM像写真 実施例2の培養後の第五層のSEM像写真 実施例4のファイバー径分布：20μm- 30μmへの細胞付着状態を示す拡大写真 実施例4のファイバー径分布：５μm- １０μmへの細胞付着状態を示す拡大写真 実施例4のファイバー径分布：0.5μm- １μmへの細胞付着状態への細胞付着状態を示す拡大写真

Claims (1)

1. 透明な人工材料と生体分子からなる人工角膜であって、その表面近傍に生体分子を導入した透明材料のナノファイバーをシート状に集合させてなり、
   前記ナノファイバーはＰＶＡよりなることを特徴とする人工角膜。