CN115521627A - 一种结构蛋白/透明质酸复合微纳米颗粒及颗粒水凝胶材料和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于材料科学、生物医用材料领域，具体是一种结构蛋白/透明质酸复合微纳米颗粒及颗粒水凝胶材料和应用。水凝胶材料由复合微球颗粒为基本结构单元，通过复合微球颗粒间的静电作用、氢键作用、疏水作用可逆自组装形成连续、多孔颗粒网络，实现可注射、可打印、自修复性能；当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，再进一步通过引发共价键交联形成非共价键和共价键双重交联的颗粒水凝胶。本发明成功制得了结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒，其组装形成的水凝胶材料可广泛应用于医用支架、皮下填充、生物打印墨水等医学领域。

Description

一种结构蛋白/透明质酸复合微纳米颗粒及颗粒水凝胶材料 和应用

技术领域

本发明属于材料科学领域、生物医用材料领域，具体是一种结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒的制备方法及制得的可注射、可打印、自修复水凝胶材料和应用。

背景技术

随着中国社会老龄化问题日趋严峻、因意外事故导致的组织损伤和器官衰竭与临床上供体器官短缺之间的矛盾日益加剧，组织工程技术被认为是这一问题的最有潜力的解决方案。自20世纪80年代“组织工程”概念被提出以来，组织工程技术飞速发展，研究者们已利用该技术成功实现了工程化皮肤、膀胱和软骨等较为简单结构的体外重构。然而，采用传统的“自上而下(top-down)”组织工程方法构建大尺寸复杂组织/器官仍存在瓶颈，例如缺乏血管形成、生物材料微观结构难以控制、生物活性成分分布不均匀、无组织特异性细胞密度等问题，这严重制约了组织工程的发展。随着微纳生物制造技术和生物材料(如微、纳尺度水凝胶)的发展，一种新的“自下而上(bottom-up)”的组织工程技术应运而生。正如肝小叶之于肝、肾单位之于肾，很多人体组织/器官都由大量重复的功能单元构成。有鉴于此，“自下而上”组织工程方法通过重复性功能单元模拟结构(即模块单元，如纳米颗粒胶体凝胶、载细胞微凝胶)的可控制备和组装，构建具有特定微结构的三维功能化组织，在大尺寸复杂组织/器官(如心脏、肝)构建方面显示了极大的发展潜力和应用前景。

水凝胶被认为是最适宜作为仿生细胞微环境的组织工程支架材料，典型水凝胶由亲水性高分子组成，与天然ECM相似富含水，允许生物大分子通过多孔凝胶网络扩散传播，然而，传统水凝胶大多以“自上而下”(Top-down)的策略进行设计，所得材料结构简单、组成单一、功能有限，难以在微观尺度上实现对具有复杂结构、多组分、多功能的人体器官的修复；且传统水凝胶大多由永久共价键或长期稳定的强物理键构成，力学特征以弹性为主，并非理想的仿生细胞微环境材料；并且以传统水凝胶为组织工程支架的材料体系不具备可注射、可打印的性能，且不具备和周围组织形成良好粘附或整合的效果。

相对于以“自上而下”(Top-down)的策略进行设计的传统水凝胶，近年来基于“自下而上(bottom-up)”策略进行设计的颗粒水凝胶近年来作为组织工程支架得到了广泛应用。颗粒水凝胶由微、纳米胶体颗粒作为最小构筑单元，形成具有精细微观结构和稳定宏观结构的材料。与传统水凝胶由连续高分子网络构成不同，胶体凝胶是由不连续的颗粒组成的，通过自下而上的组装策略，控制基本结构单元之间的相互作用如：磁力、疏水相互作用、静电力、空间位阻等诱导其自组装形成的支架。由于物理“交联”的胶体颗粒间作用的可逆性，胶体凝胶表现出剪切变稀、自修复和组织表面的自适应性。同时，颗粒的合成步骤简单、混合时不易发生相分离以及在生理环境展现了稳定的机械性能。因此，颗粒水凝胶是作为组织工程支架材料应用于生物组织修复和再生的理想选择。

颗粒水凝胶作为组织工程支架材料应用于生物组织修复和再生应满足的条件是：需要具有类似细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的物理性质和化学组成，为细胞提供适合其生长和行使功能的微环境，为细胞提供包括力学强度、微观拓扑结构、与周围组织可整合等物理性能，同时提供细胞粘附位点、化学组成、生长因子表达、生物降解性等化学信号，准确操控细胞聚集、繁殖、更新和分化等行为，并最终实现诱导组织再生。

近年来，基于结构蛋白/透明质酸复合微米颗粒的微凝胶已被应用于例如声带损伤修复、软骨修复再生等组织修复领域，显示出优异的组织修复能力。但由微米颗粒组成的胶体材料体系普遍存在以下问题：

1)现有的制备复合微球的技术主要是基于乳液法，需要将不共混的两相(如水和油)通过施加高能量的剪切力分散成乳液，再进一步交联，有时为了使聚合物可以交联，需要分别在两种聚合物分子链上接枝正交反应基团，制备时涉及到表面活性剂的使用，还需额外的清洗步骤，增加了成本，且表面活性剂难以完全洗脱，影响进一步应用。

2)基于乳液技术制备颗粒的技术大多用于制备微米级尺寸的颗粒，而以此方法制备纳米颗粒需要更高的能量破碎液滴(比如超高速搅拌或超声波搅拌)和更稳定表面活性剂来降低界面能，从而形成纳米级液滴的乳液。高能量的破碎技术存在破坏该分子材料链段的可能，并且无法用于药物或生物活性因子的包埋。

3)微米颗粒凝胶注射性差，比表面积较纳米颗粒更低，因此形成的胶体网络颗粒间的交联点更少，因此以微米颗粒为基本单元的可注射材料难以保持结构的完整性，颗粒间缺少足够的相互吸引力，因此通过注射过程中的剪切力作用后难以保持结构的完整性，且无法实现力学强度的恢复。

鉴于微米颗粒的上述局限，制备基于结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒及组装成高比表面积、高强度的胶体凝胶是实现颗粒凝胶用作组织再生修复支架的关键。然而到目前为止，尚没有结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒相关发明和研究报道，原因在于结构蛋白类大分子和多糖类大分子在物理化学性质等方面具有明显差异，例如，即使在相同的温度及溶剂条件下，蛋白和多糖由于各自内部亲疏水基团以及静电相互作用等的不同而表现出不同的溶解特性，进一步地，若当蛋白和多糖引入同一溶解体系，两种大分子在各自分子链上不同片段和侧链间共价键、静电作用力、氢键、范德华力、疏水作用、离子键、容积排阻作用及分子链蜷曲等作用力共同作用下表现出多种溶解行为：1)两种大分子在强吸引相互作用下发生缔合，形成难溶性复合凝聚物，从体系中一起絮凝析出(如蛋白和阴离子型多糖在PH低于蛋白质等电点条件下会由于静电吸引而从共混水溶液中析出)；2)两种大分子由于弱吸引或弱排斥相互作用发生缔合，在体系中形成亚稳态微溶性复合物，在体系中可观测到两相：其中一相是溶剂，另一相是较高浓度的两种大分子；3)蛋白质和多糖相互作用类似于相同大分子间相互作用，则两相发生实质混合，即使两种大分子浓度较高，体系仍保持均匀稳定状态(如蛋白和阴离子型多糖在PH高于蛋白质等电点条件下的均匀混合)。事实上，在纳米颗粒合成过程中，微观尺度下的表面/界面效应等的存在使得蛋白/多糖两相之间保持既不强烈排斥、也不强烈吸引的热力学平衡状态变得更为困难，并且现有合成纳米颗粒的技术(去溶剂法、凝聚相分离法、反相微乳法、纳米沉淀法)通常需要在两相溶解体系中引入极性/非极性有机试剂、表面活性剂、电解质及交联剂等额外组分，带来新的影响纳米域内大分子平衡稳定的因素，这使得在纳米尺度下实现蛋白/多糖两相均匀、稳定的复合变得极为困难，这也使得制造这种仿生物体组成的结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒成为一道棘手的难题。

发明内容

为了兼顾材料的成分更接近于人体组织和材料的剪切变稀、自修复性能，本发明提供了一种基于结构蛋白-透明质酸微、纳米复合颗粒组装而成的可注射胶体凝胶材料及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种复合蛋白微纳米颗粒，所述复合蛋白颗粒由结构蛋白和透明质酸复合而成，或由改性结构蛋白和透明质酸复合而成，或由结构蛋白和改性透明质酸复合而成，或由改性结构蛋白和改性透明质酸复合而成；复合蛋白颗粒的尺寸范围是20nm～5μm；表面电荷为-70～20mv；复合颗粒中结构蛋白和透明质酸两相的质量之比为0.2～4；

优选地，所述结构蛋白包括纯结构蛋白及其衍生物，纯结构蛋白包括胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、角蛋白、蚕丝蛋白、蛛丝蛋白、角蛋白、蛋白聚糖、蛋白多肽；所述结构蛋白衍生物为功能化基团对结构蛋白进行修饰，所述功能化基团包括烷基、氨基、羧基、磺酸基、氰基化、嗪基、环氧基、叠氮基、巯基、咪唑基、四唑基、邻硝基苄基、环糊精基、二茂铁基、偶氮苯基、金刚烷基、螺吡喃基、嘧啶基、硼酯基、多巴胺、儿茶酚、没食子酸、单宁酸、酪胺、呋喃基、马来酰亚胺基、嘧啶碱基、嘌呤碱基；生物素、结合素；促旋酶、香豆霉素，荧光基团，染料基团；所述结构蛋白或多肽的分子量范围为1～500kDa；

所述透明质酸为纯透明质酸及其衍生物，所述透明质酸衍生物为功能化基团对纯透明质酸进行修饰，功能化基团包括：烷基、酰基、氨基、醛基、磺酸基、氰基、嗪基、酰肼基、环氧基、叠氮基、巯基、咪唑基、四唑基、邻硝基苄基、环糊精基、二茂铁基、偶氮苯基、金刚烷基、螺吡喃基、嘧啶基、硼酯基、多巴胺、儿茶酚、没食子酸、单宁酸、酪胺、呋喃基、马来酰亚胺基、嘧啶碱基、嘌呤碱基、生物素、结合素；促旋酶、香豆霉素，荧光基团，染料基团；

优选地，所述改性结构蛋白为可共价交联的改性结构蛋白，由化合物与结构蛋白分子中的羟基和氨基发生反应得到，所述改性透明质酸为可共价交联的改性透明质酸，由化合物与透明质酸分子链羟基发生反应得到，所述化合物为丙烯酸酐、丙烯酰氯、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、乙基丙烯酸酐、乙基丙烯酰氯、羟基丙烯酸酐、羟基丙烯酰氯、异冰片基丙烯酸酐、异冰片基丙烯酰氯、烯丙基异氰酸酐、烯丙基异氰酰氯中的一种或几种。

上述技术方案中，进一步地，本发明提供了前述复合蛋白微纳米颗粒的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)当结构蛋白和透明质酸未改性时，

将结构蛋白和透明质酸直接溶解在20～80℃的水性溶液中，其中结构蛋白的浓度为0.1～20w/v％，透明质酸的浓度为0.1～20w/v％，结构蛋白与透明质酸的混合质量比为0.1～10，完全溶解后，用酸或碱将溶液pH调至6～14，得到结构蛋白/透明质酸混合水溶液；

当结构蛋白和透明质酸改性时，

将可共价交联的改性结构蛋白和透明质酸，或结构蛋白和可共价交联的改性透明质酸，或可共价交联的改性结构蛋白和可共价交联的改性透明质酸溶解在水性溶液中，其中结构蛋白的浓度为0.1～20w/v％，透明质酸的浓度为0.1～20w/v％，结构蛋白与透明质酸的混合质量比为0.1～10，完全溶解后，将溶液温度调整并保持在20～80℃，用酸或碱将溶液pH调至6～14，得到结构蛋白/透明质酸混合水溶液；优选地，可共价交联的改性结构蛋白的制备为将结构蛋白在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为0.1～10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入与结构蛋白分子链羟基和氨基发生反应的化合物，得到可共价交联的结构蛋白化合物；可共价交联的改性透明质酸的制备为将透明质酸在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为0.1～10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入与透明质酸分子链羟基发生反应的化合物，得到可共价交联的结构蛋白化合物；

(2)将上述溶液温度维持在20～80℃、搅拌速度为100～1000rpm，将极性有机溶剂滴加至上述结构蛋白/透明质酸水溶液中，得到结构蛋白/透明质酸复合颗粒的悬浊液，之后继续搅拌1～3h；优选地，所述极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的组合，更优选地，加入极性有机溶剂的体积是结构蛋白/透明质酸混合水溶液体积的1～10倍。

(3)向悬浊液中加入结构蛋白/透明质酸大分子的交联剂，继续反应1～12h；反复离心、清洗得到结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒分散液，并将上述复合颗粒分散液冷冻干燥得到复合颗粒粉末。

本发明第二方面提供一种复合蛋白水凝胶材料，所述水凝胶材料由前述复合微球颗粒为基本结构单元，通过复合微球颗粒间的静电作用、氢键作用、疏水作用可逆自组装形成连续、多孔颗粒网络，实现可注射、可打印、自修复性能；其中复合颗粒的尺寸范围是20nm～5μm；表面电荷为-70～20mv；复合颗粒中结构蛋白和透明质酸两相的质量之比为0.2～4；所述颗粒组装的水凝胶材料中颗粒占水凝胶总体积的体积分数为10～120v/v％，质量分数为5～70％；所得颗粒水凝胶的压缩弹性模量为0.1kPa～100kPa；

当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，再进一步通过引发共价键交联形成非共价键和共价键双重交联的颗粒水凝胶。

上述技术方案中，进一步地，以前述制备的结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒分散液进行离心，得到浓缩物，即得具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料；或将前述制备的复合颗粒粉末与水性溶液均匀共混，得到具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料；

当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，将具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料进一步加入化学引发剂或光交联剂引发自由基聚合，使改性复合颗粒之间发生共价交联进一步得到力学增强的、非共价键和共价键共同交联的复合颗粒组装形成水凝胶材料；

优选地，所述水性溶液为含有生物活性物质的溶液，生物活性物质为维生素，氨基酸，矿物元素，微生态调节剂，生长因子或血液；

优选地，结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒分散液及水性溶液中可直接添加其他无机/有机纳米颗粒，纳米颗粒包括：二氧化硅纳米颗粒、硅酸镁锂纳米颗粒、纳米黏土颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、氧化铁磁性纳米颗粒、钛酸钡纳米颗粒、石墨烯纳米片、碳纳米管、生物玻璃纳米颗粒、黑磷纳米片、聚乳酸纳米颗粒、聚乙烯纳米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒中的一种或几种；纳米颗粒的尺寸为10nm-5μm。

本发明第三方面提供了一种核壳结构复合蛋白微纳米颗粒，以纳米颗粒作为核，以权利要求1所述的复合蛋白微球颗粒为壳；复合颗粒的尺寸范围是20nm～5μm；表面电荷为-70～20mv；复合颗粒中结构蛋白和透明质酸两相的质量之比为0.2～4；优选地，所述成核纳米颗粒选自二氧化硅纳米颗粒、硅酸镁锂纳米颗粒、纳米黏土颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、氧化铁磁性纳米颗粒、钛酸钡纳米颗粒、石墨烯纳米片、碳纳米管、生物玻璃纳米颗粒、黑磷纳米片、丝素蛋白纳米颗粒、聚乳酸纳米颗粒、聚乙烯纳米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒中的一种或几种；成核纳米颗粒的尺寸为10nm～1μm。

上述技术方案中，进一步地，所述核壳结构复合蛋白微纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

(1)当结构蛋白和透明质酸未改性时，

将结构蛋白和透明质酸溶解在20～80℃的水性溶液中其中，结构蛋白的浓度为0.1～20w/v％，透明质酸的浓度为0.1～20w/v％，结构蛋白与透明质酸的混合质量比为0.1～10，完全溶解后，用酸或碱将溶液pH调至6～14，之后加入成核纳米颗粒悬浮液，得到结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒混合水溶液，其中成核纳米颗粒的浓度为0.1～50w/v％；

当结构蛋白和透明质酸改性时，

将可共价交联的改性结构蛋白和透明质酸，或结构蛋白和可共价交联的改性透明质酸，或可共价交联的改性结构蛋白和可共价交联的改性透明质酸溶解在水性溶液中，其中结构蛋白的浓度为0.1～20w/v％，透明质酸的浓度为0.1～20w/v％，结构蛋白与透明质酸的混合质量比为0.1～10，完全溶解后，将溶液温度调整并保持在20～80℃，用酸或碱将溶液pH调至6～14，之后加入成核纳米颗粒悬浮液，得到结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒混合水溶液，其中成核纳米颗粒的浓度为0.1～50w/v％；优选地，可共价交联的改结构蛋白的制备为将结构蛋白在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为0.1～10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入与结构蛋白分子链羟基和氨基发生反应的化合物，得到可共价交联的结构蛋白化合物；可共价交联的改透明质酸的制备为将透明质酸在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为0.1～10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入与透明质酸分子链羟基发生反应的化合物，得到可共价交联的结构蛋白化合物；

(2)将极性有机溶剂滴加到步骤(1)得到的结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒混合水溶液中，得到结构蛋白/透明质酸复合材料微、纳米颗粒的悬浊液，之后稳定1～3h；优选地，所述极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的组合，更优选地，加入极性有机溶剂的体积是结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒混合水溶液体积的1～10倍；

(3)保持温度在20～80℃、搅拌速度为100～1000rpm，向悬浊液中加入结构蛋白/透明质酸大分子的交联剂，继续反应1～12h；反复离心、清洗得到结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒复合微、纳米颗粒分散液，并将上述复合颗粒分散液冷冻干燥得到复合颗粒粉末。

本发明第四方面提供了一种核壳结构复合蛋白水凝胶材料，所述水凝胶材料由前述复合微球颗粒为基本结构单元，通过复合微球颗粒间的静电作用、氢键作用、疏水作用可逆自组装形成连续、多孔颗粒网络，实现可注射、可打印、自修复性能；复合颗粒的尺寸范围是20nm～5μm；表面电荷为-70～20mv；复合颗粒中结构蛋白和透明质酸两相的质量之比为0.2～4；所述颗粒组装的水凝胶材料中颗粒占水凝胶总体积的体积分数为10～120v/v％，质量分数为5～70％；所得颗粒水凝胶的压缩弹性模量为0.1kPa～100kPa；

当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，再进一步通过引发共价键交联形成非共价键和共价键双重交联的颗粒水凝胶。

上述技术方案中，进一步地，以前述制备的结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒复合微、纳米颗粒分散液进行离心，得到浓缩物，即得具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料；或将前述制备的复合颗粒粉末与水性溶液均匀共混，得到具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料；

当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，将具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料进一步加入化学引发剂或光交联剂引发自由基聚合，使改性复合颗粒之间发生共价交联进一步得到力学增强的、非共价键和共价键共同交联的复合颗粒组装形成水凝胶材料；

优选地，所述水性溶液为含有生物活性物质的溶液，生物活性物质为维生素，氨基酸，矿物元素，微生态调节剂，生长因子或血液；

优选地，结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒复合微、纳米颗粒分散液及水性溶液中可直接添加其他无机/有机纳米颗粒，纳米颗粒包括：二氧化硅纳米颗粒、硅酸镁锂纳米颗粒、纳米黏土颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、氧化铁磁性纳米颗粒、钛酸钡纳米颗粒、石墨烯纳米片、碳纳米管、生物玻璃纳米颗粒、黑磷纳米片、聚乳酸纳米颗粒、聚乙烯纳米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒中的一种或几种；纳米颗粒的尺寸为10nm-5μm。

上述技术方案中，进一步地，前述步骤(3)中所述的结构蛋白/透明质酸大分子的交联剂为碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、甲醛、乙醛、甘油醛、芳草醛、戊二醛、丁二醛、京尼平、二缩水甘油醚、二环氧烷、二乙烯基砜类、多官能氮丙啶、二异氰酸酯中的一种或几种；优选地，所述交联剂的添加量与被交联基团的含量相关，具体添加量如下所示，其中R₁、R₂和R₃分别表示结构蛋白主链上的游离羧基、羟基和伯胺基，R′₁和R′₂分别表示透明质酸主链上的游离羧基和羟基；

当被交联基团为R₃/R′₁时，交联剂为碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，交联剂与R′₁物质的量之比为：0.05～20；与R₃物质的量之比为：0.01～5；

当被交联基团为R₂/R′₂或R₃/R′₂时，交联剂为甲醛、乙醛、甘油醛、芳草醛、戊二醛、丁二醛、京尼平、二缩水甘油醚、二环氧烷、二乙烯基砜类、二异氰酸酯，交联剂与R′₂物质的量之比为：0.05～20；与R₂物质的量之比为：0.01～7；与R₃物质的量之比为：0.01～5；

当被交联基团为R₁/R′₁时，交联剂为多官能氮丙啶，交联剂与R′₁物质的量之比为：0.05～20；与R₁物质的量之比为：0.01～5。

本发明第五方面提供了前述水凝胶以下几方面应用：

在制备含有药物成分的载体或支架中的应用，应用于骨组织、软骨组织、肌肉、血管的创伤或缺损的修复填充；所述药物成分为维生素、氨基酸、矿物元素、微生态调节剂、生长因子、小分子药物、蛋白大分子药物、核酸类药物(如mRNA)、抗生素类药物、激素类药物、麻醉剂类药物、抗病毒药物，抗菌药物，抗癌药物、免疫调节药物或活细胞的一种或多种组合；

或在制备浅层皮肤及皮下填充物的应用；优选在整形美容手术中；应用时，将结构蛋白/透明质酸胶体颗粒与水性溶液共混得到胶体凝胶，通过注射器针头将上述凝胶直接注射至浅层皮肤或皮下区域，结构蛋白/透明质酸复合颗粒在非共价键作用下可逆自组装形成连续多孔颗粒网络，在注射部位稳定停留，作为减少皮肤褶皱或塑形的填充材料；

或在制备载细胞打印的生物打印墨水的应用，应用时，将胶体颗粒与水性溶液共混得到胶体凝胶，再与细胞悬浮液混合得到载细胞胶体凝胶，将上述墨水通过挤出或喷墨3D打印方式，获得具有3D结构的支架，得到载细胞打印支架；

或在制备骨/软骨修复填充材料或药物的应用；应用时，将结构蛋白/透明质酸胶体颗粒与水性溶液共混得到胶体凝胶，上述凝胶直接注射至骨/软骨缺损区域，结构蛋白/透明质酸复合颗粒在非共价键作用下可逆自组装形成连续多孔颗粒网络，在骨缺损部位稳定停留，作为骨修复和再生的支架材料；

或在制备术后创面封闭及皮肤修复材料或药物的应用；或在制备术后创面封闭、口腔溃疡材料或药物的应用；或在制备组织液渗漏封堵、肠漏封堵材料或药物的应用；或在制备组织液渗漏封堵、手术缝合材料或药物的应用；或在制备止血材料或药物的应用，优选肝脏止血材料、骨断面止血材料、动脉止血材料或心脏止血材料或药物的应用；或在制备作为术后防粘连凝胶的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明报道的一种由结构蛋白-透明质酸形成的纳米复合颗粒组装而成的可注射胶体凝胶材料，由于复合颗粒表面具有大量的氨基、羧基、羟基等基团，颗粒之间可通过可逆的非共价键作用(氢键、静电作用、疏水作用)进行自组装形成具有自修复效应的胶体凝胶材料，可逆的非共价键相互作用赋予了材料在注射时发生剪切变稀——即由固体凝胶向流动性液相转变，注射后外力消失，复合材料纳米颗粒在可逆非共价键作用下再次发生自组装并重建胶体网络，即发生自修复现象。这一特性使其在微创手术应用的植入材料、人工细胞外基质和3D生物打印墨水等领域具有广阔的应用前景。

2.由于结构蛋白和透明质酸是两类在结构和性质方面差异明显的大分子，两相的均匀共混溶解及纳米尺度下的复合均受到分子间作用、电荷、溶剂、温度等繁杂因素的共同影响，所以到目前为止，尚没有相关发明和研究报道表明结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒被成功制备，本发明首次报道了使用反溶剂法成功制备结构蛋白和透明质酸均匀分布的复合纳米级颗粒的制备工艺，通过对结构蛋白/透明质酸复杂溶解行为的精细调控，本工艺可以制备出尺寸均一、结构蛋白和透明质酸在其中均匀分散的均相纳米颗粒，并且结构蛋白和透明质酸成分比例可以精细调控；与通过乳液法制备结构蛋白/透明质酸微米颗粒相比，本制备方法简单便捷，制备时不涉及表面活性剂的使用，避免了表面活性剂难以完全洗脱的问题，成本较低，对于工业化量产有很高的应用价值；

3.对于微球体系而言，其凝胶化的临界点通常较高，形成有凝胶性质的力学性能需要更密堆积(更高浓度或者体积分数)，由本发明报道的结构蛋白/透明质酸纳米级颗粒自组装形成的可注射凝胶由于高比表面积颗粒间较强的相互作用，使得纳米颗粒可以以更低的质量分数形成稳定凝胶，同时在相同体积分数下，其力学强度更高，结构更为稳定，这种独特优势是微球体系无法获得的。现有文献报道中用于生物打印的微米颗粒密堆积形成的微凝胶在40％～100％体积分数的储能模量范围为100～2000Pa，而本发明中制备的基于结构蛋白/透明质酸纳米颗粒自组装形成的胶体凝胶相应体积分数的储能模量可以达到1000～10000Pa。

4.透明质酸成分被广泛用于眼科手术、关节炎治疗、医美填充物、外科手术中预防术后粘连、促进伤口的愈合等方面，但大量医疗场景中透明质酸需要交联后方可使用，临床上交联透明质酸凝胶最广泛使用的交联剂BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)由于反应的不完全性，存在残留毒性的问题；而当使用碳二亚胺作为交联剂时，必须联合多氨基官能团类交联剂(如二酰肼)才能引发交联，其降解产物同样存在潜在毒性问题，而结构蛋白类材料由于其交联密度范围有限，即使高交联度还是会在生理条件下快速降解；本发明采用透明质酸和结构蛋白为原料，可通过多种交联剂偶联结构蛋白和透明质酸分子链上的基团来制备复合微、纳米颗粒，交联剂可在后期清洗过程中完全去除，无其他分子进入产物的风险，形成凝胶后其降解产物同样没有残留毒性问题，具有更优的生物相容性，并且可以通过控制颗粒的交联程度精细调控材料的降解时间。

5.本发明报道的结构蛋白-透明质酸复合颗粒可以由可共价交联基团修饰的蛋白衍生物/透明质酸衍生物复合合成，由此类复合颗粒组成的胶体凝胶在未共价交联时，由于颗粒之间的可逆相互作用，凝胶具有剪切变稀，自修复的特点，可实现注射和打印性能；之后凝胶可按需通过颗粒表面的共价键交联实现凝胶力学强度的增加。与纯透明质酸或结构蛋白胶体凝胶相比，这种多组分的材料体系设计可通过多种材料上大量的基团修饰位点赋予后续胶体凝胶多场交联的可行性，更利于通过多重交联设计增加强度和延长降解时间。

6.本发明报道的结构蛋白-透明质酸复合颗粒胶体凝胶，可作为与其他纳米颗粒复合的平台，实现具有复杂功能性和可调力学强度凝胶的制备。我们也首次报道了以结构蛋白-透明质酸复合物为壳的核壳结构胶体凝胶，在保证凝胶优异的力学性能同时，可以实现不同的有机/无机纳米颗粒的核壳结构颗粒的制备，这对胶体凝胶实现更加丰富的功能性提供了重要帮助。

7.本发明报道的得到的结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒由于具有仿人体组成的蛋白/多糖组成，因此复合微、纳米颗粒具有良好的生物相容性和细胞相容性，复合颗粒中透明质酸和胶原可协同发挥作用：透明质酸具有保水、利于软骨修复、免疫调节的作用，而结构蛋白的引入可提高材料整体的机械强度，并对产品的细胞粘附性和促细胞生长性产生积极的影响，两者的叠加在组织修复和填充方面有1+1>2的优势。同时该复合颗粒可作为生物活性蛋白类药物(如诱导组织再生的生长因子)、核酸类药物、mRNA药物的控释载体，用于药物缓释应用；

8.本发明报道的结构蛋白-透明质酸复合材料微球颗粒组装而成的可注射胶体凝胶材料可作为生物打印墨水应用，本发明将结构蛋白/透明质酸聚合物预先制备成复合微、纳米颗粒后通过颗粒组装形成可注射，自修复的胶体凝胶。而传统的基于结构蛋白/透明质酸聚合物水凝胶(如GelMA/HAMA)仅在低温环境显示可注射性能，一旦进入人体环境，随着温度的增加，凝胶会重新转变为液态，使得植入材料难以在组织上停留，并且这类凝胶进行3D生物打印应用时，也必须通过配备低温打印系统的设备实现3D打印，这对于材料的广泛使用具有不便利性。对比而言，由于纳米颗粒的独特的小尺寸效应的优势(颗粒尺寸在5μm以下)，本发明报道的纳米颗粒可以在各温度条件下均表现出稳定、牢固的相互结合，使得其形成的自组装凝胶在注射和打印过程中不会受到环境温度的影响。这也使得结构蛋白/透明质酸颗粒水凝胶具有更加广阔的应用优势。

9.本发明的结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒冻干粉，在吸收血液或组织液之后能够快速与组织形成具有稳定相互作用的胶体凝胶，胶体凝胶可以进一步形成共价交联稳定的与组织之间形成粘合，从而实现稳定的止血和组织粘合。对比于传统的止血粉末通过物理方式止血，这种基于止血和组织粘合的胶体凝胶可以在动态出血过程中实现快速止血和伤口封闭，极大的拓展了止血粉材料的应用。

附图说明

图1是实施例1中的表面形貌表征：a是扫描电镜图，b是透射电镜图。

图2是实施例1中冻干结构蛋白/透明质酸复合颗粒的红外光谱图。

图3为实施例1中结构蛋白/透明质酸复合颗粒以不同质量浓度形成的凝胶的剪切变稀性能；a是凝胶表观粘度随剪切速率的变化曲线，b是凝胶的可注射光学图像。

图4是实施例1中，结构蛋白/透明质酸复合颗粒形成的胶体凝胶(40％(w/v))的结构的扫描电镜照片；图4a是胶体颗粒扫描电镜图，图4b是图4a的放大图；

图5是对比2例中，不同PH条件下制备复合颗粒的最终产物的光学照片。

图6是对比3例中，不同丙酮/水体积条件下制备复合颗粒的透射电镜照片。

图7是实施例5中，制备的不同尺寸的双荧光标记的结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒的激光共聚焦显微照片；图7a是胶体颗粒的透射电镜图，图7b是胶体颗粒的荧光共聚焦图像。图8是实施例7中，以不同交联剂用量制备的不同交联度结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒表面zeta电位图。

图9是对比例4中，纯结构蛋白纳米颗粒与系列交联倍数结构蛋白/透明质酸复合颗粒的体外降解率随时间变化关系。

图10是实施例8中，各交联度不同质量分数的胶体凝胶的流变频率扫描行为。a.0.5倍交联，b.1倍交联，c.1.5倍交联，d.2倍交联。

图11是实施例9中，以不同交联剂用量制备的不同交联度结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒形成的胶体凝胶的挤出力-位移曲线。

图12是实施例13中，结构蛋白/透明质酸复合颗粒形成的胶体凝胶作为载药支架的药物缓释曲线。

图13是实施例15中，结构蛋白/透明质酸复合颗粒形成的胶体凝胶(40％(w/v))的结构3D打印结构的光学图像。

图14是实施例17中，各浓度结构蛋白/透明质酸复合颗粒与细胞共培养的细胞活力测定。

图15是实施例18中，结构蛋白/透明质酸复合颗粒形成的胶体凝胶(30％(w/v))作为防黏连止血材料的应用；a.水凝胶注射至肝脏圆形缺损处实现创伤止血，b.水凝胶治疗肝脏缺损后可有效防止创伤粘连。

图16是实施例19中，结构蛋白/透明质酸复合颗粒形成的胶体凝胶(30％(w/v))作为皮下填充材料的应用；a.水凝胶注射至小鼠皮下图，b.水凝胶稳点在小鼠背部停留。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

实施例1结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒胶体凝胶的制备

1.结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒的制备：将1g胶原蛋白和1g透明质酸钠溶解于40℃400mL的去离子水中，并调节pH至9，在30min内加入800mL丙酮，并快速搅拌，使蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入480mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和430mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，取一部分纳米颗粒悬浊液通过纳米激光粒度及zeta电位仪测定其水合粒径及zeta电位，结果如表1所示，胶原蛋白-透明质酸复合颗粒的水合粒径约为310±12nm，zeta约为-25.2±3.6mV，再取一部分纳米颗粒悬浊液进行透射电镜测试，剩余悬浊液冷冻干燥，得到结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒粉末。颗粒的尺寸和形貌如图1的扫描电镜和透射电镜所示，复合纳米颗粒的粒径约为200±30nm，冻干纳米颗粒的红外光谱如图2所示，纳米颗粒的红外光谱中同时具有透明质酸和胶原蛋白的特征峰，说明纳米颗粒中含有透明质酸和胶原蛋白两相。

2.将上述方法制备的结构蛋白/透明质酸复合颗粒冻干粉末与不同量的去离子水共混，通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到不同质量分数和体积分数的可注射自修复胶体凝胶。使用旋转流变仪的时间扫描模式得到胶体凝胶的储能模量G’，自修复效率通过振荡剪切后胶体凝胶的储能模量与剪切之前比较得到(应变0.1～1000％)如表2所示，当胶体凝胶中纳米颗粒的质量分数为5％～70％时，其储能模量范围为10¹～10⁴Pa，说明可通过质量分数的改变调控胶体凝胶的机械强度，并且各质量分数的胶体凝胶的自修复效率均大于85％，说明该胶体凝胶具有优异的自修复性能；不同质量分数的胶体性能剪切变稀性能如图3所示，其中频率为1Hz，应变为0.5％，可看出各质量分数的胶体凝胶均具有剪切变稀的力学特性，均可挤出和注射。胶体凝胶(质量分数＝40％)的结构的扫描电镜图如图4所示，纳米颗粒通过颗粒表面的非共价作用自组装，进而形成了胶体网络。

表1

颗粒尺寸	表面电荷
		310±12nm	-25.2±3.6mV

表2

质量分数(w/v)	5％	10％	20％	30％	40％	50％	60％	70％
									体积分数(v/v)	8％	17％	36％	49％	65％	81％	107％	120％
储能模量G(Pa)	1.5	25.3	120.8	846.6	1396.6	6268.9	9347.2	11954.8
									自修复效率(％)	92.7	96.6	99.5	93.2	91.4	89.6	88.1	86.0

对比例1

1.结构蛋白/透明质酸复合微米颗粒的制备：将1g胶原蛋白和1g透明质酸钠溶解于40℃400mL的去离子水中，并调节pH至9，得到胶原蛋白/透明质酸混合溶液，并将混合溶液以10mL/min的速度逐滴加入到200mL含有2w/v％司班80的乙酸乙酯中，获得悬浮在乙酸乙酯中的复合颗粒。使用去离子水反复多次清洗复合颗粒。并将上述颗粒分散液冷冻干燥得到复合微米颗粒粉末。使用动态光散射(DLS)和zeta电位仪测试悬浮液中微米粒子的粒径和带电量，如表3所示。

表3

颗粒尺寸	表面电荷
		210±10um	-28.0±4.5mV

2.将上述方法制备的结构蛋白/透明质酸微米颗粒冻干粉末与不同量的去离子水共混，通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到不同体积分数的微凝胶。使用旋转流变仪的时间扫描模式得到胶体凝胶的储能模量G’和自修复效率，其中频率为1Hz，应变为0.5％，自修复效率通过振荡剪切后胶体凝胶的储能模量与剪切之前比较得到(应变0.1～1000％)如表4所示，在较低体积分数下，结构蛋白/透明质酸纳米颗粒可借助于其高比表面积和较强相互作用形成稳定的胶体凝胶，而微米颗粒则在低体积分数(<60％)下不能成为凝胶，并且相同体积分数的胶体凝胶具有更高的力学强度。

表4

对比例2

本发明中采用反溶剂法制备纳米颗粒，需要通过调控溶剂-亲水高分子之间的排斥作用以及高分子溶液自身的表面张力，进而将高分子构象由最初的伸展调整为纳米或微米蜷缩球体，由于结构蛋白/透明质酸分子结构中均含有大量可电离基团，而溶液PH会显著影响高分子的带电量，因而PH对高分子的分子内/分子间相互作用、构象调整以及纳米颗粒的制备具有重要影响。

将多份含1g胶原蛋白和1g透明质酸钠的混合粉末分别溶解于40℃400mL的去离子水中，并调节pH至3、4、5、5.5、6、8、10、12、14，在30min内加入800mL丙酮，并快速搅拌，使蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入480mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和430mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌10hrs以对纳米颗粒进行交联。不同PH条件下制备复合颗粒的最终产物的光学照片如图5所示，可以看出当透明质酸/胶原蛋白混合溶液的PH小于6(PH＝3～5.5)时，高分子在丙酮溶剂中聚集析出，这是由于这两种高分子在该PH条件下溶解能力下降以及两种高分子之间的相互作用平衡被打破所致：一方面，透明质酸分子结构中含有大量羟基和羧基，带负电，在酸性条件下发生质子化，分子带电量减小，导致分子链相互排斥的倾向减小，进而导致透明质酸分子从溶剂中析出；另一方面，胶原蛋白分子中含有氨基、羧基和羟基，在酸性条件下显正电性，易与透明质酸分子发生静电吸附，形成不溶于水的复合物一起从水中析出。用纳米激光粒度及zeta电位仪测定PH为6～14条件下合成的复合纳米颗粒的水合粒径及zeta电位，结果如表5所示，当PH为6～14范围内时，均可成功制备胶原蛋白-透明质酸复合纳米颗粒，复合颗粒的水合粒径在285～335nm，zeta电位约为-24.6～25.4mV，和实施例1对比说明，对溶液PH的精细调控对于合成此类多相复合纳米材料至关重要。

表5

合成PH	6	8	10	12	14
						颗粒尺寸(nm)	285±12.5	302±9.6	324±8.2	329±4.2	335±5.5
表面电荷(mV)	-25.0±0.4	-24.9±1.1	-25.4±0.8	-24.6±0.4	-25.7±1.7

对比例3

本发明中采用反溶剂法制备纳米颗粒，反溶剂在其中起到使透明质酸/结构蛋白分子脱水，使其分子构象从拉伸状态转变为卷曲状态的作用，不同浓度或体积的反溶剂对高分子脱水作用不同，具体地，提高反溶剂在整体溶液中的比例，会加剧高分子脱水，当反溶剂加入到合适比例时，高分子构象会调整为规则且均匀的纳米尺度的球体；当反溶剂加入量太少时，脱水能力不足，高分子与水之间残留的氢键还可维持其伸展构象，不足以使其成球；反之，当反溶剂加入过量，成球的高分子进一步脱水，导致高分子在溶液中成团析出,此外不同浓度的高分子对反溶剂的耐受程度不同，在添加相同体积的反溶剂时，高浓度溶液中的高分子更容易从中析出，因而反溶剂/水的比例对高分子构象调整成球以及纳米颗粒的制备具有重要影响。

将胶原蛋白和透明质酸钠的混合粉末分别以0.1％和0.5％和1％的总浓度(胶原蛋白与透明质酸等质量)溶解于40℃的去离子水中，分别加入水溶液0.5、1、2、4、8、10、12倍体积的丙酮，并快速搅拌，使蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入EDC和NHS(每1g胶原蛋白对应480mgEDC和430mgNHS)搅拌10hrs以对纳米颗粒进行交联。不同丙酮/水体积比条件下制备复合颗粒的合成结果如表6所示，“╳”表示乳浊液中无球状颗粒，“○”表示乳浊液中有纳米颗粒，“□”表示合成过程中纳米颗粒发生聚集析出，可以看出对应某一初始胶原蛋白/透明质酸浓度，均有其可合成纳米颗粒的丙酮/水体积比的范围，综合各实验组，反溶剂/水的体积之比范围为:1～10。取胶原蛋白/透明质酸总浓度为0.5％实验组的各个悬浊液样品进行透射电镜观察，结果如图6所示，该浓度下，当丙酮/水体积比低于2时，高分子有成球趋势但未实际成球，当丙酮/水体积比在2～8时，可以形成大小均一的纳米颗粒，当丙酮/水体积比在10及10以上时，纳米颗粒发生不可逆聚集。和实施例1对比说明，对反溶剂/水比例的精细调控对于合成此类多相复合纳米材料至关重要。

表6

实施例2

1.a:可共价交联的结构蛋白的制备：将胶原蛋白在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入0.5g甲基丙烯酸酐，反应6h后加入大量丙酮，破坏蛋白质分子表面的水化层，产物沉淀析出，使用去离子水反复清洗后，进行冷冻干燥，得到冻干的甲基丙烯酸酯化胶原蛋白样品；

b:可共价交联的透明质酸的制备：将透明质酸在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为5w/v％的水溶液；将水溶液冰浴使溶液温度保持在0～4℃，向上述溶液中逐滴加入1g甲基丙烯酸酐，同时用1M浓度的NaOH溶液使水溶液PH保持在7～8范围内，反应12h后用去离子水透析，随后进行冷冻干燥，得到冻干的甲基丙烯酸酯化透明质酸样品；

2.将1g改性胶原蛋白和1g改性透明质酸钠溶解于40℃400mL的去离子水中，并调节pH至9，在30min内加入800mL丙酮，并快速搅拌，使蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入480mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和430mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，取一部分纳米颗粒悬浊液，通过纳米激光粒度及zeta电位仪测定其水合粒径及zeta电位，结果如表7所示，可共价交联的胶原蛋白/透明质酸复合颗粒的水合粒径约为307±15nm，与实施例1中的复合颗粒水合粒径基本一致(310±12nm)，其表面电荷量为-29.5±5.3mV，略大于实施例1中颗粒的表面电荷(-25.2±3.6mV)。剩余悬浊液进行冷冻干燥，得到可共价交联的结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒粉末。

3.将上述方法制备的结构蛋白/透明质酸复合颗粒冻干粉末与不同量的去离子水共混，通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到不同质量分数和体积分数的可注射自修复胶体凝胶，之后加入光交联剂均匀混合，随后在紫外光强100mW/m²下，照射交联30S，引发自由基聚合，使改性复合颗粒之间发生进一步共价交联，得到力学增强的、非共价键和共价键共同交联的复合颗粒水凝胶材料。

使用旋转流变仪的时间扫描模式得到水凝胶的储能模量G’如表8所示。其中频率为1Hz，应变为0.5％。与实施例1中非共价交联复合颗粒凝胶相比，相同质量分数的共价交联颗粒凝胶具有更高的力学强度，经旋转流变仪测定，胶体凝胶在光交联之前具有可注射、自修复的特性，自修复效率高于80％；共价交联后，胶体凝胶已不具有自修复特性，其自修复效率低于15％。

表7

颗粒尺寸	表面电荷
		307±15nm	-29.5±5.3mV

表8

实施例3

1.结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒的制备：将1g胶原蛋白和1g透明质酸钠溶解于40℃400mL的溶的10mg/ml二氧化硅颗粒悬浮液(通过Stober法制备而成，颗粒尺寸为20nm)去离子水中，并调节pH至9，在30min内加入800mL丙酮，并快速搅拌，使蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入480mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和430mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，进行冷冻干燥，得到结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒粉末。使用激光纳米粒度及Zeta电位分析仪测定了二氧化硅/胶原蛋白-透明质酸复合颗粒的水合粒径及zeta电位；如表9所示，核壳结构的复合颗粒的水合粒径约为330±25nm，zeta电位约为-31.3±2.3mV。

2.将上述方法制备的核壳结构的结构蛋白/透明质酸复合颗粒冻干粉末与不同量的去离子水共混，通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到不同质量分数和体积分数的可注射自修复胶体凝胶。使用旋转流变仪的时间扫描模式得到胶体凝胶的储能模量G’，自修复效率通过振荡剪切后胶体凝胶的储能模量与剪切之前比较得到(应变0.1～1000％)，如表10所示，不同质量分数的核壳结构的结构蛋白/透明质酸胶体凝胶的储能模量均高于实施例1中胶体凝胶的模量，说明可通过构建核壳结构调控纳米颗粒及胶体凝胶的力学强度，并且由于壳层仍为明胶/透明质酸复合成分，由核壳结构纳米颗粒形成的胶体凝胶仍然具有优异的自修复性能和剪切变稀的力学特点，具有可注射、可打印的性能。

表9

颗粒尺寸	表面电荷
		330±25nm	-31.3±2.3mV

表10

实施例4

1.将1g甲基丙烯酯化胶原蛋白和1g甲基丙烯酯化透明质酸钠溶解于40℃400mL的10mg/ml二氧化硅颗粒悬浮液(通过Stober法制备而成，颗粒尺寸为20nm去离子水中，去离子水中，并调节pH至9，在30min内加入800mL丙酮，并快速搅拌，使蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入480mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和430mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，进行冷冻干燥，得到可共价交联的核壳结构的结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒粉末。使用激光纳米粒度及Zeta电位分析仪测定了核壳结构二氧化硅/胶原蛋白-透明质酸复合颗粒的水合粒径及zeta电位；如表11所示，核壳结构的复合颗粒的水合粒径约为323±17nm，zeta电位约为-35.9±0.8mV。

2.将上述方法制备的核壳结构的结构蛋白/透明质酸复合颗粒冻干粉末与不同量的去离子水共混，通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到不同质量分数和体积分数的可注射自修复胶体凝胶，之后加入光交联剂均匀混合，随后在紫外光强100mW/m²下，照射交联30S，引发自由基聚合，使改性复合颗粒之间发生进一步共价交联，得到力学增强的、非共价键和共价键共同交联的复合颗粒水凝胶材料。使用旋转流变仪的时间扫描模式得到水凝胶的储能模量G’如表12所示。其中频率为1Hz，应变为0.5％。与实施例3中非共价交联复合颗粒凝胶相比，相同质量分数的共价交联颗粒凝胶具有更高的力学强度，经旋转流变仪测定，胶体凝胶在光交联之前具有可注射、自修复的特性，自修复效率高于80％；共价交联后，胶体凝胶已不具有自修复特性，其自修复效率低于15％。

表11

颗粒尺寸	表面电荷
		323±17nm	-35.9±0.8mV

表12

实施例5

实时观察纳米颗粒凝胶在生物体内的停留位置及其分布状态，对于深入了解和准确把握纳米颗粒的生物学特性及其安全性评价具有重要意义。对于非标记的纳米颗粒，现有的技术手段，如电子显微镜和暗场显微镜，均无法实现纳米颗粒的长时间动态观察，因此制备了了荧光标记的复合颗粒，以使其可被示踪。

1.使用罗丹明B异硫氰酸酯和5-氨基荧光素分别对胶原蛋白和透明质酸钠进行修饰，得到罗丹明B标记的胶原蛋白(RBITC-Pr)和5-氨基荧光素标记的透明质酸(5AF-HA)；

2.称取一份胶原蛋白/透明质酸(1g/1g)和三份荧光标记结构蛋白/透明质酸(RBITC-Pr/5AF-HA)(1g/1g)混合粉末，分别溶解于500ml、200ml、100ml、50ml去离子水中，得到结构蛋白/透明质酸混合水溶液，结构蛋白/透明质酸总浓度分别为0.4％、1％、2％和4％，升温溶解后，将溶液温度保持在30℃，调溶液pH至10，分别加入950mL、380mL、195mL、100mL丙酮，并快速搅拌，使结构蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入480mg EDC和430mg NHS搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，多次离心清洗颗粒，得到产物即为结构蛋白/透明质酸复合颗粒。通过控住结构蛋白/透明质酸总浓度得到尺寸分别为20nm、500nm，1μm，4μm的结构蛋白/透明质酸复合颗粒。不同尺寸的复合颗粒的透射电镜及共聚焦激光扫描图像如图7所示，在共聚焦图像中，可明显看到被荧光标记的复合纳米颗粒，这为后期纳米颗粒在生物体内的实时观察奠定了基础，在同一个纳米/微米颗粒中，胶原蛋白成分呈现红色荧光，透明质酸成分呈现绿色荧光，两种荧光均呈现均匀分布，说明纳米颗粒中确实存在两种成分，并且通过调控总投料浓度，可制备出不同粒径大小的纳米颗粒。

实施例6

由于结构蛋白和透明质酸被用作生物材料，以构建细胞微环境时产生的机械信号和生化信号差异明显，如结构蛋白通常具有更高的力学强度和更多的细胞粘附位点，而透明质酸和硫酸软骨素则是人体中含量最多的糖胺聚糖，与蛋白质一起参与构建细胞外基质环境，因此是否能够调控生物材料中结构蛋白/透明质酸的相对比例对其促进组织再生的表现至关重要。

此实施例通过调控结构蛋白/透明质酸的投料比制备出不同结构蛋白/透明质酸质量占比的纳米颗粒：称取三份胶原蛋白/透明质酸(0.2g/1.8g，1.3g/0.7g，1.8g/0.2g)混合粉末，分别溶解于200ml去离子水中，得到结构蛋白/透明质酸混合水溶液，结构蛋白/透明质酸总浓度为1％，升温溶解后，将溶液温度保持在35℃，调溶液pH至10，分别加入380mL丙酮，并快速搅拌，使结构蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入EDC/NHS(480mg/430mg，624mg/559mg，768mg/688mg)，继续搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，多次离心清洗颗粒，随后进行冷冻干燥，得到产物即为不同胶原蛋白/透明质酸质量占比复合纳米颗粒。利用I型胶原酶对冻干纳米颗粒进行特异性降解实验，以确定复合纳米颗粒中胶原蛋白/透明质酸相对占比，不同投料组别的结构蛋白/透明质酸相对占比如表13所示，可以看出，通过调整胶原蛋白/透明质酸投料比，复合纳米颗粒中胶原蛋白/透明质酸质量比可以在0.19～2范围内进行调控。

表13

胶原蛋白/透明质酸投料比	复合纳米颗粒中胶原蛋白/透明质酸质量比
		10/90	16/84
65/35	60/40
		90/10	80/20

实施例7

生物材料的任何植入都会引发全身或局部免疫反应，称为异物反应。反应的严重程度取决于天然组织内稳态的破坏程度。异物反应的严重程度主要与植入位置、材料类型、所用交联化学物质的类型和降解速率有关。异物反应导致在植入的水凝胶周围形成纤维囊，可能会通过释放降解酶和活性氧物质来改变局部微环境。因此对于面向组织修复等生物医用场景的生物材料，研究其降解性具有重要的生物安全性意义，而水凝胶植入材料的降解性与其交联程度密切相关，交联程度越高，降解周期越长。对于不同的应用场景，期望的植入材料的降解周期也有所不同，因此开发具有不同交联度、不同降解周期的植入材料很有必要。

不同交联度结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒的制备：称取多份胶原蛋白/透明质酸(1g/1g)混合粉末，分别溶解于200ml去离子水中，得到胶原蛋白/透明质酸混合水溶液(总浓度为1％)，升温溶解后，将溶液温度保持在35℃，调溶液pH至10，分别加入380mL丙酮，并快速搅拌，使蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入与透明质酸钠中羧基不同摩尔倍数的EDC(0.25倍、0.5倍、0.75倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍)，EDC/NHS的摩尔比始终为1/1.5，继续搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，多次离心清洗颗粒，得到产物即为不同交联度复合纳米颗粒。利用三硝基苯磺酸(TNBS)法测得不同组别的结构蛋白中氨基消耗量结果如表14所示，可以看出随着交联剂含量的增加，导致结构蛋白中的氨基与透明质酸的羧基反应程度逐渐增加，氨基消耗量随之升高，因此交联度越高的复合纳米颗粒表面带电量越多，负电性越强，如图8所示。

表14

对比例4

纯结构蛋白的纳米颗粒的制备：称取1g胶原蛋白粉末，溶解于100ml去离子水中，得到胶原蛋白水溶液(浓度为1％)，升温溶解后，将溶液温度保持在35℃，调溶液pH至10，加入380mL丙酮，并快速搅拌，使蛋白质分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入与胶原蛋白中羧基等摩尔倍数的EDC，EDC/NHS的摩尔比始终为1/1.5，继续搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，多次离心清洗颗粒，得到产物即为纯结构蛋白纳米颗粒，命名为Pr NPs。

纯结构蛋白纳米颗粒与实施例7中的复合颗粒的体外降解速率比较：将10mg PrNPs或CNPs-x颗粒(复合纳米颗粒，x表示交联倍数)与50μl 1mM NaCl溶液(pH 7.0)在2ml

管中混合，并在4℃下储存过夜，以使复合纳米颗粒完全膨胀。然后将1ml胶原酶/透明质酸酶溶液添加到试管中，胶原酶和透明质酸酶的浓度分别为40ug/ml和200U/ml，随后将样品在旋转板上于37℃孵育。分别于1、5、10、15天后离心(14000rpm，10min)弃去上清液，并对离心沉淀进行冷冻干燥，之后对残余固体进行称重并计算降解率，n＝3。降解率由以下公式计算得出：

降解率＝(10-冻干固体重量)/10*100％。

纯结构蛋白纳米颗粒与系列交联倍数结构蛋白/透明质酸复合颗粒的体外降解率随时间变化关系如图9所示，纯结构蛋白纳米颗粒在体外酶降解条件下15天后降解率达到89％，降解最快的复合颗粒为交联倍数为0.25的复合纳米颗粒组，其降解率达到71％，复合颗粒全部组别的降解率均低于纯结构蛋白颗粒组，这说明透明质酸成分的引入有效延长了纳米颗粒的降解周期，这对胶体凝胶在长时间植入场景的使用是有利的，并且复合颗粒的降解率随着交联倍数的增大而显著降低，这说明可以通过对材料的交联倍数金星控制进而实现对材料降解周期的调控，以满足不同降解周期植入场景。

实施例8

将上述方法制备的不同交联度的结构蛋白/透明质酸复合颗粒冻干粉末与不同量的去离子水共混，通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到可注射自修复胶体凝胶。使用旋转流变仪的时间扫描模式得到胶体凝胶的储能模量G’，自修复效率通过振荡剪切后胶体凝胶的储能模量与剪切之前比较得到(应变0.1～1000％)如表15所示。各交联度不同质量分数的胶体凝胶的频率扫描行为如图10所示，各交联度不同质量分数的结构蛋白/透明质酸胶体凝胶具有优异的自修复效率和剪切变稀的力学特点，具有可注射、可打印的性能，其自修复效率均高于90％。

表15

实施例9

使用实施例1～7得到的胶体凝胶，以实施例7为例，将不同交联度结构蛋白/透明质酸复合胶体凝胶装入5mL注射器中，安装上18G注射针头，模拟实际使用情况。以恒定推动速度10mm/min推动推进杆，注射器中的样品经由针头被推挤出。得到推挤力曲线，如图11所示。

由图可知，在一定的压缩位移内，结构蛋白/透明质酸复合颗粒可注射凝胶的压缩载荷变化范围在在10—30N之间，压缩载荷的变化幅度较小，说明样品分散均匀，注射较为容易和方便。

实施例10

生物体中的各类结构蛋白可形成多种超分子结构，构成了嵌入细胞的机械支架和天然支撑，并且分布在不同组织中的结构蛋白承担着不同的角色，并且具有不同的蛋白结构特点。因此，开发针对于不同组织部位(如皮肤、肌肉)的结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒对于特定受损组织的修复具有积极意义。

称取1g明胶和1g透明质酸，或1g肌动蛋白和1g透明质酸，或1gα-角蛋白和1g透明质酸溶解于200ml去离子水中，得到结构蛋白/透明质酸混合水溶液，结构蛋白/透明质酸总浓度为1％，升温溶解后，将溶液温度保持在35℃，调溶液pH至10，分别加入380mL丙酮，并快速搅拌，使结构蛋白质和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入EDC/NHS(480mg/430mg)，继续搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，多次离心清洗颗粒，随后进行冷冻干燥，得到产物即为明胶/透明质酸复合纳米颗粒或α肌动蛋白/透明质酸复合纳米颗粒。所得纳米颗粒的尺寸和电荷如表16所示，不同种类的结构蛋白均可与透明质酸成功复合成为纳米颗粒。

表16

颗粒种类	颗粒尺寸(nm)	表面电荷(mV)
			明胶/透明质酸复合纳米颗粒	320	-23.7
肌动蛋白/透明质酸复合纳米颗粒	313	-28.5
			α-角蛋白/透明质酸复合纳米颗粒	345	-31.6

实施例11

对结构蛋白或透明质酸进行功能化基团的修饰形成其对应的衍生物，再利用功能化聚合物合成纳米颗粒，可为复合颗粒带来新的性能改变，例如可通过点击化学基团对蛋白或透明质酸进行修饰，由这些衍生物合成的纳米颗粒可以发生颗粒表面处的点击化学反应，使原本通过非共价作用组装的胶体凝胶的强度大幅提升；也可以利用环境响应型的超分子作用基团对蛋白或透明质酸进行修饰，由这些衍生物合成的纳米颗粒形成胶体凝胶后，由于颗粒之间存在高密度的超分子相互作用，胶体凝胶的强度有大幅提升；并且由于许多超分子作用具有响应性质，可通过一定的外部刺激使胶体凝胶在不同强度间自由切换，此类材料对一些需要响应控制的生物医学场景尤为必要。

1.结构蛋白衍生物合成：在40℃下将10g胶原蛋白粉末溶于200mL去离子水中得到胶原蛋白溶液。剧烈搅拌条件快速加入EDC/NHS(均为20mg),同时加入0.2g的叠氮亚胺或丙炔胺，使叠氮亚胺和丙炔胺与胶原蛋白链上游离的羧基发生亲核取代反应，继续反应2小时，用盐酸调节pH至7，并加入原溶液2倍体积的丙酮，使胶原蛋白沉淀析出，分别得到叠氮基团和炔烃封端的胶原蛋白。

2.结构蛋白衍生物/透明质酸复合纳米颗粒的制备：

称取1g叠氮化胶原蛋白和1g透明质酸，或1g炔烃化胶原蛋白和1g透明质酸溶解于200ml去离子水中，得到结构蛋白衍生物/透明质酸混合水溶液(总浓度为1％)，升温溶解后，将溶液温度保持在35℃，调溶液pH至10，分别加入380mL丙酮，并快速搅拌，使结构蛋白衍生物和多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入EDC/NHS(480mg/430mg)，继续搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，多次离心清洗颗粒，随后进行冷冻干燥，得到产物即为叠氮化胶原蛋白/透明质酸复合纳米颗粒(命名为CNPs-N₃)或炔烃化胶原蛋白/透明质酸复合纳米颗粒(命名为CNPs-C₃)。所得纳米颗粒的尺寸和电荷如表17所示。

表17

3.将步骤2中制备的结构蛋白衍生物/透明质酸复合纳米颗粒(CNPs-N₃、CNPs-C₃)冻干粉末各0.15g均匀混合，之后与1ml去离子水共混，通过鲁尔转接头注射器快速反复吹打10次，得到可注射自修复胶体凝胶(命名为CCNPs)。使用旋转流变仪的时间扫描模式得到胶体凝胶的储能模量G’和自修复效率，静置2h使颗粒表面的点击化学基团充分反应，之后使用旋转流变仪再次测试胶体凝胶的储能模量G’和自修复效率，其中频率为1Hz，应变为0.5％，如表18所示。可以看出表面具有点击化学基团的胶体凝胶具有前期可注射、自修复，后期自增强的力学特征，并且其力学强度显著优于纯结构蛋白/透明质酸纳米颗粒形成的胶体凝胶。

表18

实施例12

1.透明质酸衍生物合成：

a:合成β环糊精修饰的透明质酸衍生物(HA-β-CD)。使用碳酸二苯酯作为交联剂，将DMF中的10mLβ-CD和HA(各60mM)在圆底烧瓶中加热至80℃，加入300μL三乙胺作为催化剂，然后加入碳酸二苯酯，在80℃温度下搅拌10分钟，通过DPC的酯交换连接CD和HA。将粗物质冷却至环境温度并倒入6体积的乙醇中以沉淀聚合物，将其机械解聚并以4000rpm离心10分钟。通过在涡旋下将其重悬以去除苯酚和其他杂质来洗涤残余物5分钟，然后离心。产品用丙酮彻底清洗，然后将产物在45℃真空干燥过夜，得到β环糊精化透明质酸(HA-β-CD)。

b：合成偶氮苯修饰的透明质酸衍生物(HA-Azo)：首先将HA(0.2g)溶解在PBS缓冲溶液(pH＝6.2)中，然后加入EDC(0.6g，1.2当量)，将NHS(0.240g)加入溶液中并在室温下搅拌溶液15分钟。快速连续调节pH至7.3，将偶氮加入溶液中，并连续搅拌溶液48小时。将产物用去离子水透析然后冻干，得到偶氮苯化透明质酸(HA-Azo)。

2.结构蛋白/透明质酸衍生物复合纳米颗粒的制备：

称取1g胶原蛋白和1gβ环糊精化透明质酸(HA-β-CD)，或1g胶原蛋白和1g偶氮苯化透明质酸(HA-Azo)溶解于200ml去离子水中，得到结构蛋白/透明质酸衍生物混合水溶液(总浓度为1％)，升温溶解后，将溶液温度保持在35℃，调溶液pH至10，分别加入380mL丙酮，并快速搅拌，使结构蛋白和透明质酸衍生物缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入EDC/NHS(480mg/430mg)，继续搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，多次离心清洗颗粒，随后进行冷冻干燥，得到产物即为胶原蛋白/β环糊精化透明质酸复合纳米颗粒(命名为CNPs-β)或胶原蛋白/偶氮苯化透明质酸复合纳米颗粒(命名为CNPs-Azo)。所得纳米颗粒的尺寸和电荷如表19所示。

表19

颗粒种类	颗粒尺寸(nm)	表面电荷(mV)
			CNPs-β	258	-23.5
CNPs-Azo	294	-20.3

3.将步骤2中制备的结构蛋白/透明质酸衍生物复合纳米颗粒(CNPs-β、CNPs-Azo)冻干粉末各0.15g均匀混合，之后与1ml去离子水共混，通过鲁尔转接头注射器快速反复吹打10次，得到可注射自修复胶体凝胶(命名为SCNPs)。使用旋转流变仪的时间扫描模式得到胶体凝胶的储能模量G’和自修复效率，之后使用安装有365nm紫外光源平台的旋转流变仪再次测试胶体凝胶的储能模量G’和自修复效率，其中频率为1Hz，应变为0.5％，如表20所示。可以看出纯结构蛋白/透明质酸纳米颗粒形成的胶体凝胶在各种光照条件下的强度和自修复效率未发生变化，证明其并不具有光响应特性。而表面具有光敏基团的胶体凝胶在可见光下其强度显著高于纯结构蛋白/透明质酸纳米颗粒形成的胶体凝胶；而在紫外光照下，其强度发生由强变弱的变化，撤去紫外光照，恢复可见光照后，其强度和自修复效率又恢复至初始状态。这是由于偶氮苯基团在可见光条件下呈反式结构，可与β-环糊精的空腔结合，产生主客体作用；当接收到紫外光照时，偶氮苯发生顺反异构，变为顺式结构，而顺式结构的偶氮苯不能与环糊精的空腔结合，进而与环糊精发生解离；当外部条件重新改为可见光照时，偶氮苯重新变回反式结构，与环糊精的主客体作用恢复，随之纳米颗粒通过较强的相互作用形成可注射、自修复的高强度胶体凝胶。可以预见，此材料对于前期需要良好流动性，后期需要原位固化增强(如止血封堵)场合很有应用潜力。

表20

实施例13

1.使用实施例1～4得到的结构蛋白/透明质酸复合颗粒，以实施例1中的复合颗粒为例，在合成纳米颗粒过程中，将阿霉素(Dox)提前以1％(w/v)的浓度溶解在结构蛋白/透明质酸混合溶液中，之后通过反溶剂法制备载药复合纳米颗粒，并冷冻干燥；将载药纳米颗粒冻干粉末以一定浓度溶于磷酸盐溶液，使用紫外-可见分光光度计测定DOX在480nm处的吸光度值，再利用DOX的标准曲线计算出DOX的含量，测得复合颗粒对阿霉素的包封率为5.5％。

2.配置30％质量浓度的载药纳米颗粒胶体凝胶，将样品(每个样品体积为1ml)浸泡在磷酸盐缓冲盐水溶液中(PBS，pH＝7.4)并保持37℃环境温度置于振荡器上(30转/分钟)，以模拟体内动态环境。分别在1d，3d，7d，14d和21d吸收1ml的PBS上清液，然后加入等量的新鲜PBS溶液。使用紫外-可见分光光度计在每个时间点测量Dox的释放量，其中每组三个样品。如图12所示，经检测，可以发现在胶体凝胶中的Dox以一个相对恒定的浓度进行缓慢释放，这种均匀的释放在第21天仍能被检测到，说明胶体凝胶具有药物缓释性能，可作为生物活性物质的载体。

实施例14

胶体凝胶由于基础单元的高比表面积以及整体动态交联的网络结构，非常适于与生物活性物质(如维生素、生长因子、血液等)以及其他纳米材料(如羟基磷灰石、生物玻璃等)直接共混，起到稳定生物活性成分，赋予力学强度和自修复能力的作用。

1.首先利用水热法合成了粒径约为50nm的羟基磷灰石(HAp),冻干成为粉末；之后取实施例1～4中的复合纳米颗粒悬浮液，以实施例1所得复合纳米颗粒悬浮液为例，取100ml复合纳米颗粒悬浮液(浓度为2％)，加入200mg的HAp冻干粉末，搅拌均匀，超声分散30mins之后冷冻干燥，得到结构蛋白/透明质酸复合纳米颗粒-羟基磷灰石混合粉末(其中两者质量比为10/1)，命名为Blend NPs，简记为BNPs；

2.取0.3gBNPs与1ml去离子水均匀共混，得到BNPs胶体凝胶，另取0.3gHAp冻干粉末与1ml去离子水均匀共混，得到HAp胶体凝胶,之后使用旋转流变仪测试两种胶体凝胶的模量G’和自修复效率，其中频率为1Hz，应变为0.5％，结果如表21所示，可以看出，纯羟基磷灰石胶体凝胶(HAps)在30％的质量分数下具有较高的力学强度，其弹性模量为3.3kPa，但其不具备自修复能力，其自修复效率仅为4.5％，相比之下，与结构蛋白/透明质酸复合颗粒共混形成的胶体凝胶(BNPs)虽然力学强度有所下降，模量为1.4kPa，但其赋予了羟基磷灰材料优异的自修复性能，其自修复效率高达91％，这说明复合纳米颗粒可以作为生物活性物质的搭载平台，与生物活性物质一道，在组织修复与再生过程中协同发挥作用。

表21

实施例15

使用实施例1～4得到的结构蛋白/透明质酸复合颗粒，以实施例1中的复合颗粒为例，配制质量分数为30％的胶体凝胶，通过旋转流变仪器的温度扫描模式测试胶体凝胶模量随温度变化情况，结果如表22所示，可以看出，胶体凝胶的储能模量在各温度下保持一致，说明纳米颗粒可以在各温度条件形成稳定、牢固的相互结合，使得其形成的自组装凝胶在注射和打印过程中不会受到环境温度的影响。

随后将结构蛋白/透明质酸复合胶体凝胶装入注射器中，利用3D生物打印机通过口径为G16-23的针头挤出打印。材料按照既定程序所设计的路线逐层打印，得到具有精细结构的3D生物打印支架，3D生物打印后的结构如图13所示。可以看出，由凝胶打印出的网格支架图13a、鼻子模型图13b及耳朵模型图13c结构清晰，完整，表明可注射凝胶具有优异的打印性能。

表22

实施例16

使用实施例1～4得到的胶体凝胶及共价交联胶体凝胶(质量分数均为50％)，进行压缩力学测试。将胶体凝胶制成圆柱体(直径：6.4mm，高度：6mm)，压缩试验以0.0002mm/s的加载速率进行。样品的压缩应变统一设为20％，各自的压缩弹性模量如表23所示，核壳结构设计策略及对凝胶进行二次固化交联的策略，均可明显提高凝胶的力学强度。

表23

实施例17

使用实施例1～4得到的结构蛋白/透明质酸复合颗粒，以实施例1中的复合颗粒为例，使用小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)评价了复合纳米颗粒的细胞毒性。辐照灭菌后乙醇、PBS清洗，后分散于细胞培养液(含10％胎牛血清)中，悬浊液浓度依次为800ug/ml、400ug/ml、200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、0ug/ml；用细胞培养液(含10％胎牛血清)稀释3T3细胞悬液，调整浓度至1×10⁵个细胞/mL,于96孔板内每孔接种100uL细胞悬液，取出生长细胞的96孔板，按照模板排列顺序加入100ul的试验样品(纳米颗粒悬浊液)和对照样品(细胞培养液)。加样后继续在37℃、5％二氧化碳、湿度≥90％条件下培养24h。之后利用CCK8法测定各组样品的细胞活力，结果如图14所示，体外测试显示，即使在800μg mL^-1下孵育24小时后，细胞毒性也可以忽略不计。

实施例18

健康雄性SD大鼠购于长春长生生物科技有限责任公司，动物房饲养一周后待用。用浓度为1g/mL的水合氯醛，按1mL水合氯醛/300g体重将大鼠麻醉，用剃毛器将大鼠腹部毛剃光以漏出皮肤，仰卧位置于手术板上，固定其四肢，并用碘伏溶液进行消毒，切开大鼠皮肤取出其肝脏，在肝脏处制造直径为6mm的圆形伤口，使用实施例1中得到的结构蛋白/透明质酸复合胶体凝胶，以实施例1中胶体凝胶为例，将1mL生理盐水与0.3g复合颗粒共混得到胶体凝胶，将胶体凝胶注射至小鼠肝脏的1圆形损伤处，利用工具将具有粘性的凝胶轻轻涂抹在缺损处，如图15a所示，待伤口不再出血后闭合伤口，重新闭合伤口7天之后，重新观察术后的肝脏组织。如图15b所示，凝胶可以稳定粘合在肝脏伤口处，并且肝脏伤口部位没有和周围组织形成粘连。

实施例19

健康雄性小鼠购于长春长生生物科技有限责任公司，动物房饲养一周后待用，用浓度为1g/mL的水合氯醛，按1mL水合氯醛/300g体重将健康小鼠麻醉，用剃毛器将小鼠背部两侧毛剃光以漏出皮肤，俯卧位置于手术板上，固定其四肢，并用碘伏溶液进行消毒。按照实施例8所述方法制备质量浓度为30w/v％的不同交联度的结构蛋白/透明质酸复合颗粒胶体凝胶(交联倍数分别为0.5倍、1倍、2倍和4倍)，分别以21G注射器两侧皮下注入胶体凝胶各100μL；随后将小鼠置于热毯上1h，待其苏醒后放回笼中饲养，饲养30天、60天、90天后统一处死，取出植入材料进行称重，以评估材料体内降解性能。

对比例5

为了对比不同纳米颗粒的体内降解性能，制备基于纯透明质酸的纳米颗粒：称取1g透明质酸粉末，溶解于100ml去离子水中，得到透明质酸水溶液(浓度为1％)，升温溶解后，将溶液温度保持在35℃，调溶液pH至10，加入380mL丙酮，并快速搅拌，使多糖分子缓慢脱水卷曲形成纳米级球体。随后加入与透明质酸中羧基等摩尔倍数的己二酸二酰肼(ADH)和EDC，继续搅拌10hrs。用氢氧化钠将颗粒悬浮液pH调节至7后，多次离心清洗颗粒，得到产物即为纯透明质酸纳米颗粒，命名为HA NPs。

采用上述HA NPs和对比例1中的Pr NPs分别配置30％的胶体凝胶，之后按照实施例11所述方法评估材料的体内降解性能。表24为系列交联度结构蛋白/透明质酸复合颗粒(CNPs)、纯透明质酸纳米颗粒(HA NPs)和纯结构蛋白纳米颗粒(Pr NPs)植入小鼠皮下不同时间后的降解率，可以看出，Pr NPs组、HA NPs组和CNPs组在植入90天后的降解率分别为100％、56％、15～85％，Pr组的降解率明显高于HA NPs组和CNPs组，这可能与动物体内蛋白类降解酶的含量较高，透明质酸酶含量较少有关；并且对于CNPs组，随着交联程度的升高，其降解速率逐渐变缓，说明本发明中的复合纳米颗粒可通过调节其交联程度控制其降解周期，进而满足各种修复周期的组织修复场景。

表24

Claims (10)

1.一种复合蛋白微纳米颗粒，其特征在于，所述复合蛋白颗粒由结构蛋白和透明质酸复合而成，或由改性结构蛋白和透明质酸复合而成，或由结构蛋白和改性透明质酸复合而成，或由改性结构蛋白和改性透明质酸复合而成；复合蛋白颗粒的尺寸范围是20nm～5μm；表面电荷为-70～20mv；复合颗粒中结构蛋白和透明质酸两相的质量之比为0.2～4；

优选地，所述结构蛋白包括纯结构蛋白及其衍生物，纯结构蛋白包括胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、角蛋白、蚕丝蛋白、蛛丝蛋白、角蛋白、蛋白聚糖、蛋白多肽；所述结构蛋白衍生物为功能化基团对结构蛋白进行修饰，所述功能化基团包括烷基、氨基、羧基、磺酸基、氰基化、嗪基、环氧基、叠氮基、巯基、咪唑基、四唑基、邻硝基苄基、环糊精基、二茂铁基、偶氮苯基、金刚烷基、螺吡喃基、嘧啶基、硼酯基、多巴胺、儿茶酚、没食子酸、单宁酸、酪胺、呋喃基、马来酰亚胺基、嘧啶碱基、嘌呤碱基；生物素、结合素；促旋酶、香豆霉素，荧光基团，染料基团；所述结构蛋白或多肽的分子量范围为1～500kDa；

所述透明质酸为纯透明质酸及其衍生物，所述透明质酸衍生物为功能化基团对纯透明质酸进行修饰，功能化基团包括：烷基、酰基、氨基、醛基、磺酸基、氰基、嗪基、酰肼基、环氧基、叠氮基、巯基、咪唑基、四唑基、邻硝基苄基、环糊精基、二茂铁基、偶氮苯基、金刚烷基、螺吡喃基、嘧啶基、硼酯基、多巴胺、儿茶酚、没食子酸、单宁酸、酪胺、呋喃基、马来酰亚胺基、嘧啶碱基、嘌呤碱基、生物素、结合素；促旋酶、香豆霉素，荧光基团，染料基团；

优选地，所述改性结构蛋白为可共价交联的改性结构蛋白，由化合物与结构蛋白分子中的羟基和氨基发生反应得到，所述改性透明质酸为可共价交联的改性透明质酸，由化合物与透明质酸分子链羟基发生反应得到，所述化合物为丙烯酸酐、丙烯酰氯、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、乙基丙烯酸酐、乙基丙烯酰氯、羟基丙烯酸酐、羟基丙烯酰氯、异冰片基丙烯酸酐、异冰片基丙烯酰氯、烯丙基异氰酸酐、烯丙基异氰酰氯中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的复合蛋白微纳米颗粒，其特征在于，所述微纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

(1)当结构蛋白和透明质酸未改性时：

将结构蛋白和透明质酸直接溶解在20～80℃的水性溶液中，其中结构蛋白的浓度为0.1～20w/v％，透明质酸的浓度为0.1～20w/v％，结构蛋白与透明质酸的混合质量比为0.1～10，完全溶解后，用酸或碱将溶液pH调至6～14，得到结构蛋白/透明质酸混合水溶液；

当结构蛋白和透明质酸改性时：

将可共价交联的改性结构蛋白和透明质酸，或结构蛋白和可共价交联的改性透明质酸，或可共价交联的改性结构蛋白和可共价交联的改性透明质酸溶解在水性溶液中，其中结构蛋白的浓度为0.1～20w/v％，透明质酸的浓度为0.1～20w/v％，结构蛋白与透明质酸的混合质量比为0.1～10，完全溶解后，将溶液温度调整并保持在20～80℃，用酸或碱将溶液pH调至6～14，得到结构蛋白/透明质酸混合水溶液；优选地，可共价交联的改性结构蛋白的制备为将结构蛋白在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为0.1～10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入与结构蛋白分子链羟基和氨基发生反应的化合物，得到可共价交联的结构蛋白化合物；可共价交联的改性透明质酸的制备为将透明质酸在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为0.1～10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入与透明质酸分子链羟基发生反应的化合物，得到可共价交联的结构蛋白化合物；

(2)将上述溶液温度维持在20～80℃、搅拌速度为100～1000rpm，将极性有机溶剂滴加至上述结构蛋白/透明质酸水溶液中，得到结构蛋白/透明质酸复合颗粒的悬浊液，之后继续搅拌1～3h；优选地，所述极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的组合，更优选地，加入极性有机溶剂的体积是结构蛋白/透明质酸混合水溶液体积的1～10倍。

(3)向悬浊液中加入结构蛋白/透明质酸大分子的交联剂，继续反应1～12h；反复离心、清洗得到结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒分散液，并将上述复合颗粒分散液冷冻干燥得到复合颗粒粉末。

3.一种复合蛋白水凝胶材料，其特征在于：

所述水凝胶材料由权利要求1所述的复合微球颗粒为基本结构单元，通过复合微球颗粒间的静电作用、氢键作用、疏水作用可逆自组装形成连续、多孔颗粒网络，实现可注射、可打印、自修复性能；其中复合颗粒的尺寸范围是20nm～5μm；表面电荷为-70～20mv；复合颗粒中结构蛋白和透明质酸两相的质量之比为0.2～4；所述颗粒组装的水凝胶材料中颗粒占水凝胶总体积的体积分数为10～120v/v％，质量分数为5～70％；所得颗粒水凝胶的压缩弹性模量为0.1kPa～100kPa；

当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，再进一步通过引发共价键交联形成非共价键和共价键双重交联的颗粒水凝胶。

4.根据权利要求3所述的复合蛋白水凝胶材料，其特征在于：

以权利要求2步骤(3)中的结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒分散液进行离心，得到浓缩物，即得具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料；或将权利要求2步骤(3)中的复合颗粒粉末与水性溶液均匀共混，得到具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料；

当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，将具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料进一步加入化学引发剂或光交联剂引发自由基聚合，使改性复合颗粒之间发生共价交联进一步得到力学增强的、非共价键和共价键共同交联的复合颗粒组装形成水凝胶材料；

优选地，所述水性溶液为含有生物活性物质的溶液，生物活性物质为维生素，氨基酸，矿物元素，微生态调节剂，生长因子或血液；

优选地，结构蛋白/透明质酸复合微、纳米颗粒分散液及水性溶液中可直接添加其他无机/有机纳米颗粒，纳米颗粒包括：二氧化硅纳米颗粒、硅酸镁锂纳米颗粒、纳米黏土颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、氧化铁磁性纳米颗粒、钛酸钡纳米颗粒、石墨烯纳米片、碳纳米管、生物玻璃纳米颗粒、黑磷纳米片、聚乳酸纳米颗粒、聚乙烯纳米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒中的一种或几种；纳米颗粒的尺寸为10nm-5μm。

5.一种核壳结构复合蛋白微纳米颗粒，其特征在于，以纳米颗粒作为核，以权利要求1所述的复合蛋白微球颗粒为壳；复合颗粒的尺寸范围是20nm～5μm；表面电荷为-70～20mv；复合颗粒中结构蛋白和透明质酸两相的质量之比为0.2～4；优选地，所述成核纳米颗粒选自二氧化硅纳米颗粒、硅酸镁锂纳米颗粒、纳米黏土颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、氧化铁磁性纳米颗粒、钛酸钡纳米颗粒、石墨烯纳米片、碳纳米管、生物玻璃纳米颗粒、黑磷纳米片、丝素蛋白纳米颗粒、聚乳酸纳米颗粒、聚乙烯纳米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒中的一种或几种；成核纳米颗粒的尺寸为10nm～1μm。

6.根据权利要求5所述的一种核壳结构复合蛋白微纳米颗粒，其特征在于，所述微球颗粒制备方法，包括如下步骤：

(1)当结构蛋白和透明质酸未改性时：

将结构蛋白和透明质酸溶解在20～80℃的水性溶液中其中，结构蛋白的浓度为0.1～20w/v％，透明质酸的浓度为0.1～20w/v％，结构蛋白与透明质酸的混合质量比为0.1～10，完全溶解后，用酸或碱将溶液pH调至6～14，之后加入成核纳米颗粒悬浮液，得到结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒混合水溶液，其中成核纳米颗粒的浓度为0.1～50w/v％；

当结构蛋白和透明质酸改性时：

将可共价交联的改性结构蛋白和透明质酸，或结构蛋白和可共价交联的改性透明质酸，或可共价交联的改性结构蛋白和可共价交联的改性透明质酸溶解在水性溶液中，其中结构蛋白的浓度为0.1～20w/v％，透明质酸的浓度为0.1～20w/v％，结构蛋白与透明质酸的混合质量比为0.1～10，完全溶解后，将溶液温度调整并保持在20～80℃，用酸或碱将溶液pH调至6～14，之后加入成核纳米颗粒悬浮液，得到结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒混合水溶液，其中成核纳米颗粒的浓度为0.1～50w/v％；优选地，可共价交联的改性结构蛋白的制备为将结构蛋白在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为0.1～10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入与结构蛋白分子链羟基和氨基发生反应的化合物，得到可共价交联的结构蛋白化合物；可共价交联的改性透明质酸的制备为将透明质酸在30～60℃下溶解在水性溶液中，得到浓度为0.1～10w/v％的水溶液；向上述溶液中加入与透明质酸分子链羟基发生反应的化合物，得到可共价交联的结构蛋白化合物；

(2)将极性有机溶剂滴加到步骤(1)得到的结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒混合水溶液中，得到结构蛋白/透明质酸复合材料微、纳米颗粒的悬浊液，之后稳定1～3h；优选地，所述极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的组合，更优选地，加入极性有机溶剂的体积是结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒混合水溶液体积的1～10倍；

(3)保持温度在20～80℃、搅拌速度为100～1000rpm，向悬浊液中加入结构蛋白/透明质酸大分子的交联剂，继续反应1～12h；反复离心、清洗得到结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒复合微、纳米颗粒分散液，并将上述复合颗粒分散液冷冻干燥得到复合颗粒粉末。

7.一种核壳结构复合蛋白水凝胶材料，其特征在于：所述水凝胶材料由权利要求3所述的复合微球颗粒为基本结构单元，通过复合微球颗粒间的静电作用、氢键作用、疏水作用可逆自组装形成连续、多孔颗粒网络，实现可注射、可打印、自修复性能；复合颗粒的尺寸范围是20nm～5μm；表面电荷为-70～20mv；复合颗粒中结构蛋白和透明质酸两相的质量之比为0.2～4；所述颗粒组装的水凝胶材料中颗粒占水凝胶总体积的体积分数为10～120v/v％，质量分数为5～70％；所得颗粒水凝胶的压缩弹性模量为0.1kPa～100kPa；

当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，再进一步通过引发共价键交联形成非共价键和共价键双重交联的颗粒水凝胶。

8.根据权利要求7所述的核壳结构复合蛋白水凝胶材料，以权利要求6步骤(3)中的结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒复合微、纳米颗粒分散液进行离心，得到浓缩物，即得具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料；或将权利要求2步骤(3)中的复合颗粒粉末与水性溶液均匀共混，得到具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料；

当所述结构蛋白为改性结构蛋白，所述透明质酸为改性透明质酸时，将具有可注射、可打印、自修复性能的胶体凝胶材料进一步加入化学引发剂或光交联剂引发自由基聚合，使改性复合颗粒之间发生共价交联进一步得到力学增强的、非共价键和共价键共同交联的复合颗粒组装形成水凝胶材料；

优选地，所述水性溶液为含有生物活性物质的溶液，生物活性物质为维生素，氨基酸，矿物元素，微生态调节剂，生长因子或血液；

优选地，结构蛋白/透明质酸/成核纳米颗粒复合微、纳米颗粒分散液及水性溶液中可直接添加其他无机/有机纳米颗粒，纳米颗粒包括：二氧化硅纳米颗粒、硅酸镁锂纳米颗粒、纳米黏土颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、氧化铁磁性纳米颗粒、钛酸钡纳米颗粒、石墨烯纳米片、碳纳米管、生物玻璃纳米颗粒、黑磷纳米片、聚乳酸纳米颗粒、聚乙烯纳米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒中的一种或几种；纳米颗粒的尺寸为10nm-5μm。

9.根据权利要求2或6所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中所述的结构蛋白/透明质酸大分子的交联剂为碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、甲醛、乙醛、甘油醛、芳草醛、戊二醛、丁二醛、京尼平、二缩水甘油醚、二环氧烷、二乙烯基砜类、多官能氮丙啶、二异氰酸酯中的一种或几种；优选地，所述交联剂的添加量与被交联基团的含量相关，具体添加量如下所示，其中R₁、R₂和R₃分别表示结构蛋白主链上的游离羧基、羟基和伯胺基，R₁′和R₂′分别表示透明质酸主链上的游离羧基和羟基；

当被交联基团为R₃/R₁′时，交联剂为碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，交联剂与R₁′物质的量之比为：0.05～20；与R₃物质的量之比为：0.01～5；

当被交联基团为R₂/R₂′或R₃/R₂′时，交联剂为甲醛、乙醛、甘油醛、芳草醛、戊二醛、丁二醛、京尼平、二缩水甘油醚、二环氧烷、二乙烯基砜类、二异氰酸酯，交联剂与R₂′物质的量之比为：0.05～20；与R₂物质的量之比为：0.01～7；与R₃物质的量之比为：0.01～5；

当被交联基团为R₁/R₁′时，交联剂为多官能氮丙啶，交联剂与R₁′物质的量之比为：0.05～20；与R₁物质的量之比为：0.01～5。

10.权利要求3或7所述的水凝胶材料在制备含有药物成分的载体或支架中的应用，应用于骨组织、软骨组织、肌肉、血管的创伤或缺损的修复填充；所述药物成分为维生素、氨基酸、矿物元素、微生态调节剂、生长因子、小分子药物、蛋白大分子药物、核酸类药物(如mRNA)、抗生素类药物、激素类药物、麻醉剂类药物、抗病毒药物，抗菌药物，抗癌药物、免疫调节药物或活细胞的一种或多种组合；

或在制备浅层皮肤及皮下填充物的应用；优选在整形美容手术中；优选地，应用时，将结构蛋白/透明质酸胶体颗粒与水性溶液共混得到胶体凝胶，将上述凝胶直接注射至浅层皮肤或皮下区域，结构蛋白/透明质酸复合颗粒在非共价键作用下可逆自组装形成连续多孔颗粒网络；

或在制备载细胞打印的生物打印墨水的应用，优选地，应用时，将胶体颗粒与水性溶液共混得到胶体凝胶，再与细胞悬浮液混合得到载细胞胶体凝胶，将上述墨水通过挤出或喷墨3D打印方式，获得具有3D结构的支架，得到载细胞打印支架；

或在制备骨/软骨修复填充材料或药物的应用；优选地，应用时，将结构蛋白/透明质酸胶体颗粒与水性溶液共混得到胶体凝胶，上述凝胶直接注射至骨/软骨缺损区域，结构蛋白/透明质酸复合颗粒在非共价键作用下可逆自组装形成连续多孔颗粒网络，在骨缺损部位稳定停留，作为骨修复和再生的支架材料；

或在制备术后创面封闭及皮肤修复材料或药物的应用；或在制备术后创面封闭、口腔溃疡材料或药物的应用；或在制备组织液渗漏封堵、肠漏封堵材料或药物的应用；或在制备组织液渗漏封堵、手术缝合材料或药物的应用；或在制备止血材料或药物的应用，优选肝脏止血材料、骨断面止血材料、动脉止血材料或心脏止血材料或药物的应用；或在制备作为术后防粘连凝胶的应用。

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