KR102103637B1 - 인공 각막 및 상기 인공 각막의 제조 방법 - Google Patents

인공 각막 및 상기 인공 각막의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

인공 각막의 이탈이나 감염 등이 발생하는 것을 억제할 수 있으며, 충분한 강도와 광학 특성을 갖는 인공 각막과, 상기 인공 각막을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 인공 각막의 제조 방법은, 관통홀이 형성된 부직포를 준비하는 부직포 준비 공정과, 상기 관통홀을 덮을 수 있도록 수성 고분자 겔을 배치하는 겔 배치 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

인공 각막 및 상기 인공 각막의 제조 방법{ARTIFICIAL CORNEA AND METHOD FOR MANUFACTURING THE ARTIFICIAL CORNEA}
본 발명은 인공 각막 및 인공 각막의 제조 방법에 관한 것이다.
각막은 눈(안구)을 구성하는 조직 중 하나이며, 두께 0.5 mm ~ 0.7 mm 정도의 투명한 막이다. 시야 흐림이 생기는 등, 각막에 어떤 문제가 발생하는 것을 각막 질환이라고 하고, 각막 질환은 세계에서 3 번째로 많은 실명 원인이 되고 있다. 현재 전세계1000 만명 이상이 각막 질환에 의해 실명하고 있다고 추정되고 있다.
각막 질환의 치료 방법으로는 각막 이식이 널리 알려져 있다. 그러나 각막 이식은 타인의 생체 조직을 환자에게 이식하는 것이기 때문에, 거부 반응이나 감염이 발생할 우려가 있다. 또한, 각막 공급자 수도 많이 부족한 문제가 있다.
이러한 현재의 환경에서, 생체에서 채취한 각막 대신 인공 각막을 사용하는 것에 대한 검토가 이루어지고 있다.
초기 인공 각막은 거의 전체가 치밀한 투명 무기 재료(유리 등)와 투명 수지(폴리메탈아크릴레이트 등)로 구성된 것도 많았다(예를 들면, 특허 문헌(1) 참조). 그러나, 이러한 인공 각막은 생체 조직과의 접착성이 나쁘고, 안구에 역학적인 스트레스를 가하는 등의 문제가 있으며, 인공 각막의 이탈이나 감염 등의 문제가 발생하기 쉬우며, 적어도 장기간 사용하기에는 매우 어려운 문제가 있었다.
최근, 이러한 문제점에 기초하여, 콜라겐 등의 생체 적합성이 높은 연질 또는 섬유질(예를 들면, 부직포)로 이루어진 인공 각막이 연구되고 있다(예를 들면, 특허문헌 2 참조). 이와 같은 인공 각막은 이식 후에 세포와 친숙하다고 할 수 있는 산소나 영양소를 통과시키는 것이 가능하다는 등의 장점이 있기 때문에, 전술한 문제(인공 각막의 이탈이나 감염 등)가 발생하는 것을 억제할 수 있다.
(특허문헌(1)) JP특개소63-99860 B
(특허문헌 2) JP2008-43419 B
그러나, 연질로 이루어진 인공 각막은 충분한 강도를 갖는 것이 어렵다는 문제가 있다. 또한, 섬유질 물질로 이루어진 인공 각막에 충분한 광학 특성(높은 투명성, 적절한 굴절률 및 낮은 산란성 등)을 얻기가 어렵다는 것은 전술한 특허문헌들이 갖는 문제점이다.
본 발명은 상기한 문제를 해결하기 위하여 제안되는 것으로서, 기존의 인공 각막의 문제(이탈이나 감염 등)의 발생을 억제하는 것이 가능하며, 충분한 강도를 갖으면서 우수한 광학 특성을 갖는 인공 각막과, 그 인공 각막의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 인공 각막은 관통홀이 형성된 부직포와, 상기 관통홀을 덮을 수 있도록 배치되는 수성 고분자 겔을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인공 각막의 제조 방법은, 관통홀이 형성된 부직포를 준비하는 부직포 준비 공정과, 상기 관통홀을 덮을 수 있도록 수성 고분자 겔을 배치하는 겔 배치 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 부직포를 형성하는 섬유는, 나노 섬유인 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 부직포를 형성하는 섬유는, 폴리비닐알코올계 나노 섬유인 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 부직포는, 폴리비닐알코올, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 및 흑연(PVA-HEC-GR)의 복합 나노 섬유인 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 부직포는, 폴리비닐알코올 및 하이드록시에틸 셀룰로오스의 혼합 용액에 흑연을 분산시켜 방사 용액을 원료로 전기 방사법에 의해 형성된 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 부직포에 하이드록시아파타이트(HA)가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 부직포 준비 공정은, 상기 부직포를 염화칼슘 수용액에 침지한 다음, 상기 부직포를 pH10 이상으로 조정한 디소듐포스페이트 수용액(Na2HPO4)(Disodium phosphate:DSP)에 침지하는 사이클을 1회 또는 여러 회 실시함으로써, 상기 부직포에 상기 하이드록시아파타이트를 부착시키는 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 수성 고분자 겔은, 폴리비닐알코올계의 수성 고분자 겔인 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 겔 배치 공정은, 동결 융해법에 의해 상기 부직포에 상기 수성 고분자 겔을 배치하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인공 각막은 부직포가 구성되기 때문에 인체 세포에 친숙하여 거부반응이 일어나지 않으면서, 산소와 영양분의 효율적인 전달과, 강도까지 확보하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 인공 각막에 의하면, 부직포에 관통홀이 형성되고, 관통홀을 덮도록 수성 고분자 겔이 배치되어 있기 때문에, 인공 각막을 통과하는 빛이 부직포에 의한 영향을 받지 않는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명의 인공 각막은 기존의 문제들이 발생하는 것을 억제할 수 있으며, 충분한 강도와 광학 특성을 얻을 수 있다.
본 발명의 인공 각막의 제조 방법에 따르면, 관통홀이 형성된 부직포를 준비하는 부직포 준비 공정과, 관통홀을 덮도록 수성 고분자 겔을 배치하는 겔 배치 공정을 포함하며, 기존의 인공 각막이 갖고 있었던 문제가 발생하는 것을 억제하고, 충분한 강도와 광학 특성을 갖는 인공 각막을 제조할 수 있다.
도 1은 실시예에 따른 인공 각막을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법의 흐름도이다.
도 3은 실시예에 따른 인공 각막의 부직포 및 나노 스케일의 하이드록시 아파타이트(nHA)의 전반사 측정법에 의한 푸리에 변환 적외선 분광 스펙트럼(ATR-FTIR 스펙트럼)을 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예에 따른 인공 각막의 부직포, 흑연(GR) 및 nHA의 X선 회절(XRD) 패턴을 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예에 따른 인공 각막의 부직포 및 nHA의 고분해능 XRD 패턴을 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예에 따른 인공 각막의 부직포에 대한 전계 방출형 주사 전자 현미경(FE-SEM) 사진이다.
도 7은 실시예에 따른 인공 각막의 부직포를 구성하는 섬유의 직경 분포를 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예에 따른 인공 각막 및 nHA의 고분해능 FE-SEM 이미지이다.
도 9는 실시예에 따른 인공 각막의 부직포와 폴리비닐알코올(PVA) 하이드로 겔의 수분 함량을 나타내는 막대 그래프이다.
도 10은 실시예에 따른 인공 각막의 부직포 및 PVA 하이드로 겔의 물접촉각에 관한 실험의 모습을 나타내는 도면이다.
도 11은 실시예에 따른 인공 각막의 부직포 및 PVA 하이드로 겔에 대한 변형-응력 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 12는 실시예에 관한 세포 독성 시험의 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 13은 실시예에 관한 세포 독성 시험의 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
이하, 본 발명에 따른 인공 각막과 인공 각막의 제조 방법을 실시예에 따라 설명한다. 또한, 실시예에서 설명되는 구성들과 그 조합이 모두 본 발명의 해결 수단에 필수적인 것은 아니다.
1. 실시예에 따른 인공 각막(1)
도 1은 실시예에 따른 인공 각막(1)을 설명하기 위해 도시한 도면이다. 도 1a는 인공 각막(1)의 평면도이고, 도 1b는 도 1a의 A-A 단면도이다.
우선, 실시예(1)에 따른 인공 각막(1)에 대해 설명한다.
실시예에 따른 인공 각막(1)은, 도 1에 도시된 바와 같이, 관통홀(12)이 형성된 부직포(10)는 관통홀(12)을 덮을 수 있도록 배치된 수성 고분자 겔(20)을 포함한다.
인공 각막(1)의 크기는 사용 목적(이식 대상)에 따라 적절하게 설정할 수있다. 일반적으로, 성인인 경우에는 인공 각막의 두께는 0.5mm ~ 0.7mm 정도가 될 수 있다.
부직포(10)는 평면에서 볼 때 원형의 외형 형상을 가지며, 그 원의 중심에 관통홀(12)이 형성된다. 부직포(10)는 수성 고분자 겔(20)의 베이스 기판이라고도 할 수 있다.
부직포(10)를 구성하는 섬유는 본 발명의 효과를 해치지 않는 한 다양한 직경을 갖는 어떤 재료들로도 이루어질 수 있을 것이다. 다만, 부직포(10)를 구성하는 섬유는 나노 섬유 인 것이 바람직하다.
나노 섬유는 나노 사이즈의 섬유 직경(예를 들어, 3000nm 이하의 섬유 직경, 바람직하게는 1000nm 이하의 평균 섬유 직경)을 갖는 섬유이다. 나노 섬유는 마이크로 사이즈 이상의 섬유 직경을 갖는 일반 섬유와는 다른 성질(예를 들어, 매우 큰 비표면적)을 가지며, 다양한 분야에서 활용되고 있다. 실시예에서는, 나노 섬유의 섬유 직경은 50nm ~ 500nm의 범위에 속하는 것이 바람직하다.
또한, 부직포(10)를 구성하는 섬유는 폴리비닐알코올(PVA)계 나노 섬유 인 것이 더욱 바람직하다. 폴리비닐알코올계 나노 섬유는 주요 성분(중량비로 30% 이상의 성분)으로서, 폴리비닐알코올을 원료로 하는 성분을 함유하는 나노 섬유를 말한다.
또한, 폴리비닐알코올은 수용성 폴리머이기 때문에, 부직포의 원료로 폴리비닐알코올계 중합체를 사용하는 경우에는 기본적으로 불용화처리(예를 들어, 글루타르알데히드(GA), 열, UV 등을 이용한 가교 처리)를 할 필요가 있다. 폴리비닐알코올에 대한 불용화 처리의 필요성과 구체적인 방법은 주지의 사항이므로 다음의 설명에서 불용화 처리에 대한 상세한 설명은 생략한다.
실시예에서, 부직포(10)는 폴리비닐알코올-하이드록시에틸 셀룰로오스-흑연(PVA-HEC-GR) 복합 나노 섬유로 구성된다.
폴리비닐알코올-하이드록시에틸 셀룰로오스-흑연 복합 나노 섬유는 폴리비닐알코올(PVA)과 하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC)가 혼합된 원료로 이루어진 나노 섬유의 사이에 흑연(GR)이 분산된 것이다. 또한, 흑연은 반드시 나노 스케일로 이루어져야 하는 것은 아니고, 예를 들면, 최장부의 길이가 20μm 이하인 것이면 사용할 수 있다.
물론, 본 발명은 전술한 구성 이외에, 키토산, 겔라틴-PVA, 셀룰로오스, 폴리-L-젖산(lactic acid) 등 생체 적합성이 높은 물질을 원료로 하는 나노 섬유로 이루어진 부직포를 사용할 수도 있다.
실시예에서, 부직포(10)에 하이드록시아파타이트(HA)가 부착되어 있다. 하이드록시아파타이트는 물리적으로 부착되거나 화학적으로 부착되어도 좋다.
수성 고분자 겔(20)은 관통홀(12)을 덮도록 배치된다. 수성 고분자 겔(20)은 "관통홀(12)을 채우도록 배치된다"고 표현할 수도 있고, "관통홀(12) 내에 배치된다"고 표현할 수 있다.
수성 고분자 겔(20)은 폴리비닐알코올계의 수용성 고분자 겔이다. 수성 고분자 겔은 폴리머에 의한 3차원적인 망사형 구조 내에 물을 보유하고 있는 겔(하이드로 겔)을 의미한다. 폴리비닐알코올계 수용성 폴리머 겔은 폴리비닐알코올을 원료로 하는 성분을 주요 성분으로 갖는 수성 고분자 겔의 것을 말한다. 폴리비닐알코올계 수용성 폴리머 겔은 폴리머 전체가 완전 가수 분해 폴리비닐알코올로 이루어진 폴리비닐알코올 하이드로 겔(PVA 하이드로 겔)이 될 수 있다. 물론, 본 발명은 수성 고분자 겔로서, 폴리하이드록시에틸메타아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 실리콘 하이드로 겔 등을 이용할 수도 있다.
2. 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법
도 2는 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법의 흐름도이다.
다음으로, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법을 설명한다.
실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법은, 도 2와 같이, 부직포 준비 공정(S10)과 겔 배치 공정(S20)을 포함한다.
부직포 준비 공정(S10)은 관통홀(12)이 형성된 부직포(10)를 준비하는 공정이다. 부직포 준비 공정(S10)은 전기 방사 공정(S12)(electro spinning) 및 하이드록시아파타이트 부착 공정(S14)을 포함한다.
부직포 준비 공정(S10)에서 준비하는 부직포(10)는 나노 섬유로 이루어진 부직포가 바람직하고, 폴리비닐알코올계 나노 섬유인 것이 더욱 바람직하다.
실시예에서, 부직포(10)는 폴리비닐알코올-하이드록시에틸 셀룰로오스-흑연(PVA-HEC-GR)의 복합 나노 섬유로 구성된다. 해당 부직포(10)는 전기 방사 공정(S12)에 의해 준비할 수있다.
전기 방사 공정(S12)은 전기 방사(전계 방사)법에 의해 나노 섬유를 형성하여 상기 나노 섬유로 구성된 부직포(10)를 얻는 공정이다.
전기 방사 공정(S12)에서는 폴리비닐알코올 및 하이드록시에틸 셀룰로오스의 혼합 용액에 흑연을 분산시켜 방사 용액을 원료로 전기 방사 법에 의해 부직포(10)(복합 나노 섬유)을 형성한다. 전기 방사에 의한 부직포(복합 나노 섬유)의 제조 조건은 후술하는 실시예에서 설명하겠지만, 제조 조건은 이에 한정되는 것이 아니라 적절한 범위에서 변경할 수 있다.
부직포 준비 공정(S10)에서 준비하는 부직포(10)는 하이드록시아파타이트가 부착되어있다. 해당 부직포(10) 하이드록시아파타이트 부착 공정(S14)에 의해 준비할 수 있다.
하이드록시아파타이트 부착 공정(S14)은 부직포(10)를 염화칼슘(CaCl2) 수용액에 침지한 후, 부직포(10)를 pH10 이상으로 조정한 디소듐포스페이트 수용액(Na2HPO4)(Disodium phosphate:DSP)에 침지하는 사이클을 1회 또는 여러 회 실시하여 부직포(10)에 하이드록시아파타이트를 부착시키는 공정이다.
위의 방법으로는 나노 스케일의 하이드록시아파타이트를 합성하면서 부직포(10)에 부착시켜 나가게 된다. 이 경우, 부직포(10)를 구성하는 섬유의 히드록시기가 칼슘 이온과 화학적으로 결합하기 때문에, 하이드록시아파타이트의 접착성을 높일 수 있다.
부직포에 하이드록시아파타이트를 부착시키는 공정은 상기에 한정되는 것이 아니라, 다른 공정(방법)에 의해 부직포에 하이드록시아파타이트를 부착시킬 수도 있을 것이다.
또한, 부직포 준비 공정(S10)에서 준비하는 부직포(10)에는 관통홀(12)이 형성되어 있지만, 관통홀(12)의 형성은 겔 배치 공정(S20)에 앞선 어느 단계에서도 수행될 수 있다. 관통홀(12)은, 예를 들어, 절단 및 펀칭에 의해 형성될 수 있다. 한편, 부직포(10)를 처음부터 관통홀(12)을 포함하는 형태로 형성될 수도 있다. 이것은 부직포(10)의 외주 형상에 대해서도 마찬가지이다.
겔 배치 공정(S20)은 관통홀(12)을 덮도록 수성 고분자 겔(20)을 배치하는 공정이다.
수성 고분자 겔(20)은 폴리비닐알코올계의 수용성 폴리머 겔이다. 폴리비닐알코올계의 수용성 폴리머 겔로는 폴리비닐알코올 하이드로 겔이 사용될 수 있다.
겔 배치 공정(S20)에서는 동결 융해법에 의해 부직포(10)에 수성 고분자 겔(20)을 배치(고정)한다. 동결 융해법은 널리 알려진 기술이므로 상세한 설명은 생략한다. 또한, 부직포(10)에 수성 고분자 겔(20)을 배치하는 공정은 상기에 한정되는 것이 아니라, 다른 공정(방법)에 의해 부직포(10) 수성 고분자 겔(20)을 배치(고정)할 수도 있을 것이다.
3. 실시예에 따른 인공 각막(1) 및 인공 각막의 제조 방법의 효과
이하, 실시예에 따른 인공 각막(1) 및 인공 각막의 제조 방법의 효과에 대해 설명한다.
실시예에 따른 인공 각막(1)에 따르면, 부직포(10)를 준비하기 위해 세포에 익숙하여 인체에서 거부 반응이 발생되지 않으며, 산소와 영양분의 효과적인 전달과, 각막의 강도를 확보하는 것이 가능해진다.
또한, 실시예에 따른 인공 각막(1)에 따르면, 부직포(10)에 관통홀이 형성되고, 상기 관통홀(12)을 덮도록 수성 고분자 겔(20)가 배치되어 있기 때문에, 인공 각막(1)을 통과하는 빛이 부직포(10)의 영향을 받지 않아 빛의 간섭을 최소화하는 것이 가능하다.
실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 따르면, 관통홀(12)이 형성된 부직포(10)를 준비하는 부직포 준비 공정(S10)과 관통홀(12)을 덮도록 수성 고분자 겔(20)을 배치하는 겔 배치 공정(S20)을 포함하며, 이러한 제조 방법에 의해 제조된 인공 각막은 전술한 효과를 달성할 수 있게 해준다.
또한, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 의하면, 부직포(10)를 구성하는 섬유는 나노 섬유이기 때문에, 부직포(10)의 강도 및 비표면적을 충분히 크게 할 수 있으며, 제조하는 인공 각막(1)이 상처 부위에 안정적으로 정착되는 것을 충분히 보장할 수 있다.
또한, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 의하면, 부직포(10)를 구성하는 섬유는 폴리비닐알코올계 나노 섬유이기 때문에 생체 적합성이 높고, 나노 섬유화에 적합한 재료인 폴리비닐알코올을 주요 재료로 사용할 수 있기 때문에 인공 각막(1)의 부직포(10)가 상처 부위에 안정적으로 정착될 수 있다.
또한, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 의하면, 부직포(10)는 폴리비닐알코올-하이드록시에틸 셀룰로오스-흑연의 복합 나노 섬유로 이루어지기 때문에, 인공 각막에 하이드록시에틸 셀룰로오스가 추가되어 나노 섬유의 인장 강도를 높아지게 된다. 그리고, 흑연에 의해 인공 각막에 정착한 생체 조직(세포)의 활성을 높일 수 있다(혈관신생(vascularization) 등을 촉진).
또한, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 의하면, 부직포(10)는 폴리비닐알코올 및 하이드록시에틸 셀룰로오스의 혼합 용액에 흑연을 분산시켜 방사 용액을 원료로 전기 방사 방법에 의해 형성되기 때문에, 섬유 직경의 불규칙이 적으면서 흑연의 응집도 적은 부직포(10)를 형성하는 것이 가능해진다.
또한, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 의하면, 부직포(10)에 하이드록시아파타이트가 부착되어 있기 때문에, 부직포(10) 상에 정착한 생체 조직(세포)의 활성을 높일 수 있으며, 인공 각막과 안구의 일체화를 촉진할 수 있다.
또한, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 의하면, 부직포 준비 공정(S10)에서는 부직포(10)를 염화칼슘 수용액에 침지한 후, 부직포(10)를 pH10 이상으로 조정한 디소듐포스페이트 수용액에 침지 사이클을 한 번 또는 여러 번 실시하여 부직포(10)에 하이드록시아파타이트를 부착시키기 때문에, 부직포(10) 및 하이드록시아파타이트 사이의 접착성을 높일 수 있으며, 사이클의 횟수를 변경하여 하이드록시아파타이트의 양을 쉽게 조절할 수 있다.
또한, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 의하면, 수성 고분자 겔(20)은 폴리비닐알코올계의 수용성 폴리머 겔이기 때문에, 좋은 광학 특성을 갖는 폴리비닐알코올계의 수용성 폴리머 겔을 이용하여 인공 각막(1)이 더욱 좋은 광학 특성을 갖을 수 있다.
또한, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에 의하면, 겔 배치 공정(S20)에서는 동결 융해법에 의해 부직포(10)에 수성 고분자 겔(20)을 배치하기 때문에, 간편한 방법으로 부직포(10)와 수성 고분자 겔(20)를 고정시킬 수 있다.
[실시예]
본 발명의 인공 각막의 제조 방법에 따라 인공 각막을 제조하였고, 그 결과를 관찰 및 실험하였다.
1. 실시예에서 사용한 시약·장비 등
우선, 실시예에서 사용한 시약과 장비 등을 설명한다.
실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법에서는, 분석용 등급의 시약을 사용 하였다. 수산화나트륨(NaOH 순도 97.0%), 아세톤, 에탄올(99.5), 10배 인산염완충식염수(PBS buffer.pH7.4) 및 농염산(HCl. 35.0 ~ 37.0% )는 와코순약공업주식회사(Wako Pure Chemical Industries, Ltd) 회사를 통해 구입한 것을 사용하였다. 이메틸일산화황(Dimethyl sulfoxide)(DMSO), 흑연 분말(GR. <20μm), 폴리비닐알코올(PVA. Mw:85, 000-124, 000, 가수 분해도 : 87 ~ 89% 및 완전겔화), 2-하이드록시메틸 셀룰로오스(HEC. 평균Mw : 90,000) 및 디소듐포스페이트(Na2HPO4)은 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich,Inc)를 통해 구입한 것을 사용하였다. 글루타르알데히드(GA. 50%수용액) 및 염화칼슘(CaCl2)은 미국의 MP Biomedicals사를 통해 구입한 것을 사용하였다.
인공 각막에 대한 세포 독성 시험에서도, 분석용 등급의 시약 등을 사용 하였다. 동물세포배양배지인 Dulbecco's Modified Eagle's Medium / 햄F-12혼합배지((DMEM) / Ham's F-12 medium)는 시그마 알드리치 통해 구입한 것을 사용 하였다. 새끼소 혈청(NBCS), 인슐린-트랜스페린(transferrin)-셀세늄(Se)의 혼합 시약(ITS)과, 상피 성장 인자(EGF. 체세포재조합)는 써모피셔사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)의 Gibco 브랜드를 구입하여 사용하였다. 염화칼슘(CaCl2)은 AjaxFinechem사를 통해 구입한 것을 사용하였다.
24 웰 세포 배양 플레이트는 Greiner Bio-One International사의 것을 사용하였다.
인체각막상피(HCE) 세포는 Schepens Eye Research Institute의 Ilene Gipson 박사로부터 양도된 것을 사용하였다.
전계 방사의 전원 공급 장치로는, 마츠사다 정밀 주식회사(Matsusada precision Inc)의 Har-100*12를 사용하였다.
ATR-FTIR 스펙트럼의 측정에는 영국의 Smiths Detection사의 DuraSamplIR II을 사용하였다. 측정은 실온에서 실시하였다.
X선 회절 패턴(XRD 패턴)의 측정에는 주식회사 리가쿠(Rigaku coporation)의 Rotaflex RTP300을 사용하였다. 측정은 Cu kα선을 이용하였다. 관전압 및 관전류는 각각 50kV 및 200mA로 하였다.
전계 방출형 주사전자현미경(FE-SEM) 이미지의 취득에는 히타치제작소의 S-5000을 사용하였다. 샘플을 70℃에서 건조시켜 금으로 코팅한 후 샘플 이미지 수집을 실시하였다.
섬유 직경을 산출하기 위한 이미지 분석 소프트웨어로는 ImageJ를 사용 하였다.
물접촉각(WCA)의 측정은 쿄화인터페이스과학 주식회사(Kyowa Interface Science Co.,Ltd)의 CA-D 형 물접촉각 측정기를 사용하였다.
부직포 등의 물리적 특성의 측정에는 주식회사 A&D(https://www.aandd.co.jp/)의 텐시론만능재료시험기 RTC1250A를 이용하였다. 크로스 헤드 속도는 1mm/min로 하였다. 측정은 ASTM D638 플라스틱 인장 시험 방법에 따라 실시하고, 샘플로 아령형으로 성형한 것을 사용하였다. 온도는 실온이였다. 샘플의 게이지 길이는 100mm로 하고, 1배 인산완충식염수에 15 분 침지한 후 시험을 실시하였다.
세포의 모습은 올림푸스 주식회사 도립 현미경(Inverted microscope)을 이용하여 관찰 하였다.
2. 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법
다음으로, 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법을 설명한다.
실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법은 기본적으로 실시예에 따른 인공 각막의 제조 방법과 동일하며, 부직포 준비 공정과 겔 배치 공정을 포함한다.
(1) 부직포 준비 공정
(1-1) 전기 방사 공정
먼저 가수 분해도가 87% ~ 89%의 폴리비닐알코올(이하 PVA라고 기재)을 탈 이온수에 첨가하고, 80℃에서 4시간 동안 교반하고 11wt% PVA 수용액을 제조 하였다. 이와는 별도로, 하이드록시에틸 셀룰로오스(이하, HEC라고 기재)를 탈이온수에 첨가하고, 50℃에서 6시간 동안 교반하고 5%(v/v) HEC 수용액을 제조하였다.
그 다음, 부피비가 흑연(이하, GR로 기재) : HEC 수용액 = 0.1 : 10 이되도록 GR을 HEC 용액에 넣어 2시간 동안 교반하고, HEC/GR 수용액을 제조하였다. 다음으로, 부피비가 HEC/GR 수용액 : PVA 수용액 = 1 : 9가 되도록 HEC/GR 수용액을 PVA 수용액과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 교반하여 방사 용액을 제조 하였다. 제작한 방사 용액에 초음파 처리하여 기포를 제거하였다.
다음으로, 전원 장치와, 모세관 칩을 장착한 20mL 플라스틱 실린지와, 전원 장치의 양극과 모세관 칩을 접속하는 구리와, 전원 장치의 음극과 접속된 금속의 콜렉터를 구비한 전기 방사 장치를 준비하고, 전기 방사를 실시하였다. 칩-콜렉터 사이의 거리는 15cm로, 인가 전압은 12kV로 하였다. 전기 방사 중에는, 방사 용액의 유량을 1mL/h로 하였다.
또한, 상기한 바와 같은 전기 방사 장치 및 전기 방사 장치를 구성하는 구성 요소는 널리 알려져있는 것이므로 상세한 설명은 생략한다.
다음으로 전기 방사하여 얻은 부직포를 4cm2 정도의 크기로 자르고, 직경 90mm 샬레(페트리 접시)에 놓았다. 글루타르알데히드(GA) 2g, 에탄올 2g 및 염산 0.1g을 50mL 둥근 바닥 플라스크에 준비하고, 아세톤을 첨가하여 50mL의 불용화 용액을 제조하였다. 상기 불용화 용액에 부직포를 침지시켜 상온에서 6시간 두었다. 그 후 부직포를 37℃의 탈이온수로 세척하였고, 세척은 셰이커 인큐베이터(shaker incubator)로 하였고, 세척 시간은 2일 수행하였다. 세척하는 동안 12시간 마다 탈이온수를 새 것으로 교체하였다.
그 후, 부직포를 직경 8mm의 원형 모양이 되도록 절단하였으며, 그 다음 부직포를 37℃에서 48시간 건조시켰다.
(1-2) 하이드록시아파타이트 부착 공정
그 다음, 부직포를 셰이커 인큐베이터에 세팅하여 둔 25mL의 0.05M 염화칼슘(CaCl2) 수용액에 넣고 37℃에서 12 시간 보온하였다. 12시간 후, 염화칼슘 수용액을 0.03M 디소듐포스페이트(Na2HPO4) 수용액 25mL로 교체하고, 2M 수산화 나트륨(NaOH) 수용액으로 pH를 11으로 조정하였다. 이 상태에서 37℃에서 12 시간 보온하였다.
실시예는 나노 크기의 하이드록시아파타이트(이하 nHA라고 기재)를 부착시키는 양의 영향을 관찰하기 위하여 상기 사이클의 반복 횟수를 1회 ~ 3 회 수행한 부직포를 준비하였다. 또한, 하이드록시아파타이트 부착 공정을 수행하지 않은 부직포도 준비하였다. 그 후, 부직포를 탈이온수로 15 분 세척하고 37℃에서 건조시켰다. 겔 배치 공정 전에 부직포의 중앙에 직경 3mm의 관통홀을 형성하였다.
(2) 겔 배치 공정
PVA(완전 가수 분해) 15g을 80% 이메틸일산화황(Dimethyl sulfoxide)(DMSO) 수용액 75g에 첨가하고, 80℃에서 4시간 동안 교반하여 수성 고분자 겔의 근원이 되는 15wt% PVA 용액을 제조하였다.
다음으로, 15wt% PVA 용액에 부직포를 침지하고, 동결 융해법에 의해 수성 고분자 겔을 배치하였다. 동결 융해법은 115wt% PVA 용액 및 부직포를 -20 ℃의 환경에 12시간 넣는 공정과, 실온의 환경에 12시간 넣는 공정을 5회 반복하여 실시하였다.
그 다음, 수성 고분자 겔을 배치한 부직포를 셰이커 인큐베이터 내의 물에 넣고, 12시간마다 물을 보충하면서 37℃에서 2일간 세척하고, 이메틸일산화황(DMSO)을 제거하였다.
이렇게하여 실시예에 따른 인공 각막을 제조하였다.
3. 실시예에 따른 인공 각막의 물성 등
이하, 실시예에 따른 인공 각막의 물성 등을 관찰 및 측정 결과를 설명한다.
또한, 이하의 설명에서는 nHA가 부착되어 있지 않은 부직포를 사용하여 제조한 인공 각막을 인공 각막 S0, nHA를 부착시키는 사이클을 1회 실시한 부직포를 사용하여 제조한 인공 각막을 인공 각막 S1, nHA 를 부착시키는 사이클을 2회 실시한 부직포를 사용하여 제조한 인공 각막을 인공 각막 S2, nHA를 부착시키는 사이클을 3회 실시한 부직포를 사용하여 제조한 인공 각막을 인공 각막 S3으로 기재하기로 한다. 도면에서도 S0 ~ S3의 부호를 그대로 사용한다.
도 3은 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 nHA의 ATR-FTIR 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 3의 그래프의 가로축은 파장(단위 : cm-1)를 나타내고, 세로축은 흡광도를 나타낸다. 그리고, 각 스펙트럼은 비교하기 쉽도록 수직으로 도시되어 있기 때문에, 세로축의 흡광도는 각 스펙트럼의 절대 흡광도를 나타내는 것은 아니다.
도 4는 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포, GR 및 nHA의 XRD 패턴을 나타내는 그래프이다. 도 4의 그래프의 가로축은 2θ를 나타내고, 세로축은 강도(임의 단위)를 나타낸다.
도 5는 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 nHA의 고분해능 XRD 패턴을 나타내는 그래프이다. 도 5의 그래프의 가로축은 2θ를 나타내고, 세로축은 강도(임의 단위)을 나타낸다.
도 6은 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포의 FE-SEM 사진이다.
도 6(a)는 인공 각막 S0 부직포의 FE-SEM 사진이고,도 6(b)는 인공 각막 S1 부직포의 FE-SEM 사진이고,도 6(c)는 인공 각막 S2 부직포 FE-SEM 사진이고,도 6(d)는 인공 각막 S3 부직포의 FE-SEM 사진이다.
도 7은 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포를 구성하는 섬유의 섬유 직경 분포를 나타내는 그래프이다. 도 7(a)는 인공 각막 S0 부직포의 섬유 직경 분포를 나타내는 그래프이고, 도 7(b)는 인공 각막 S1 부직포의 섬유 직경 분포를 나타내는 그래프이고, 도 7(c)는 인공 각막 S2 부직포의 섬유 직경 분포를 나타내는 그래프이고, 도 7(d)는 인공 각막 S3 부직포의 섬유 직경 분포를 나타내는 그래프이다. 도 7에 나타내는 그래프의 세로축은 개수(단위:개)를 나타낸다.
도 8은 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3 및 nHA의 고분해능 FE-SEM 이미지이다. 도 8(a)는 인공 각막 S0 부직포의 FE-SEM 사진이고, 도 8(b)는 인공 각막 S1 부직포의 FE-SEM 사진이고, 도 8(c)는 인공 각막 S2 부직포의 FE-SEM 이미지이고, 도 8(d)는 인공 각막 S3 부직포의 FE-SEM 이미지이고, 도 8(e)는 nHA의 FE-SEM 이미지이고, 도 8(f)는 인공 각막 S0 관통홀의 인접부 부근을 나타내는 FE-SEM 이미지이다.
도 9는 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 PVA 하이드로 겔의 수분 함량을 나타내는 막대 그래프이다. 도 9의 막대 그래프의 세로축은 함수율(단위 : %)을 나타낸다.
도 10은 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 PVA 하이드로 겔의 물접촉각에 관한 실험들을 나타내는 도면이다. 도 10(a)는 물접촉각의 수치를 나타내는 막대 그래프이며, 도 10(b) 내지 도 10(f)는 각 샘플의 측정시의 사진이다.
도 11은 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 PVA 하이드로 겔의 변형-응력 곡선을 나타내는 그래프이다. 도 11의 그래프의 가로축은 변형(단위 : %)을 나타내고, 세로축은 응력(단위 : MPa)을 나타낸다. 또한, 도 11의 그래프에서 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포에 대한 측정 결과가 거의 같은 경향으로 되어 분리하여 나타내는 것이 곤란하기 때문에 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포에 대한 그래프를 정리하여 'S0- S3'로 표시하고 있다.
먼저, 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 nHA 대해 ATR-FTIR 스펙트럼을 측정하였다(도 3 참조).
인공 각막 S0 ~ S3의 부직포에서는 OH 또는 CH2 에 관련되는 3382cm-1 및 2931cm-1의 밴드, COOH 또는 C=C 결합에 관련되는 1726cm-1 및 1427cm-1의 피크, C-O 결합에 관련되는 1242cm-1 및 1116cm-1의 피크 등, 기본적인 피크 등이 확인되었다.
또한, nHA에 대해서도 OH 대칭 신축에 기인하는 3382cm-1의 밴드, 탄산 하이드록시아파타이트에 관련되는 1427cm-1의 피크, P-O 결합의 굽힘 진동 및 신축 진동에 기인하는 1020cm-1의 밴드, P-O 결합의 대칭 신축에 기인하는 1020cm-1의 밴드, 인산이온(PO43-)의 대칭 신축으로 인한 962cm-1의 피크, 인산이온(PO43-)의 비대칭 신축으로 인한 873cm-1 밴드 등 기본적인 피크 등을 확인할 수 있었다.
또한, nHA를 부착시키는 사이클을 많이 할수록 nHA의 증가로 인해 PO 결합의 대칭 신축으로 인한 1020cm-1의 피크가 커지고 칼슘 이온의 영향으로 인해 OH에 관련되는 3382cm-1의 밴드가 작아지는 등의 경향이 보였다.
즉, nHA의 부착이 성공했는지 또는 nHA를 부착시키는 사이클의 횟수에 따라 nHA의 부착량을 제어할 수있는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포, GR 및 nHA 대해 XRD 패턴을 측정 하였다(도 4 참조). 또한, 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 nHA에 대하여, 35° ~ 55°의 범위 내에서 고분해능 XRD 패턴을 측정하였다(도 5 참조).
그 결과, GR 및 nHA에 특징적인 피크 모양과 인공 각막 S0 ~ S3의 피크 모양과 비교(특히, nHA 관련되는 특징적인 피크가 되는 47°, 49.7° 및 53.4°의 피크의 강도. 도 5 참조)에서 nHA를 부착시키는 사이클의 횟수에 따라 nHA의 부착량을 제어 할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포의 FE-SEM 사진을 찍어 관찰을 실시하였다(도 6과 도 7 참조).
전체적으로는 부드러운 형태의 나노 섬유를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다. 그리고, 나노 섬유의 섬유 직경은 153nm ~ 543nm이고, 이것은 nHA를 부착시키는 사이클의 횟수에 의존하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 나노 섬유 중 70%는 섬유 직경이 300nm ~ 400nm의 범위 내에 있고, 전체적으로 평균 섬유 직경은 359nm 이었다. FE-SEM 이미지에서 GR의 응집은 확인할 수 없었다. 특히, 인공 각막 S3에서는 다른 샘플과 비교하여 nHA(바늘 모양의 물질이 응집하는 것)가 증가하고 있음을 확인할 수 있었다.
다음으로, 인공 각막 S0 ~ S3 및 nHA의 고분해능 FE-SEM 사진을 찍어 관찰을 실시하였다(도 8 참조). 그 결과, 인공 각막 S1에서는 바늘 모양 구조의 nHA가 응집하기 시작하는 것을 관찰하였고(도 8(b) 참조), 인공 각막 S2 및 인공 각막 S3는 nHA이 더욱 증가하고 있음을 확인할 수 있었다(도 8(c) 및 도 8(d) 참조). 그리고, nHA의 고분해능 FE-SEM 이미지에서 바늘 모양의 nHA가 응집하여 평균 직경 52nm의 응집체를 형성하고있는 것을 확인할 수 있었으며, 이것은 인공 각막 S1 ~ S3에서도 마찬가지이였다.
또한, 인공 각막의 관통홀의 인접부 부근에는 갭 등이 보이지 않으며, 인공 각막의 부직포와 수성 고분자 겔(PVA 하이드로 겔)이 고정되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 8(f) 참조). 그리고, 도 8(f)에 나타난 것은 인공 각막 S0 대한 FE-SEM 이미지이지만, 다른 인공 각막 S1 ~ S3에서도 비슷한 결과를 확인할 수 있었다. 인공 각막의 관통홀의 인접부 부근에서는 수성 고분자 겔이 부직포 내부에 수μm ~ 수십μm 정도(실시예에서는 20μm 정도) 스며들어 들어가기 때문에, 부직포-인접부-수성 고분자 겔이 매끄럽게 연속하게 되는 것으로 판단된다.
다음으로, 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 PVA 하이드로 겔의 수분 함량을 측정하였다(도 9 참조). 함수율은 물을 충분히 흡수시킨 상태의 샘플의 무게와 잘 건조시킨 상태의 샘플의 무게와 측정함으로써 계산되었다. PVA 하이드로 겔의 함수율은 79.5%이며, 이것은 인간의 생체 각막의 수분 함량 수치(약 78%)와 가까운 수치임을 확인할 수 있었다. 그리고, 인공 각막 S0 ~ S3 부직포의 수분 함량은 83.8% ~ 88.3%의 범위 내에 있는 것을 확인할 수 있었다. 부직포에서는 nHA의 양이 증가하면 수분을 흡수할 수 있는 양이 약간 줄어서, 흡수율이 감소하는 경향이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 PVA 하이드로 겔의 물접촉각을 측정하였다(도 10 참조). 그 결과, 인공 각막 S0 ~ S3 들이 PVA 하이드로 겔보다 물접촉각이 크다는 결과가 얻어졌다.
다음으로, 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 PVA 하이드로 겔의 변형-응력 곡선을 측정하여 물성을 조사하였다(도 11 참조). 그 결과, 예상대로, 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포는 PVA 하이드로 겔과 비교하여 탄성이 낮고, 인장 강도가 크다는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로는, PVA 하이드로 겔의 인장 강도는 2.29MPa였. 반면, 인공 각막 S0의 인장 강도는 6.32MPa이며, 인공 각막 S1의 인장 강도는 7.48MPa로 있으며, 인공 각막 S2의 인장 강도는 7.27MPa이며, 인공 각막 S3의 인장 강도는 8.69MPa였다. 그리고, 상기 결과를 보면, nHA의 양이 증가하면 부직포의 인장 강도도 커지는 경향이 있는 것으로 판단된다.
4. 각막 세포에 대한 세포 독성 시험
도 12 및 도 13은 실시예에서 세포 독성 시험의 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 12(a)는 음성 조절(negative control)에 대한 결과를 나타내는 사진이고, 도 12(b)는 양성 조절(positive control)에 대한 결과를 나타내는 사진이고, 도 12(c)는 PVA 하이드로 겔에 대한 결과를 나타내는 사진 있다.
그리고, 도 13(a)는 인공 각막 S0 부직포에 대한 결과를 나타내는 사진이고, 도 13(b)는 인공 각막 S1의 부직포에 대한 결과를 나타내는 사진이고, 도 13(c)는 인공 각막 S2의 부직포에 대한 결과를 나타내는 사진이고, 도 13(d)는 인공 각막 S3의 부직포에 대한 결과를 보여주는 사진이다.
다음으로, 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 PVA 하이드로 겔의 인체 각막 상피(HCE) 세포에 대한 세포 독성에 대한 시험을 실시하였다.
인체 각막 상피 세포를 배양하는 배지로는 10% 새끼소 혈청(NBCS), 1.05mM 염화칼슘(CaCl2), 0.5% 이메틸일산화황(DMSO), 2mg/mL 상피 성장 인자(EGF. 인체재조합체) 및 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄 혼합 시약(ITS)을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium / 햄F-12혼합배지((DMEM) / Ham's F-12 medium)를 사용하였다. HCE 세포의 배양은 24 웰 세포 배양 플레이트를 이용하여 80%의 합류가 될 때까지하였다.
그 다음, 세포층에 샘플을 직접 배치하고, 신선한 배지에서 24 시간 배양 하였다. 배양 후 트리판 블루(trypan blue)에서 죽은 세포를 염색하고, 현미경으로 관찰하였다. 세포 독성은 ISO10993 지침을 따랐다.
그리고, 음성 조절의 샘플로는, Silastic medical grade tubing(실리콘탄성중합체(silicon elastomer)의 튜브, Dow Corning사 제조)를 사용하였다. 그리고, 양성 조절로는 무균 수술용 라텍스 장갑(호주 Ansell Medical사 제조)을 사용하였다.
그 결과, 양성 조절에서는 세포가 전멸한 반면, 음성 조절에서는 적은 수의 세포 죽음이 발생하였다. 해당 세포의 죽음도 샘플을 배치할 때의 물리적 손상에 기인하는 것이라고 판단된다. 실시예에 따른 인공 각막 S0 ~ S3의 부직포 및 PVA 하이드로 겔에 대해서는, 세포 죽음의 비율은 음성 조절과 가까운 결과가 나타났다. 즉, 인체 각막 상피 세포에 대한 세포 독성은 없는 것으로 확인 하였다.
5. 결론
이상의 시험예에 의하여 본 발명의 인공 각막의 제조 방법에 따라서 달성하고자 하였던 인공 각막의 제조가 가능함을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명을 상기 실시예 및 실시예에 따라 설명했지만, 본 발명은 상기의 실시예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 그 취지를 벗어나지 않는 범위에서 다양한 양태에서 실시하는 것이 가능하다.
예를 들어, 상기 실시 형태 및 각 실험 예에서 기재한 구성 등은 예시 또는 구체적인 예이며, 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서 변경하는 것이 가능하다.
1 : 인공 각막
10 : 부직포
12 : 관통홀
20 : 수성 고분자 겔

Claims (10)

  1. 관통홀이 형성된 부직포와,
    상기 관통홀을 덮을 수 있도록 배치되는 수성 고분자 겔을 포함하고,
    상기 부직포는, 폴리비닐알코올, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 및 흑연(PVA-HEC-GR)의 복합 나노 섬유인 것을 특징으로 하는 인공 각막.
  2. 관통홀이 형성된 부직포를 준비하는 부직포 준비 공정과,
    상기 관통홀을 덮을 수 있도록 수성 고분자 겔을 배치하는 겔 배치 공정을 포함하고,
    상기 부직포 준비 공정은, 폴리비닐알코올, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 및 흑연(PVA-HEC-GR)의 복합 나노 섬유로 이루어진 부직포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공 각막의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 부직포를 형성하는 섬유는, 나노 섬유인 것을 특징으로 하는 인공 각막의 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 부직포를 형성하는 섬유는, 폴리비닐알코올계 나노 섬유인 것을 특징으로 하는 인공 각막의 제조 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 부직포는, 폴리비닐알코올 및 하이드록시에틸 셀룰로오스의 혼합 용액에 흑연을 분산시킨 방사 용액을 원료로 전기 방사법에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 인공 각막의 제조 방법.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부직포에 하이드록시아파타이트(HA)가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 인공 각막의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 부직포 준비 공정은,
    상기 부직포를 염화칼슘 수용액에 침지한 다음, 상기 부직포를 pH10 이상으로 조정한 디소듐포스페이트 수용액(Na2HPO4)(Disodium phosphate:DSP)에 침지하는 사이클을 1회 또는 여러 회 실시함으로써, 상기 부직포에 상기 하이드록시아파타이트를 부착시키는 것을 특징으로 하는 인공 각막의 제조 방법.
  8. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수성 고분자 겔은, 폴리비닐알코올계의 수성 고분자 겔인 것을 특징으로 하는 인공 각막의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 겔 배치 공정은, 동결 융해법에 의해 상기 부직포에 상기 수성 고분자 겔을 배치하는 것을 특징으로 하는 인공 각막의 제조 방법.
  10. 삭제
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