JP7005408B2 - 人工角膜及び人工角膜の製造方法 - Google Patents
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Description
そこで、生体から採取した角膜ではなく人工角膜を用いることが検討されている。
図1は、実施形態に係る人工角膜1を説明するために示す図である。図1(a)は人工角膜1の平面図であり、図1(b)は図1(a)のA-A断面図である。
まず、実施形態1に係る人工角膜1について説明する。
人工角膜1の大きさは、使用目的(移植対象)に応じて適宜設定することができる。一般的には、移植先の角膜の厚さ(ヒト(成人)であれば、上記したように厚さ0.5mm~0.7mm程度)に合わせることが好ましい。
不織布10は、水性高分子ゲル20の足場材であるということもできる。
不織布10を構成する繊維は、ナノファイバーであることが好ましい。
ナノファイバーとは、ナノオーダーの繊維径(例えば、3000nm以下の繊維径。好ましくは、1000nm以下の平均繊維径。)を有する繊維である。ナノファイバーは、マイクロオーダー以上の繊維径を有する通常の繊維とは異なる性質(例えば、極めて大きい比表面積)を有し、様々な分野で活用されている。この場合、ナノファイバーの繊維径は50nm~500nmの範囲内にあることが好ましい。
ポリビニルアルコール系ナノファイバーとは、主な成分(重量比で30%以上の成分)としてポリビニルアルコールを原料とする成分を含有するナノファイバーのことをいう。
ポリビニルアルコール-ヒドロキシエチルセルロース-グラファイト複合ナノファイバーとは、ポリビニルアルコール(PVA)とヒドロキシエチルセルロース(HEC)とが混合された原料からなるナノファイバーの繊維間にグラファイト(GR)が分散されたもののことをいう。なお、グラファイトはナノスケールのものである必要はなく、例えば、最長部の長さが20μm以下のものを用いることができる。
水性高分子ゲルとは、ポリマーによる三次元的な網目状構造内に水を保持しているゲル(ハイドロゲル)のことをいう。ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルとは、ポリビニルアルコールを原料とする成分を主な成分として有する水性高分子ゲルのことをいう。
ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルとしては、ポリマー全体が完全加水分解のポリビニルアルコールからなるポリビニルアルコールハイドロゲル(PVAハイドロゲル)を好適に用いることができる。
もちろん、本発明には、水性高分子ゲルとして、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリビニルピロリドン、シリコーンハイドロゲル等を用いることもできる。
図2は、実施形態に係る人工角膜の製造方法のフローチャートである。
次に、実施形態に係る人工角膜の製造方法について説明する。
実施形態においては、不織布10は、ポリビニルアルコール-ヒドロキシエチルセルロース-グラファイト(PVA-HEC-GR)複合ナノファイバーからなる。
当該不織布10は、エレクトロスピニング工程S12により準備することができる。
エレクトロスピニング工程S12では、ポリビニルアルコール及びヒドロキシエチルセルロースの混合溶液にグラファイトを分散させた紡糸溶液を原料としてエレクトロスピニング法により不織布10(複合ナノファイバー)を形成する。エレクトロスピニング法による不織布(複合ナノファイバー)の製造条件は後述する実施例で例示するが、製造条件はこれに限定されるものではなく、適切な範囲で変更することができる。
上記の方法では、ナノスケールのハイドロキシアパタイトを合成しつつ不織布10に付着させていくことになる。この場合、不織布10を構成する繊維におけるヒドロキシ基がカルシウムイオンと化学的に結合するため、ハイドロキシアパタイトの付着力を高くすることが可能となる。
不織布にハイドロキシアパタイトを付着させる工程は上記に限定されるものではなく、他の工程(方法)により不織布にハイドロキシアパタイトを付着させてもよい。
水性高分子ゲル20は、ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルである。ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルとしては、ポリビニルアルコールハイドロゲルを好適に用いることができる。
ゲル配置工程S20では、凍結融解法により不織布10に水性高分子ゲル20を配置(固定)する。凍結融解法は広く知られている技術であるため、詳細な説明は省略する。
なお、不織布10に水性高分子ゲル20を配置する工程は上記に限定されるものではなく、他の工程(方法)により不織布10に水性高分子ゲル20を配置(固定)してもよい。
以下、実施形態に係る人工角膜1及び人工角膜の製造方法の効果について説明する。
実施例においては、本発明の人工角膜を本発明の人工角膜の製造方法により実際に製造し、観察や実験を行った。
まず、実施例で用いた試薬や装置等について説明する。
24ウェル細胞培養プレートは、Greiner Bio-One International社のものを使用した。
ヒト角膜上皮(HCE)細胞は、Schepens Eye Research InstituteのIlene Gipson博士から譲渡されたものを用いた。
ATR-FTIRスペクトルの測定には、英国のSmiths Detection社のDuraSamplIR IIを用いた。測定は室温で行った。
X線回折パターン(XRDパターン)の測定には、株式会社リガクのRotaflex RTP300を用いた。測定には、Cu kα線を用いた。管電圧及び管電流は、それぞれ50kV及び200mAとした。
繊維径を算出するための画像分析ソフトとしては、Image Jを用いた。
水接触角(WCA)の測定には、協和界面科学株式会社のCA-D型水接触角計を用いた。
細胞の様子は、オリンパス株式会社の倒立顕微鏡を用いて観察した。
次に、実施例に係る人工角膜の製造方法について説明する。
実施例に係る人工角膜の製造方法は、基本的には実施形態に係る人工角膜の製造方法と同様であり、不織布準備工程とゲル配置工程とを含む。
(1-1)エレクトロスピニング工程
まず、加水分解度が87%~89%のポリビニルアルコール(以下、PVAと記載する。)を脱イオン水に加え、80℃で4時間攪拌し、11wt%PVA水溶液を作製した。これとは別に、ヒドロキシエチルセルロース(以下、HECと記載する)を脱イオン水に加え、50℃で6時間攪拌し、5%(v/v)HEC水溶液も作製した。
なお、上記したようなエレクトロスピニング装置やエレクトロスピニング装置を構成する構成要素は広く知られているものであるため、詳細な説明は省略する。
その後、不織布を、直径8mmの円形形状となるように切断した。その後、不織布を37℃で48時間乾燥させた。
次に、不織布を、シェーカーインキュベーター中にセットした0.05M塩化カルシウム(CaCl2)水溶液25mLに入れ、37℃で12時間保温した。12時間後、塩化カルシウム水溶液を0.03Mリン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)水溶液25mLと交換し、2M水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液でpHを11に調整した。この状態で、37℃で12時間保温した。
実施例については、ナノサイズのハイドロキシアパタイト(以下、nHAと記載する。)を付着させる量による影響を観察するために、上記サイクルの繰り返し数を1回~3回とした不織布を準備した。また、ハイドロキシアパタイト付着工程を行わなかった不織布も準備した。
その後、不織布を脱イオン水で15分洗浄し、37℃で乾燥させた。ゲル配置工程前に、不織布の中央に直径3mmの貫通孔を形成した。
PVA(完全加水分解)15gを80%ジメチルスルホキシド(DMSO)水溶液75gに加え、80℃で4時間攪拌することで水性高分子ゲルのもととなる15wt%PVA溶液を作製した。
次に、15wt%PVA溶液に不織布を浸漬し、凍結融解法により水性高分子ゲルを配置した。凍結融解法は、15wt%PVA溶液及び不織布を、-20℃の環境に12時間置く工程と、室温の環境に12時間置く工程とを5回繰り返すことにより実施した。
その後、水性高分子ゲルを配置した不織布をシェーカーインキュベーター中にセットした水の中に入れ、12時間ごとに水を取り替えながら37℃で2日間洗浄し、ジメチルスルホキシドを除去した。
このようにして、実施例に係る人工角膜を製造した。
以下、実施例に係る人工角膜の物性等を観察及び測定した結果を説明する。
なお、以下の説明では、nHAが付着していない不織布を用いて製造した人工角膜を人工角膜S0、nHAを付着させるサイクルを1回実施した不織布を用いて製造した人工角膜を人工角膜S1、nHAを付着させるサイクルを2回実施した不織布を用いて製造した人工角膜を人工角膜S2、nHAを付着させるサイクルを3回実施した不織布を用いて製造した人工角膜を人工角膜S3とする。図面においても、S0~S3の符号を用いる。
図4は、実施例に係る人工角膜S0~S3における不織布、GR及びnHAのXRDパターンを示すグラフである。図4のグラフの横軸は2θを表し、縦軸は強度(任意単位)を表す。
図5は、実施例に係る人工角膜S0~S3における不織布及びnHAの高分解能XRDパターンを示すグラフである。図5のグラフの横軸は2θを表し、縦軸は強度(任意単位)を表す。
図7は、実施例に係る人工角膜S0~S3における不織布を構成する繊維の繊維径の分布を示すグラフである。図7(a)は人工角膜S0の不織布の繊維径の分布を示すグラフであり、図7(b)は人工角膜S1の不織布の繊維径の分布を示すグラフであり、図7(c)は人工角膜S2の不織布の繊維径の分布を示すグラフであり、図7(d)は人工角膜S3の不織布の繊維径の分布を示すグラフである。図7に示すグラフの縦軸は本数(単位:本)を表す。
図8は、実施例に係る人工角膜S0~S3及びnHAの高分解能FE-SEM画像である。図8(a)は人工角膜S0の不織布のFE-SEM画像であり、図8(b)は人工角膜S1の不織布のFE-SEM画像であり、図8(c)は人工角膜S2の不織布のFE-SEM画像であり、図8(d)は人工角膜S3の不織布のFE-SEM画像であり、図8(e)はnHAのFE-SEM画像であり、図8(f)は人工角膜S0の貫通孔の辺縁部付近を示すFE-SEM画像である。
図10は、実施例に係る人工角膜S0~S3の不織布及びPVAハイドロゲルの水接触角に関する実験の様子を示す図である。図10(a)は水接触角の数値を示す棒グラフであり、図10(b)~図10(f)は各サンプルの測定時の写真である。
図11は、実施例に係る人工角膜S0~S3の不織布及びPVAハイドロゲルのひずみ-応力曲線を示すグラフである。図11のグラフの横軸はひずみ(単位:%)を表し、縦軸は応力(単位:MPa)を表す。なお、図11のグラフにおいては、人工角膜S0~S3の不織布に関する測定結果がほぼ同じ傾向となり分離して示すことが困難であるため、人工角膜S0~S3の不織布に関するグラフをまとめて「S0-S3」と表示している。
人工角膜S0~S3における不織布においては、OHやCH2に関連する3382cm-1及び2931cm-1のバンド、COOHやC=C結合に関連する1726cm-1及び1427cm-1のピーク、C-O結合に関連する1242cm-1及び1116cm-1のピーク等、基本的なピーク等が確認できた。
つまり、nHAの付着が成功していることや、nHAを付着させるサイクルの回数によりnHAの付着量を制御できることが確認できた。
その結果、GR及びnHAに特徴的なピーク形状と人工角膜S0~S3のピーク形状との比較(特に、nHAに関連する特徴的なピークである47°、49.7°及び53.4°のピークの強度。図5参照。)から、nHAを付着させるサイクルの回数によりnHAの付着量を制御できることが確認できた。
全体的には、スムーズな形状のナノファイバーが製造できていることが確認できた。また、ナノファイバーの繊維径は153nm~543nmであり、これはnHAを付着させるサイクルの回数には依存していないことが確認できた。ナノファイバーのうち70%は繊維径が300nm~400nmの範囲内にあり、全体としての平均繊維径は359nmであった。FE-SEM画像からはGRの凝集は確認できなかった。また、特に人工角膜S3においては、他のサンプルと比較してnHA(針状の物質が凝集しているもの)が増加していることが確認できた。
また、人工角膜の貫通孔の辺縁部付近にはギャップ等が見られず、人工角膜においては不織布と水性高分子ゲル(PVAハイドロゲル)とがしっかり固定できていることが確認できた(図8(f)参照。)。なお、図8(f)に示したのは人工角膜S0に関するFE-SEM画像であるが、他の人工角膜S1~S3においても同様の結果が確認できた。人工角膜の貫通孔の辺縁部付近においては、水性高分子ゲルが不織布内部に数μm~数十μm程度(実施例においては20μm程度)染み込むように入り込んでいるため、不織布‐辺縁部‐水性高分子ゲルが滑らかに連続するようになると考えられる。
その結果、予期した通り、人工角膜S0~S3の不織布は、PVAハイドロゲルと比較して、弾性が低く、引っ張り強さが大きいことが確認できた。具体的には、PVAハイドロゲルの引っ張り強さは2.29MPaであったのに対して、人工角膜S0の引っ張り強さは6.32MPaであり、人工角膜S1の引っ張り強さは7.48MPaであり、人工角膜S2の引っ張り強さは7.27MPaであり、人工角膜S3の引っ張り強さは8.69MPaであった。なお、上記結果を見ると、nHAの量が増えると不織布の引っ張り強さも大きくなる傾向があるように思われる。
図12及び図13は、実施例における細胞毒性試験の結果を示す顕微鏡写真である。図12(a)はネガティブコントロールについての結果を示す写真であり、図12(b)はポジティブコントロールについての結果を示す写真であり、図12(c)はPVAハイドロゲルについての結果を示す写真である。また、図13(a)は人工角膜S0の不織布についての結果を示す写真であり、図13(b)は人工角膜S1の不織布についての結果を示す写真であり、図13(c)は人工角膜S2の不織布についての結果を示す写真であり、図13(d)は人工角膜S3の不織布についての結果を示す写真である。
ヒト角膜上皮細胞を培養するための培地としては、10%仔ウシ血清(NBCS)、1.05mM塩化カルシウム(CaCl2)、0.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)、2mg/mL上皮成長因子(EGF。ヒト組換え体。)及び1%インスリン-トランスフェリン-セレニウム混合試薬(ITS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地/ハムF-12混合培地((DMEM)/Ham’s F-12 medium)を用いた。
HCE細胞の培養には24ウェル細胞培養プレートを用い、80%コンフルエントとなるまで行った。
なお、ネガティブコントロールのサンプルとしては、Silastic medical grade tubing(シリコーンエラストマー製のチューブ、Dow Corning社製。)を用いた。また、ポジティブコントロールのサンプルとしては、無菌手術用ラテックス手袋(オーストラリアのAnsell Medical社製)を用いた。
以上の試験例により、本発明の人工角膜の製造方法により本発明の人工角膜が製造可能であることが確認できた。
例えば、上記実施形態及び各実験例において記載した構成等は例示又は具体例であり、本発明の効果を損なわない範囲において変更することが可能である。
Claims (7)
- 貫通孔が形成された不織布と、
前記貫通孔を覆うように配置されている水性高分子ゲルとを備え、
前記不織布は、ポリビニルアルコール-ヒドロキシエチルセルロース-グラファイト複合ナノファイバーからなることを特徴とする人工角膜。 - 貫通孔が形成された不織布を準備する不織布準備工程と、
前記貫通孔を覆うように水性高分子ゲルを配置するゲル配置工程とを含み、
前記不織布は、ポリビニルアルコール-ヒドロキシエチルセルロース-グラファイト複合ナノファイバーからなることを特徴とする人工角膜の製造方法。 - 前記不織布は、ポリビニルアルコール及びヒドロキシエチルセルロースの混合溶液にグラファイトを分散させた紡糸溶液を原料としてエレクトロスピニング法により形成されたものであることを特徴とする請求項2に記載の人工角膜の製造方法。
- 前記不織布にハイドロキシアパタイトが付着していることを特徴とする請求項2又は3に記載の人工角膜の製造方法。
- 前記不織布準備工程では、前記不織布を塩化カルシウム水溶液に浸漬し、その後、前記不織布をpH10以上に調整したリン酸水素二ナトリウム水溶液に浸漬するサイクルを一回又は複数回実施することにより前記不織布に前記ハイドロキシアパタイトを付着させることを特徴とする請求項4に記載の人工角膜の製造方法。
- 前記水性高分子ゲルは、ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルであることを特徴とする請求項2~5のいずれかに記載の人工角膜の製造方法。
- 前記ゲル配置工程では、凍結融解法により前記不織布に前記水性高分子ゲルを配置することを特徴とする請求項6に記載の人工角膜の製造方法。
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