TW202015801A - 可注射型自組裝微球凝膠、其用途及可注射型自組裝微球凝膠的製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種可注射型自組裝微球凝膠，包含一第一微凝膠以及一第二微凝膠。第一微凝膠具有一第一電荷並包含複數個第一凝膠微球。第二微凝膠具有一第二電荷並包含複數個第二凝膠微球。其中，第一電荷與第二電荷的電性相反，第一凝膠微球的平均粒徑與第二凝膠微球的平均粒徑相等。藉此，本發明之可注射型自組裝微球凝膠可因異電相吸的特性而進行自組裝，並可利用注射方法直接進行施用。

Description

可注射型自組裝微球凝膠、其用途及可注射型自組裝微球 凝膠的製備方法

本發明係關於一種醫藥用水凝膠及醫藥用水凝膠的製備方法，特別是關於一種可注射之醫藥用水凝膠及可注射之醫藥用水凝膠的製備方法。

組織工程(Tissue Engineering)是一種將生物活性物質以體外構建的方式進行培養，再將其植入生物體中，進而達成細胞再生與組織修復的醫療方法。組織工程有三項主要的要素，分別為細胞、細胞生長支架以及生長因子，而其中又以細胞生長支架為相關研究領域的探討重點。細胞生長支架係利用生物可降解的材料製成，除了必須具有高度的生物相容性與孔隙率，更需具備的足夠的機械強度，以促進細胞貼附於其中生長。

習知的細胞生長支架為了維持其機械強度或多孔性結構，多需以手術等侵入性方式將其植入人體中，然而，手術等侵入性的植入方式將會對人體造成額外的傷害， 並可能增加感染的風險，致使習知的細胞生長支架在應用性上較為不彰。而為了解決上述問題，遂有相關研究人員提出一種可通過注射而導入生物體中的膠體，以供細胞進行貼附與生長，但前述的膠體卻容易因孔隙率不足，導致膠體周邊的細胞在氧氣和營養交換效率較為不彰，進而降低細胞的生長活性，更甚者可能造成細胞衰老或死亡，致使細胞移植失敗。

因此，如何發展一種具同時具備優異之細胞相容性、孔隙率與機械強度，以及使用便利性之細胞生長支架，實為本領域之技術人員所共同努力的目標。

本發明之一態樣在於提供一種可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其包含下述步驟：進行一第一凝膠微球製備步驟、進行一第二凝膠微球製備步驟以及進行一共混步驟。第一凝膠微球製備步驟包含下述步驟：提供一第一溶液、提供一第一油相溶液及進行一第一油包水型乳化反應。前述之第一溶液用以作為水相並包含一第一成分與一第二成分，其中第一成分包含丙烯酸或其衍生物，第二成分包含殼聚醣或蠶絲。第一油包水型乳化反應係混合前述之第一溶液與前述之第一油相溶液，以形成複數個第一凝膠微球。第二凝膠微球製備步驟包含下述步驟：提供一第二溶液、提供一第二油相溶液及進行一第二油包水型乳化反應。前述之第二溶液用以作為水相並包含一第三成分與一第四成分，其中 前述之第三成分包含丙烯酸或其衍生物，前述之第四成分包含明膠、透明質酸或褐藻膠。第二油包水型乳化反應係混合前述之第二溶液與前述之第二油相溶液，以形成複數個第二凝膠微球。共混步驟係混和前述之第一凝膠微球、前述之第二凝膠微球以及一水性溶液，以得前述之可注射型自組裝微球凝膠。其中，前述之各第一凝膠微球具有一第一電荷、前述之各第二凝膠微球具有一第二電荷，且第一電荷與第二電荷的電性相反。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中丙烯酸或其衍生物可包含甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酐及甲基丙烯酸縮水甘油酯。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中第一凝膠微球的平均粒徑可為30μm至500μm，第二凝膠微球的平均粒徑可為30μm至500μm。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中可注射型自組裝微球凝膠中的第一凝膠微球與第二凝膠微球的一體積百分比可為1：0.5至1：6。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其可於一微流道系統中進行。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中可注射型自組裝微球凝膠之一膠體強度可為30Pa至3100Pa。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中可注射型自組裝微球凝膠之一平均孔隙率可為35%至50%。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中可注射型自組裝微球凝膠之一平均孔徑可為30μm至90μm。

藉此，本發明之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法透過將具有相反電性之第一凝膠微球與第二凝膠微球進行共混的方式，使所得之可注射型自組裝微球凝膠可利用注射的方式直接進行施用，並具有優良的自組裝能力。再者，本發明之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法係使用丙烯酸或其衍生物以及具有高度生物相容性的基材作為第一凝膠微球與第二凝膠微球的原料，不僅可避免原料的材質對細胞產生毒性，更可有效進行量產，進而增加本發明之可注射型自組裝微球凝膠的方法所製得之可注射型自組裝微球凝膠的使用安全性與應用廣度。

本發明之另一態樣在於提供一種可注射型自組裝微球凝膠，包含一第一微凝膠以及一第二微凝膠。第一微凝膠具有一第一電荷，其中第一微凝膠包含複數個第一凝膠微球，且第一凝膠微球的平均粒徑為30μm至500μm。第二微凝膠具有一第二電荷，其中第二微凝膠包含複數個第二凝膠微球，且第二凝膠微球的平均粒徑為30μm至500μm。其中，第一電荷與第二電荷的電性相反，可注射型自組裝微球凝膠的第一凝膠微球的平均粒徑與第二凝膠微球 的平均粒徑相等，且各第一凝膠微球包含丙烯酸系殼聚醣聚合物、丙烯酸系蠶絲聚合物、或其組合，各第二凝膠微球包含丙烯酸系明膠聚合物、丙烯酸系透明質酸聚合物、丙烯酸系褐藻膠聚合物、或其組合。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠，其中各第一凝膠微球可包含甲基丙烯酸酯殼聚醣、甲基丙烯酸酯蠶絲、或其組合，各第二凝膠微球可包含甲基丙烯酸酯明膠、甲基丙烯酸酯透明質酸、甲基丙烯酸酯褐藻膠、或其組合。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠，其中第一微凝膠與第二微凝膠的一體積百分比可為1：0.5至1：6。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠，其中可注射型自組裝微球凝膠之一膠體強度可為30Pa至3100Pa。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠，其中可注射型自組裝微球凝膠之一平均孔隙率可為35%至50%。

依據前述之可注射型自組裝微球凝膠，其中可注射型自組裝微球凝膠之一平均孔徑可為30μm至90μm。

藉此，本發明之可注射型自組裝微球凝膠包含具有相反電性之第一微凝膠與第二微凝膠，使其可因異電相吸的特性而進行自組裝，並可利用注射方法直接進行施用。再者，本發明之可注射型自組裝微球凝膠係使用丙烯酸或其衍生物以及具有高度生物相容性的基材作為原料，可避免原料的材質對細胞產生毒性，並可視實際需求而調整第一凝膠 微球與第二凝膠微球的粒徑，進而擴大本發明之可注射型自組裝微球凝膠的使用安全性及應用廣度。

本發明之又一態樣在於提供一種如前述之可注射型自組裝微球凝膠的用途，其係用以製備一促進組織修復之生醫材料。

本發明之再一態樣在於提供一種如前述之可注射型自組裝微球凝膠的用途，其係用以製備一促進神經細胞生長之醫藥組合物。

藉此，本發明之可注射型自組裝微球凝膠因具有高度生物相容性以及促進細胞生長的效果，使其可應用於促進細胞增生與組織修復之生醫材料，並有潛力進一步應用於促進神經細胞生長之醫藥組合物的製備，進而達成對人體提供一高效且安全的輔助治療的目標。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

100‧‧‧可注射型自組裝微球凝膠的製備方法

110、112、114、116、120、122、124、126、130‧‧‧步驟

200‧‧‧可注射型自組裝微球凝膠

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖係繪示本發明之一實施方式之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法的步驟流程圖；第2A圖係繪示本發明之可注射型自組裝微球凝膠的影 像；第2B圖係繪示第2A圖之可注射型自組裝微球凝膠的另一影像；第3圖係繪示本發明之可注射型自組裝微球凝膠的流變性質測試結果圖；第4A圖係繪示本發明之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時的一顯微鏡影像；第4B圖係繪示第4A圖之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時之平均孔隙率的分析結果圖；第5A圖係繪示本發明之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時的另一顯微鏡影像；第5B圖係繪示第5A圖之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時之平均孔徑的分析結果圖；第6圖係繪示以本發明之可注射型自組裝微球凝膠做為基質進行細胞培養後24小時的細胞存活率結果圖；第7圖係繪示以本發明之可注射型自組裝微球凝膠做為基質進行細胞培養不同時間後的染色結果圖；第8圖係繪示以本發明之可注射型自組裝微球凝膠做為基質進行細胞培養不同時間後的細胞增生結果圖；第9A圖係繪示本發明之實施例4的神經導管植入大鼠後肢7天後其再生坐骨神經於不同軸突區段之神經強度評估的結果圖；第9B圖係繪示本發明之實施例4的神經導管植入大鼠後肢7天後其再生坐骨神經的軸突遠端區段生長至神經導管 中的結果分析圖；第10A圖係繪示本發明之實施例4的神經導管植入大鼠後肢30天後的腳趾影像；第10B圖係繪示本發明之實施例4的神經導管在植入大鼠後肢30天與60天後的坐骨神經功能指數的分析結果圖；第11A圖係繪示本發明之實施例4的神經導管在植入大鼠後肢60天後之坐骨神經的神經傳導速度測試結果圖；以及第11B圖係繪示本發明之實施例4的神經導管在植入大鼠後肢60天後之坐骨神經的複合動作電位測試結果圖。

<可注射型自組裝微球凝膠的製備方法>

請參照第1圖，其係繪示本發明之一實施方式之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法100的步驟流程圖。可注射型自組裝微球凝膠的製備方法100包含步驟110、步驟120以及步驟130。

步驟110為進行第一凝膠微球製備步驟，第一凝膠微球製備步驟包含步驟112、步驟114以及步驟116。

步驟112為提供第一溶液，第一溶液係用以作為水相並包含一第一成分與一第二成分，其中第一成分包含丙烯酸或其衍生物，第二成分包含殼聚醣或蠶絲。其中，前述之丙烯酸或其衍生物可包含甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酐及 甲基丙烯酸縮水甘油酯等其他含有雙鍵之高分子材料的單體，以提供第一凝膠微球較佳的結構強度。

步驟114為提供第一油相溶液，具體地，第一油相溶液可包含一油性溶液以及一界面活性劑，其中界面活性劑可以為但不限於聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)、tween 20、tween 80或十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)，以進一步增進第一溶液中第一成分與第二成分的聚合反應效率。

步驟116為進行第一油包水型乳化反應，其係混合前述之第一溶液與前述之第一油相溶液，以形成複數個第一凝膠微球，且各第一凝膠微球皆為一微球體形狀。較佳地，前述之第一油包水型乳化反應可於微流體系統中進行，並可透過調整作為水相之第一溶液與第一油相溶液的流速以及微流體系統的通道尺寸，而使第一凝膠微球的平均粒徑介於30μm至500μm之間，並維持較低的分子量多分散性。

步驟120為進行第二凝膠微球製備步驟，第二凝膠微球製備步驟包含步驟122、步驟124以及步驟126。

步驟122為提供第二溶液，第二溶液係用以作為水相並包含一第三成分與一第四成分，其中第三成分包含丙烯酸或其衍生物，第四成分包含明膠、透明質酸或褐藻膠。

步驟124為提供第二油相溶液，具體地，第二油相溶液可包含一油性溶液以及一界面活性劑，其中界面活性劑可以為但不限於聚乙烯醇、tween 20、tween 80或十 二烷基硫酸鈉，以進一步增進第二溶液中第三成分與第四成分的聚合反應效率。

步驟126為進行第二油包水型乳化反應，其係混合前述之第二溶液與前述之第二油相溶液，以形成複數個第二凝膠微球，且各第二凝膠微球皆為一微球體形狀。較佳地，前述之第二油包水型乳化反應可於微流體系統中進行，並可透過調整作為水相溶液之第二溶液與第二油相溶液的比例、流速及微流體系統的通道尺寸，而使第二凝膠微球的平均粒徑介於30μm至500μm之間，並維持較低的分子量多分散性。

另外，前述之第一凝膠微球與第二凝膠微球皆可透過改質方法而調整其官能基(如氨基、羥基)的取代程度，以調整第一凝膠微球與第二凝膠微球的第一電荷與第二電荷的大小，並可利用光活化的自由基引發劑和UV光進行光交聯反應，以在其上連接細胞生長因子、細胞附著胜肽等生物分子，以增加第一凝膠微球與第二凝膠微球的應用廣度。

步驟130進行一共混步驟，其係混和前述之第一凝膠微球、前述之第二凝膠微球以及一水性溶液，以得本發明之可注射型自組裝微球凝膠。詳細而言，由於第一凝膠微球的第二成分與第二凝膠微球的第四成分係分別帶有不同的官能基團，是以經上述步驟110與步驟120製備而得之第一凝膠微球與第二凝膠微球係分別具有一第一電荷以及一第二電荷，第一電荷與第二電荷的電性相反，且本發明之 可注射型自組裝微球凝膠的第一凝膠微球的平均粒徑與第二凝膠微球的平均粒徑相等。詳細而言，依據前述方法所製得之可注射型自組裝微球凝膠可透過第一凝膠微球與第二凝膠微球之間的靜電吸引力而相互吸引並進行整齊的排列，以形成一可塑型的膠體，並可在膠體發生型態改變後再次透過第一凝膠微球與第二凝膠微球之間的靜電吸引力以及膠體的剪切稀化力進行重新調節與組裝，使其具有可注射的性質。

較佳地，本發明之可注射型自組裝微球凝膠中的第一凝膠微球與第二凝膠微球的一體積百分比可為1：0.5至1：6，而第一微凝膠與第二微凝膠的一體積百分比可為1：0.5至1：6，以使其具有不同的膠體強度，且本發明之可注射型自組裝微球凝膠之膠體強度可為30Pa至3100Pa，其平均孔隙率可為35%至50%，而可注射型自組裝微球凝膠之的平均孔徑則為30μm至90μm。

以下將進一步藉由實施例說明可注射型自組裝微球凝膠的製備方法100，並藉由複數個實施例與複數個比較例來評估本發明之可注射型自組裝微球凝膠的物理特性及其所能達成的功效，惟實施例所列之條件非用以限制本發明所欲保護之範疇，合先敘明。

<試驗例> 一、製備可注射型自組裝微球凝膠

本發明之一實施例的可注射型自組裝微球凝膠係由一第一微凝膠以及一第二微凝膠所組成，其中一第一微凝膠具有一第一電荷並包含複數個第一凝膠微球，第二微凝膠具有一第二電荷並包含複數個第二凝膠微球，且第一電荷與第二電荷的電性相反。而以下將分別對第一凝膠微球、第二凝膠微球以及共混第一凝膠微球與第二凝膠微球的製備細節進行說明。

1.製備第一凝膠微球

第一凝膠微球依據其第一成分與第二成分的不同可分為丙烯酸系殼聚醣聚合物及丙烯酸系蠶絲聚合物，而在本試驗例中，丙烯酸系殼聚醣聚合物可為甲基丙烯酸酯殼聚醣(methacrylate-modified chitosan，Chito-MA)，丙烯酸系蠶絲聚合物則可為甲基丙烯酸酯蠶絲(methacrylate-modified silk，Sil-MA)，而以下將分別說明不同材質之第一凝膠微球的製備方法。

(1)製備材質為甲基丙烯酸酯殼聚醣的第一凝膠微球

首先將1.5g的水溶性甲殼素加入50mL的PBS緩衝溶液中，並於60℃的條件下攪拌直至水溶性甲殼素完全溶解，接著量取適量的甲基丙稀酸酐(Methacrylic anhydride，MA)以0.5mL/min的速度滴加至前述之水溶性甲殼素溶液，並在50℃的恆溫槽中持續攪拌3小時使其完全反應。在反應3小時之後，進一步取50℃之200mL的PBS緩衝溶液進行稀釋，並持續攪拌直至終止反應，接著將 前述之溶液置入截留量(Medium cut-off，MCO)為12-14kDa之透析袋中以50℃的純水進行透析，並將透析後的溶液置於離心管中，以2500rpm的轉速離心15分鐘去除沉澱物，以得包含甲基丙烯酸酯聚殼醣高分子預聚物的第一溶液。前述的第一溶液將進一步加入一包含油性溶液與界面活性劑之第一油相溶液中，以製得材質為甲基丙烯酸酯殼聚醣的第一凝膠微球。

(2)製備材質為甲基丙烯酸酯蠶絲的第一凝膠微球

首先取20g的脫膠蠶絲纖維加入100mL之60℃、濃度9.3M的溴化鋰溶液中反應1小時，接著分別取2mL、4mL、6mL和10mL(濃度分別為141mM、282mM、424mM和705mM)的甲基丙烯酸縮水甘油酯溶液(Glycidyl methacrylate，GMA)加入脫膠蠶絲纖維溶液中，並於60℃、300rpm的條件下以反應3小時。在完成前述反應後，以Miracloth濾膜(Calbiochem，San Diego，USA)進行過濾，並使用截留量為12-14kDa之截止透析管以蒸餾水進行透析，以得包含甲基丙烯酸酯蠶絲高分子預聚物的第一溶液。前述的第一溶液將進一步加入一包含油性溶液與界面活性劑之第一油相溶液中，以製得材質為甲基丙烯酸酯蠶絲的第一凝膠微球。

而在本試驗中，第一油包水型乳化反應係於微流體系統中進行，並可透過調整第一溶液與第一油相溶液的比例、流速及微流體系統的通道尺寸，而使第一凝膠微球的 平均粒徑介於30μm至500μm之間，並維持較低的分子量多分散性。

2.製備第二凝膠微球

第二凝膠微球依據其第三成分與第四成分的不同可分為丙烯酸系明膠聚合物、丙烯酸系透明質酸聚合物以及丙烯酸系褐藻膠聚合物，而在本試驗例中，丙烯酸系明膠聚合物可為甲基丙烯酸酯明膠(methacrylate-modified gelatin，Gel-MA)，丙烯酸系透明質酸聚合物可為甲基丙烯酸酯透明質酸(methacrylate-modified hyaluronic acid，HA-MA)，丙烯酸系褐藻膠聚合物可為甲基丙烯酸酯褐藻膠(methacrylate-modified alginate，Algi-MA)，而以下將分別說明不同材質之第二凝膠微球的製備方法。

(1)製備材質為甲基丙烯酸酯明膠的第二凝膠微球

首先將5g的明膠加入50mL的PBS緩衝溶液中，並於60℃的條件下攪拌直至明膠完全溶解，接著量取適量的甲基丙稀酸酐以0.5mL/min的速度滴加至前述之明膠溶液中，並在50℃的恆溫槽中持續攪拌3小時。在反應3小時之後，進一步取50℃之200mL的PBS緩衝溶液進行稀釋，並持續攪拌直至終止反應，接著將前述之溶液置入截留量為12-14kDa之透析袋中以50℃的純水進行透析，並將透析後的溶液置於離心管中以2500rpm的轉速離心15分鐘去除沉澱物，以得包含甲基丙烯酸酯明膠高分子預聚物的 第二溶液。前述的第二溶液將進一步加入一包含油性溶液與界面活性劑之第二油相溶液中，以製得材質為甲基丙烯酸酯明膠的第二凝膠微球。

(2)製備材質為甲基丙烯酸酯透明質酸的第二凝膠微球

首先取0.5g的透明質酸加入50mL的蒸餾水中，並在室溫下持續攪拌至隔天。接著，將1mL之三乙胺(Triethylamine，TEA)溶液、1mL且純度大於92%之甲基丙烯酸縮水甘油酯溶液以及1g之四丁基溴化銨(Tetrabutylammonium bromide，TBAB)加入透明質酸水溶液中，並以55℃的條件下持續攪拌並反應1小時，待其冷卻後於丙酮中進行兩次萃取沉澱步驟，並將所得之沉澱物烘乾，而後將乾燥後之沉澱物回溶至蒸餾水中，並使用截留量為12-14kDa之截止透析管以蒸餾水進行透析，以得包含甲基丙烯酸酯透明質酸高分子預聚物的第二溶液。前述的第二溶液將進一步加入一包含油性溶液與界面活性劑之第二油相溶液中，以製得材質為甲基丙烯酸酯透明質酸的第二凝膠微球。

(3)製備材質為甲基丙烯酸酯褐藻膠的第二凝膠微球

首先取4.0g的藻酸鹽加入200mL的蒸餾水中，並攪拌直至藻酸鹽完全溶解，而後一次性地加入15mL、重量百分濃度為2.0%的甲基丙烯酸酐水溶液，並調整溶液的pH值為8後，於5℃的條件下孵育24小時。在經過24小時的反應後，將前述之溶液以乙醇進行純化並於室溫下真空乾燥3天，而烘乾後的乾燥物則回溶至蒸餾水中， 並使用截留量為12-14kDa之截止透析管以蒸餾水進行透析，以得包含甲基丙烯酸酯褐藻膠高分子預聚物的第二溶液。前述的第二溶液將進一步加入一包含油性溶液與界面活性劑之第二油相溶液中，以製得材質為甲基丙烯酸酯褐藻膠的第二凝膠微球。

而在本試驗中，第二油包水型乳化反應係於微流體系統中進行，並可透過調整第二溶液與第二油相溶液的比例、流速及微流體系統的通道尺寸，而使第二凝膠微球的平均粒徑介於30μm至500μm之間，並維持較低的分子量多分散性。

3.共混第一凝膠微球與第二凝膠微球

在完成第一凝膠微球與第二凝膠微球的製備後，第一凝膠微球將與第二凝膠微球以體積百分比為1：0.5至1：6的比例進行混和，並加入一水性溶液，且可注射型自組裝微球凝膠的第一凝膠微球的平均粒徑與第二凝膠微球的平均粒徑相等，以得本發明之可注射型自組裝微球凝膠。

請參照第2A圖與第2B圖，第2A圖係繪示本發明之可注射型自組裝微球凝膠200的影像，而第2B圖則係繪示第2A圖之可注射型自組裝微球凝膠200的另一影像。如第2A圖與第2B圖所示，可注射型自組裝微球凝膠200在外觀上呈現一可透過針具進行注射的膠體，並可於排出針具後在不施加外力的情形下即可進行自組裝而形成膠體的型態，並 可對其進行塑型而得特定的型態(例如第2B圖所示之形狀)，是以可注射型自組裝微球凝膠200可在注入的複雜形狀的空腔，例如骨骼間隙、組織間隙後進行自組裝，並可視需求而調整可注射型自組裝微球凝膠200的型態，使其兼具優良的使用便利性及廣泛的應用性。

具體地，在本試驗的各實施例中，第一凝膠微球為帶正電荷之甲基丙烯酸酯殼聚醣凝膠微球，而第二凝膠微球則為帶負電荷之甲基丙烯酸酯明膠凝膠微球，其中實施例1之第一凝膠微球與第二凝膠微球間的體積百分比為1：1，實施例2之第一凝膠微球與第二凝膠微球間的體積百分比為1：2，實施例3之第一凝膠微球與第二凝膠微球間的體積百分比則為1：5，而以下將就實施例1至實施例3之可注射型自組裝微球凝膠進行物理性質、生物相容性以及促進神經細胞生長的能力進行評估。

二、本發明之可注射型自組裝微球凝膠的物理性質評估 1.本發明之可注射型自組裝微球凝膠的膠體強度評估

本發明之可注射型自組裝微球凝膠的膠體強度是以前述之實施例1至實施例3的可注射型自組裝微球凝膠進行流變特性測試而評估。在試驗上係使用流變儀(AR 2000ex，TA Instruments)於25℃的條件下使用直徑為20mm之幾何扁平鋼板作為上板，並調整間隙距離為0.5mm、恆定應力為1Pa以及恆定頻率為1Hz後，以量測本發明之實施例1至實施例3的可注射型自組裝微球凝膠的儲能模量 (G’)以及損耗模量(G”)，其中的儲能模量又稱為彈性模量，其係指材料發生形變時彈性形變而儲存的能量大小，用以表示材料的彈性，而損耗模量又稱黏性模量，其係指材料發生形變時黏性形變而儲存的能量大小，用以表示材料的黏性，是以本試驗將以儲能模量與損耗模量的量測數值來說明本發明之可注射型自組裝微球凝膠的膠體強度。

另外，本試驗亦包含比較例1與比較例2，其中比較例1為一習知之帶正電荷的水凝膠，而比較例2則為一習知之帶負電荷的水凝膠，以進一步比較並說明本案之可注射型自組裝微球凝膠相較於比較例1與比較例2的膠體強度。

請參照第3圖，其係繪示本發明之可注射型自組裝微球凝膠的流變性質測試結果圖。如第3圖所示，實施例1至實施例3之可注射型自組裝微球凝膠的儲能模量與損耗模量均高，而比較例1與比較例2的儲能模量皆不達100Pa，其中實施例1的儲能模量為3100Pa，實施例3的儲能模量為350Pa，其分別為比較例2之儲能模量(Pa=20)的17.5倍與155倍，顯示本發明之可注射型自組裝微球凝膠具有良好的彈性與適當的黏性，並可依據不同的第一凝膠微球與第二凝膠微球的混和比例而使膠體強度為30Pa至3100Pa。

此外，值得注意的是，本發明之可注射型自組裝微球凝膠係透過帶正電荷之第一凝膠微球與帶負電荷之第二凝膠微球之電荷強度而具有可調節的黏聚度，可進一步 擴大細胞生長支架的剛度調整範圍，進而使本發明之可注射型自組裝微球凝膠的應用廣度再次提升。

2.本發明之可注射型自組裝微球凝膠的平均孔隙率與平均孔徑評估

本發明之可注射型自組裝微球凝膠的平均孔隙率與平均孔徑評估是以前述之實施例1的可注射型自組裝微球凝膠進行試驗，並調整實施例1之凝膠微球(包含第一凝膠微球與第二凝膠微球)的平均粒徑大小，以測試本發明之可注射型自組裝微球凝膠在其凝膠微球具有不同平均粒徑大小時的平均孔隙率與平均孔徑，其中實施例1之平均粒徑大小由小到大分別為115μm、125μm、156μm、175μm以及210μm。在試驗上首先以螢光染色的方式對本發明之可注射型自組裝微球凝膠進行染色後，利用共軛焦顯微鏡拍攝膠體的顯微螢光影像，並根據前述之顯微螢光影像進行影像分析，以計算本發明之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時的平均孔隙率及其平均孔徑。

請參照第4A圖與第4B圖，第4A圖係繪示本發明之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時的一顯微鏡影像，而第4B圖則係繪示第4A圖之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時之平均孔隙率的分析結果圖。詳細而言，第4A圖之顯微鏡影像由左至右分別代表凝膠微球的平均粒徑為125μm以及凝膠微球的平均粒徑為175μm時的顯微鏡影像。如第4A圖與第4B圖所示，本發 明之可注射型自組裝微球凝膠在結構上具有相互連接且排列整齊的孔隙，且當凝膠微球的平均粒徑為125μm與175μm時，皆具有50%以上的平均孔隙率，顯示本發明之可注射型自組裝微球凝膠具有優良的孔隙形成能力。

請參照第5A圖與第5B圖，第5A圖係繪示本發明之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時的另一顯微鏡影像，而第5B圖則係繪示第5A圖之可注射型自組裝微球凝膠於不同平均粒徑大小時之平均孔徑的分析結果圖。詳細而言，第5A圖之顯微鏡影像由左至右分別代表凝膠微球的平均粒徑為115μm、凝膠微球的平均粒徑為156μm以及凝膠微球的平均粒徑為210μm時的顯微鏡影像。如第5A圖與第5B圖所示，本發明之可注射型自組裝微球凝膠的第一凝膠微球與第二凝膠微球在平均粒徑相同的前提下係彼此緊密堆疊，且當凝膠微球的平均粒徑為115μm、156μm與210μm時，其平均孔徑分別為40.8μm、57.1μm以及85.5μm，顯示本發明之可注射型自組裝微球凝膠不僅具有優良的孔隙形成能力，亦可視需求而調整凝膠微球的粒徑以改變其孔徑大小，使其具有作為促進組織修復之生醫材料的潛能。

再者，本發明之可注射型自組裝微球凝膠係透過相同粒徑大小之第一凝膠微球與第二凝膠微球彼此堆疊，並透過彼此之間的靜電吸引力而相互吸引，進而形成將近100%互相連通之孔隙網路，可有效改善習知水凝膠所具有之氧氣與養分交換不足的缺點。

三、本發明之可注射型自組裝微球凝膠的生物相容性評估

本發明之可注射型自組裝微球凝膠的生物相容性評估係以人類脂肪幹細胞(hADSC)、許旺細胞(Schwann cell)以及纖維母細胞(Fibroblast)的細胞存活率以及其促進細胞增生的能力作為基準而進行評估。

1.本發明之可注射型自組裝微球凝膠的細胞存活率測試

本發明之可注射型自組裝微球凝膠的細胞存活率測試是以前述之實施例2的可注射型自組裝微球凝膠進行試驗。在實驗上先將實施例2的可注射型自組裝微球凝膠切割成厚度為2mm的凝膠薄片後，分別放入細胞培養盤的不同孔洞中，並將含有3×10⁶個人類脂肪幹細胞、許旺細胞或纖維母細胞的不同細胞培養液以不同角度分別注入不同孔洞中的凝膠薄片內，並在37℃、5% CO₂的條件下培養24小時。在培養24小時後，進一步於每孔加入100μL的MTT試劑，並於37℃的條件下孵育4小時後，以分光光度計測試波長570nm之吸光值，並換算為細胞存活率數據。

另外，在本實驗中亦包含前述之比較例1與比較例2，以進一步說明本案之可注射型自組裝微球凝膠的生物相容性。

請參照第6圖，其係繪示以本發明之可注射型自組裝微球凝膠做為基質進行細胞培養後24小時的細胞存活率結果圖。如第6圖所示，人類脂肪幹細胞、許旺細胞以及 纖維母細胞培養於實施例2的可注射型自組裝微球凝膠24小時後，其細胞存活率皆大於90%，其中又以人類脂肪幹細胞的細胞存活率為最佳，相較於比較例1與比較例2均有優異的細胞存活率表現，顯示本發明之可注射型自組裝微球凝膠具有優良的生物相容性，並可用以製備一促進組織修復之生醫材料。

2.本發明之可注射型自組裝微球凝膠的促進細胞增生的能力測試

本發明之可注射型自組裝微球凝膠促進細胞增生的能力測試是以前述之實施例2的可注射型自組裝微球凝膠以及一包含習用之無孔水凝膠的比較例3進行試驗。

在實驗上先將以實施例2的可注射型自組裝微球凝膠以及比較例3的無孔水凝膠培養不同時間的人類脂肪幹細胞、許旺細胞以及纖維母細胞以3.7%的甲醛處理15分鐘後，接著加入0.1%的Triton-X100並浸泡10分鐘，再分別加入稀釋倍率為1：300之經過螢光標記的鬼筆環肽(Phalloidin)反應1小時後，加入稀釋倍率為1：500的DAPI反應5分鐘，接著使用生理食鹽水潤洗，並以螢光顯微鏡進行觀察，其中實施例2的細胞培養時間分別為3小時、2天及6天，而比較例3的細胞培養時間則分別為培養3小時及4天。

請參照第7圖，其係繪示以本發明之可注射型自組裝微球凝膠做為基質進行細胞培養不同時間後的染色結果圖，其中藍色螢光的部分為細胞核，而綠色螢光的部分則 為細胞骨架。如第7圖所示，人類脂肪幹細胞、許旺細胞以及纖維母細胞在沒有額外添加貼附蛋白等其他生物活性因子的情況下，於培養3小時後即開始貼附於實施例2的可注射型自組裝微球凝膠的表面，並隨著培養時間的增加而增生。而在持續培養6天後，人類脂肪幹細胞、許旺細胞以及纖維母細胞皆可於實施例2的可注射型自組裝微球凝膠中形成緻密的生長，而反觀比較例3的無孔水凝膠，人類脂肪幹細胞、許旺細胞以及纖維母細胞在培養3小時後並無法有效貼附於無孔水凝膠的表面，且在持續培養6天後亦無法於其上進行有效的生長。

另外，在本試驗中亦將以本發明之可注射型自組裝微球凝膠培養不同時間後之人類脂肪幹細胞、許旺細胞以及纖維母細胞分別以流式細胞儀分析隨培養時間增生的細胞數目，以進一步評估本發明之可注射型自組裝微球凝膠的生物相容性。

請參照第8圖，其係繪示以本發明之可注射型自組裝微球凝膠做為基質進行細胞培養不同時間後的細胞增生結果圖。如第8圖所示，人類脂肪幹細胞、許旺細胞以及纖維母細胞在以實施例2的可注射型自組裝微球凝膠培養下於6天內皆具有穩定且持續增生的表現，其中又以許旺細胞以及纖維母細胞的增生情形最佳，其倍增時間(doubling time，DT)分別為2.5天以及1.5天。

綜合以上實驗結果，本發明之可注射型自組裝微球凝膠具有優異生物相容性以及優異的平均孔隙率，有利 於細胞貼附並於其中增生，進而使本發明之可注射型自組裝微球凝膠可用以製備一促進組織修復之生醫材料，並適用於組織工程或再生醫學等相關技術領域。

四、本發明之可注射型自組裝微球凝膠促進神經細胞修復的能力評估

本發明之可注射型自組裝微球凝膠促進神經細胞修復的能力是將實施例4之神經導管植入大鼠後肢坐骨神經受損之區域(亦即，利用實施例4之神經導管連接坐骨神經損傷的間隙)，並在植入7天、30天與60天對再生坐骨神經軸突區段之坐骨神經強度與功能進行評估，以評估包含本發明之可注射型自組裝微球凝膠的神經導管助於神經細胞修復的能力，其中實施例4之神經導管係將神經生長因子(Nerve Growth Factor，NGF)封裝於本發明之可注射型自組裝微球凝膠的第一凝膠微球與第二凝膠微球中，並形成具有神經生長因子濃度梯度的神經導管，以進行後續的實驗。

另外，在本試驗中更使用一包含習用之神經導管的比較例4進行實驗，以進一步說明本發明之可注射型自組裝微球凝膠促進神經細胞修復的能力。

1.再生坐骨神經之神經纖維強度與生長狀況評估

在本試驗中係以再生坐骨神經之神經纖維強度與生長狀況評估包含本發明之可注射型自組裝微球凝膠的 神經導管助於神經細胞修復的能力。在本試驗中進一步將再生坐骨神經依其距離大鼠軀幹的遠近而分為軸突殘端(即坐骨神經截斷處)、軸突近端、軸突中間和軸突遠端四個區段，是以本試驗將以不同之再生坐骨神經軸突區段的生長情形進行神經纖維強度與生長狀況的評估。

請參照第9A圖，其係繪示本發明之實施例4的神經導管植入大鼠後肢7天後其再生坐骨神經於不同軸突區段之神經強度評估的結果圖。如第9A圖所示，在實施例4之神經導管植入7天後，再生坐骨神經的神經纖維強度係由坐骨神經的軸突殘端區段漸進地向軸突遠端區段遞減，顯示坐骨神經可於實施例4之神經導管中穩定地生長，且實施例4之神經導管中的再生坐骨神經在各軸突區段的神經纖維強度皆顯著優於比較例4的神經導管的纖維強度。

再請參照第9B圖，其係繪示本發明之實施例4的神經導管植入大鼠後肢7天後其再生坐骨神經的軸突遠端區段生長至神經導管中的結果分析圖。如第9B圖所示，實施例4之神經導管在植入大鼠後肢坐骨神經受損區域7天後，再生坐骨神經的軸突遠端區段於神經導管中的比例相較於比較例4具有顯著的增加，顯示實施例4之神經導管相較於比較例4更有利於坐骨神經的再生。

2.再生坐骨神經之神經功能、神經傳導速度與複合動作電位分析

再生坐骨神經之神經功能分析試驗係分析實施例4之神經導管植入大鼠後肢坐骨神經受損區域後其再生坐骨神經之坐骨神經功能指數(sciatic nerve function index，SFI)，以評估包含本發明之可注射型自組裝微球凝膠的神經導管對於神經細胞修復的能力。另外，在本試驗中另包含利用自體神經進行移植之對照組1，以進一步說明包含本發明之可注射型自組裝微球凝膠的神經導管助於神經細胞修復的能力。

請參照第10A圖與第10B圖，第10A圖係繪示本發明之實施例4的神經導管植入大鼠後肢30天後的腳趾影像，而第10B圖則係繪示本發明之實施例4的神經導管在植入大鼠後肢30天與60天後的坐骨神經功能指數的分析結果圖。如第10A圖所示，實施例4之神經導管與比較例4之神經導管係分別植入大鼠之受傷的左後爪(即圖片中靠近右側之後肢腳爪)，其中實施例4的神經導管在植入大鼠後肢30天後，大鼠的受損後爪相較於植入比較例4之神經導管的受損後爪具有較大的腳趾展開程度，而如第10B圖所示，在植入實施例4之神經導管30天與60天後，其坐骨神經功能指數與對照組1的坐骨神經功能指數相仿，並顯著優於比較例4的坐骨神經功能指數，顯示包含本發明之可注射型自組裝微球凝膠的神經導管對於受損之坐骨神經的修復具有優良的效果。

而在再生的坐骨神經之神經傳導速度與複合動作電位分析方面係分析實施例4之神經導管植入大鼠後肢 後，其再生坐骨神經之神經傳導速度與動作電位，以評估包含本發明之可注射型自組裝微球凝膠的神經導管助於神經細胞修復的能力。另外，在本試驗中另包含前述之對照組1，以及包含坐骨神經未受損之大鼠的對照組2，以進一步說明包含本發明之可注射型自組裝微球凝膠的神經導管助於神經細胞修復的能力。

請參照第11A圖與第11B圖，第11A圖係繪示本發明之實施例4的神經導管在植入大鼠後肢60天後之坐骨神經的神經傳導速度測試結果圖，第11B圖係繪示本發明之實施例4的神經導管在植入大鼠後肢60天後之坐骨神經的複合動作電位測試結果圖。如第11A圖所示，實施例4的神經導管在植入大鼠後肢60天後，其坐骨神經的神經傳導速度顯著優於比較例4與對照組1的神經傳導速度，並與對照組2之神經傳導速度相近。而如第11B圖所示，實施例4的神經導管在植入大鼠後肢60天後，其坐骨神經的複合動作電位顯著大於比較例4之複合動作電位。

由上述的結果可知，包含本發明之可注射型自組裝微球凝膠的神經導管將有助於神經細胞進行修復，使本發明之可注射型自組裝微球凝膠有潛力可用以製備一促進神經細胞生長之醫藥組合物。

綜上所述，本發明之可注射型自組裝微球凝膠以及可注射型自組裝微球凝膠的製備方法透過具有相反電性之第一凝膠微球與第二凝膠微球進行共混的方式，使所得之可注射型自組裝微球凝膠可利用注射的方式直接進行施 用，並具有優良的自組裝能力。且本發明之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法使用丙烯酸或其衍生物以及具有高度生物相容性的基材作為第一凝膠微球與第二凝膠微球的原料，不僅可避免原料的材質對細胞產生毒性，更可有效的進行量產，進而增加本發明之可注射型自組裝微球凝膠的方法所製得之可注射型自組裝微球凝膠的使用安全性與應用廣度。再者，本發明之可注射型自組裝微球凝膠因具有高度的生物相容性以及促進細胞生長的效果，使其可應用於促進細胞增生與組織修復之生醫材料，並有潛力進一步應用於促進神經細胞生長之醫藥組合物的製備，進而達成對人體提供一高效且安全的輔助治療的目標。

200‧‧‧可注射型自組裝微球凝膠

Claims (16)

1. 一種可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，包含下述步驟：進行一第一凝膠微球製備步驟，包含下述步驟：提供一第一溶液，該第一溶液用以作為水相並包含一第一成分與一第二成分，其中該第一成分包含丙烯酸或其衍生物，該第二成分包含殼聚醣或蠶絲；提供一第一油相溶液；進行一第一油包水型乳化反應，其係混合該第一溶液與該第一油相溶液，以形成複數個第一凝膠微球；進行一第二凝膠微球製備步驟，包含下述步驟：提供一第二溶液，該第二溶液用以作為水相並包含一第三成分與一第四成分，其中該第三成分包含丙烯酸或其衍生物，第四成分包含明膠、透明質酸或褐藻膠；提供一第二油相溶液；進行一第二油包水型乳化反應，其係混合該第二溶液與該第二油相溶液，以形成複數個第二凝膠微球；以及進行一共混步驟，其係混和該些第一凝膠微球、該些第二凝膠微球以及一水性溶液，以得該可注射型自組裝微球凝膠； 其中，各該第一凝膠微球具有一第一電荷、各該第二凝膠微球具有一第二電荷，且該第一電荷與該第二電荷的電性相反。
2. 如申請專利範圍第1項所述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中該丙烯酸或其衍生物包含甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酐及甲基丙烯酸縮水甘油酯。
3. 如申請專利範圍第1項所述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中該些第一凝膠微球的平均粒徑為30μm至500μm，該些第二凝膠微球的平均粒徑為30μm至500μm。
4. 如申請專利範圍第1項所述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中該可注射型自組裝微球凝膠中的該些第一凝膠微球與該些第二凝膠微球的一體積百分比係1：0.5至1：6。
5. 如申請專利範圍第1項所述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其係於一微流道系統中進行。
6. 如申請專利範圍第1項所述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中該可注射型自組裝微球凝膠之一膠體強度為30Pa至3100Pa。
7. 如申請專利範圍第1項所述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中該可注射型自組裝微球凝膠之一平均孔隙率為35%至50%。
8. 如申請專利範圍第1項所述之可注射型自組裝微球凝膠的製備方法，其中該可注射型自組裝微球凝膠之一平均孔徑為30μm至90μm。
9. 一種可注射型自組裝微球凝膠，包含：一第一微凝膠，具有一第一電荷，其中該第一微凝膠包含複數個第一凝膠微球，且該些第一凝膠微球的平均粒徑為30μm至500μm；以及一第二微凝膠，具有一第二電荷，其中該第二微凝膠包含複數個第二凝膠微球，且該些第二凝膠微球的平均粒徑為30μm至500μm；其中，該第一電荷與該第二電荷的電性相反，該可注射型自組裝微球凝膠的該些第一凝膠微球的該平均粒徑與該些第二凝膠微球的該平均粒徑相等，且各該第一凝膠微 球包含丙烯酸系殼聚醣聚合物、丙烯酸系蠶絲聚合物、或其組合，各該第二凝膠微球包含丙烯酸系明膠聚合物、丙烯酸系透明質酸聚合物、丙烯酸系褐藻膠聚合物、或其組合。
10. 如申請專利範圍第9項所述之可注射型自組裝微球凝膠，其中各該第一凝膠微球包含甲基丙烯酸酯殼聚醣、甲基丙烯酸酯蠶絲、或其組合，各該第二凝膠微球包含甲基丙烯酸酯明膠、甲基丙烯酸酯透明質酸、甲基丙烯酸酯褐藻膠、或其組合。
11. 如申請專利範圍第9項所述之可注射型自組裝微球凝膠，其中該第一微凝膠與該第二微凝膠的一體積百分比係1：0.5至1：6。
12. 如申請專利範圍第9項所述之可注射型自組裝微球凝膠，其中該可注射型自組裝微球凝膠之一膠體強度為30Pa至3100Pa。
13. 如申請專利範圍第9項所述之可注射型自組裝微球凝膠，其中該可注射型自組裝微球凝膠之一平均孔隙率為35%至50%。
14. 如申請專利範圍第9項所述之可注射型自組裝微球凝膠，其中該可注射型自組裝微球凝膠之一平均孔徑為30μm至90μm。
15. 一種如申請專利範圍第9項所述之可注射型自組裝微球凝膠的用途，其係用以製備一促進組織修復之生醫材料。
16. 一種如申請專利範圍第9項所述之可注射型自組裝微球凝膠的用途，其係用以製備一促進神經細胞生長之醫藥組合物。

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