CN111040205A - 一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双网络设计的聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶及其制备方法。本发明使用可对网络消散能量的明胶颗粒，保持水凝胶结构完整性的聚乙二醇高分子，基于双网络的设计形成具有高机械性能水凝胶材料；在高分子网络未形成时，胶体凝胶之间的可逆物理相互作用赋予了水凝胶剪切变稀和自修复优异性能，高分子网络形成之后，水凝胶的机械性能显着增强，并具有可印刷性和生物相容性，在组织工程和再生医学中具有巨大的应用潜力。

Description

一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于材料科学、生物医用材料领域，涉及由微米或纳米颗粒和聚乙二醇基高分子组装成的、高强度、可打印的双网络水凝胶，具体是一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
胶体凝胶是基于自下而上设计理念，以微、纳米胶体颗粒为基本单元通过物理或化学“交联”，形成具有精细微观结构和稳定宏观结构的新型水凝胶材料。微、纳米胶体颗粒间通过氢键、静电、亲疏水等物理相互作用组装形成胶体网络。颗粒之间的物理相互作用使胶体凝胶具有可注射，自修复的优异力学性能，其可作为可注射填充材料用于微创手术、还可作为3D 生物打印墨水用于生物制造。同时，由于胶体凝胶以微纳米尺寸的结构为基础，其可作为药物/蛋白加载和释放的载体，从而使得胶体凝胶在药物缓释领域具有潜在应用。然而，传统的胶体凝胶仅仅通过物理相互作用组装而成，这导致其宏观的力学强度不高，在组织修复上无法满足承力组织或器官的修复，同时作为生物打印墨水得到的支架力学性能较弱，这限制了胶体凝胶材料在生物医学领域的进一步应用。
为解决传统的胶体凝胶力学强度差的问题，双网络水凝胶的设计策略提供了新的手段。双网络水凝胶是一类具有高机械强度和韧性的水凝胶材料。其通过将两种可独立形成水凝胶网络的高分子复合在同一水凝胶中实现优异的机械性能。目前报道的双网络水凝胶往往基于高分子组成，不具有可注射的性能，这不满足组织填充材料和生物打印墨水对材料的要求。因此，设计出具有高力学强度，优异的生物学性能，可打印和注射的胶体凝胶类材料仍是当今的技术空白。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶及其制备方法。实现了胶体凝胶材料可注射，可打印的高机械强度和优异生物相容性
本发明一方面提供了一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，所述制备方法为下述两种方法中的一种：
方法一、将构成第一重网络的聚合物单体溶解在水性溶液中与构成第二重网络的明胶颗粒共混，加入引发剂后混合均匀得到预聚合胶体凝胶，第一重网络单体聚合反应固化从而将构成第二重网络的明胶颗粒包封在第一重网络中，即得到所述双网络水凝胶；
方法二、将构成第一重网络的聚合物单体溶解在构成第二重网络的明胶颗粒悬浮液中，冷冻干燥，得到双网络水凝胶预聚合粉末，再加入引发剂和水性溶液后混合均匀，第一重网络单体聚合反应固化从而将第二重网络的明胶颗粒包封在第一重网络中，得到所述双网络水凝胶；
其中，所述构成第一重网络的聚合物单体是端基修饰有引发聚合反应的基团的聚乙二醇基高分子，浓度为0.02-1g/mL；聚乙二醇基高分子为直链的或多支化的聚乙二醇基高分子中的一种或几种的组合，所述聚乙二醇的分子量为0.1kDa-100kDa；
所述构成第二重网络的胶体网络明胶颗粒尺寸为50nm～500μm；明胶颗粒表面电荷为 -40～20mV；所述构成第二重网络的胶体网络明胶颗粒的体积分数为
Figure RE-GDA0002386588650000021
明胶颗粒和聚乙二醇混合时的质量比例为0.1～10:1。
上述一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，所述明胶颗粒的交联度范围：当交联反应是基于明胶氨基基团时，交联反应体系中交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比 0.1～10；当交联反应是基于明胶氨基和羧基基团时，交联剂与氨基基团的摩尔比为0.1～10。
上述一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，所述构成第一重网络的聚乙二醇基高分子的端基修饰的引发聚合反应的基团选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、烯丙基异氰酸酯、氨基/醛基、叠氮化物/炔烃、巯基/双键、双烯/单烯中的一种或几种的组合。
上述一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，所述聚合反应为自由基聚合反应时，为紫外光诱导聚合反应或化学引发剂诱导聚合反应。
具体的，上述一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，所述紫外光诱导聚合反应固化的引发剂选自2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2-甲基-2-(4- 吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-二甲氨基-2-苄基-1-[4-(4-吗啉基)苯基]-1-丁酮、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2- 羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮、苯甲酰甲酸甲酯中的一种或几种的组合，浓度为0.0025-0.05g/mL；所述紫外光诱导聚合反应的条件为：波长为200-400nm，紫外光强度为10-500mW/cm2，时间为1-200s；所述化学引发剂诱导聚合反应固化的引发剂选自氧化二苯甲酰、叔丁基过氧化氢、过硫酸铵/四甲基亚胺中的一种或多种，浓度为0.0001-0.02g/mL。
本发明另一方面提供了一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶，所述双网络水凝胶由上述方法制备得到。
本发明第三方面提供了上述基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的应用。
具体的，基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶作为3D生物打印墨水、细胞载体、人工细胞外基质的应用；将悬浮有细胞的水性溶液与含有第一重网络单体的明胶胶体凝胶混合后进行三维生物打印成特定结构后，交联第一重网络形成双网络水凝胶以实现高强度载细胞支架打印。
具体的，基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶作为药物缓释载体实现药物的控制释放，其中药物可以是蛋白类药物，抗生素或生物活性因子。
具体的，基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶在组织工程支架材料中的应用，用于组织修复填充为用于骨组织、软骨组织、肌肉、或血管组织缺损的修复填充。
本发明以聚乙二醇和明胶颗粒为基本机构单元构建了双网络水凝胶，明胶颗粒具有优异的生物相容性以及RGD多肽序列为细胞提供黏附位点，并且可以组装形成胶体凝胶网络。明胶颗粒表面具有带有正电荷的氨基和负电荷的羧基和羟基，通过引入带有电中性的聚乙二醇高分子避免与明胶颗粒混合时因为静电或氢键相互作用，导致相分离或者团聚影响双网络水凝胶的结构。
本发明的有益效果：
1.本发明通过控制明胶颗粒和聚合物高分子得到双网络水凝胶，以可交联聚合物通过共价交联形成的网络作为第一重网络，以明胶胶体颗粒作为第二重网络，首次将柔性微纳米颗粒作为网络引入，构建双网络水凝胶，在第一重网络未交联时，材料具有可注射，自修复的力学性能，使其可作为组织填充材料用于组织修复和生物打印墨水，通过控制聚合交联聚乙二醇网络后，得到的双网络水凝胶具有稳定和优异的力学强度，实现高强度机械性能。本发明拓展了单纯的胶体凝胶材料作为可注射材料和生物打印墨水应用范围，并且提高了传统的生物打印墨水的力学性能，实现了高强度生物打印墨水的开发。
2.双网络的水凝胶结构赋予水凝胶增强、增韧的效果：本发明首次报道基于明胶胶体颗粒和聚乙二醇水凝胶形成的复合水凝胶，由于明胶胶体颗粒间的非共价键作用具有“可逆性”，使得第一重胶体水凝胶网络在受剪切力作用时发生剪切变稀行为，而当外力取消后胶体凝胶网络可重新自组装恢复胶体网络结构，因此表现出快速自修复的效应。正是这些动态的“可逆键”构成的胶体网络，可在明胶胶体颗粒/聚乙二醇双网络水凝胶体系受较高压力或者拉力作用时，通过“可逆键”动态的断裂和重建实现对外力产生的破坏能量的吸收和耗散，使得明胶胶体颗粒/聚乙二醇双网络水凝胶的力学强度显著提高。
3.本发明得到的明胶纳米颗粒/聚乙二醇双网络水凝胶具有显著提高的力学强度，与单纯聚乙二醇构成的水凝胶压缩断裂强度相比，双网络水凝胶的压缩弹性模量大于1MPa，是聚乙二醇形成的水凝胶的近20倍；并且与单纯明胶纳米颗粒构成的胶体压缩断裂强度相比，是其 100倍。同时，双网络水凝胶的拉伸屈服应变大于50％，与聚乙二醇类似，是单纯明胶纳米颗粒构成的胶体水凝胶的5倍。双网络水凝胶可承受>90％的压缩形变，显著高于纯聚乙二醇水凝胶或纯明胶胶体凝胶材料。
4.明胶纳米胶体颗粒构成的凝胶网络赋予双网络水凝胶可注射、可塑性的特点：基于明胶胶体凝胶剪切变稀，自修复的力学特征。通过可控交联水凝胶中的聚乙二醇网络形成第二重网络。双网络互穿结构使得明胶/聚乙二醇复合水凝胶具有更加优异的机械性能，拓展此前基于聚乙二醇和明胶体系生物材料的应用范围；
5本发明所述明胶胶体凝胶生物材料，因其微纳米尺度的粒径而具有高比表面积；且明胶高分子链有大量带电荷基团而易与蛋白药物形成静电吸附；同时明胶胶体颗粒是微纳米粒径的水凝胶多空网络，因此蛋白因子易渗透入凝胶网络中而实现缓释。因此具有较传统块体材料的水凝胶或多孔支架具有更优的蛋白药物加载和缓释效果；
6.本发明所得的双网络结构、增强、增韧水凝胶生物医用材料制备方法简便，是用于人体组织器官缺损重建的充填修复、再生的理想可注射、可塑形生物医用材料，可作为可注射材料用于人体组织/器官修复填充、可注射止血凝胶、促血管修复再生材料、骨、软骨、脂肪、肌肉等组织修复再生的植入材料领域。同时可作为载细胞的三维可注射凝胶支架和3D打印支架用于组织工程和再生医学的应用。
附图说明
图1是实施例2预聚合胶体凝胶粘度随剪切速率变化趋势图；
图2是实施例2预聚合胶体凝胶模量经受剪切应变后恢复曲线图；
图3是实施例2中双网络水凝胶，聚乙二醇高分子网络聚合过程，双网络水凝胶模量的变化；
图4是实施例2和对比例2双网络水凝胶和明胶胶体凝胶微观结构的扫描电镜图；
图5是实施例9和对比例3中通过原子力显微镜测试的明胶纳米颗粒在0.6kDa，20kDa聚乙二醇高分子介质中力位移曲线；
图6是实施例10中明胶颗粒组装成网络结构的共聚焦显微镜图片；
图7是实施例11中双网络水凝胶压缩至80％形变后，快速恢复过程的光学图像，表明其具有高弹性；
图8是实施例12中双网络水凝胶胶拉伸前后光学图像表明其具有高拉伸性能；
图9是实施例13中打印支架的力学性能；a.0.6kDa聚乙二醇/明胶颗粒；b.20kDa聚乙二醇/明胶颗粒；
图10是实施例14中双网络水凝胶作为载小鼠间充质干细胞支架细胞培养实验结果；
图11是实施例15中双网络水凝胶的红外光谱曲线；
图12是实施例16中双网络水凝胶植入小鼠背部后的HE染色切片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
(1)明胶颗粒的制备
5g A型明胶溶解在100mL去离子水溶液中，并保持加热到40℃，得到澄清透明的明胶水溶液，滴加盐酸将溶液pH值调节至2.5，分别将240,350mL的丙酮溶液滴加至上述明胶水溶液中并保持加热40℃和持续搅拌(1000rpm)，滴加总时间为20min，向上述纳米颗粒悬液中加入74μL的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联时间12hrs，待反应结束后，向混合物中加入 100mM浓度的甘氨酸，终止未反应完全的戊二醛的端基。将纳米颗粒悬浮液反复离心和在去离子水中重悬。将悬浊液在-60℃下冷冻干燥，得到明胶纳米颗粒干粉。
通过纳米粒度仪测试明胶颗粒的颗粒尺寸和表面电荷。(表1)
表1
不良溶剂添加量 240mL丙酮 350mL丙酮
颗粒尺寸 200nm 1000nm
表面电荷 +8.5mV +8.1mV
(2)聚乙二醇聚合基团
使用分子量为0.6kDa和20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯(购买自中国西格玛-奥德里奇化学试剂公司)
(3)将0.1g分子量分别为0.6,20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g的2-羟基-4′-(2- 羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL水性溶液中与0.1g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到可注射，自修复预聚合胶体凝胶；
(4)上述预聚合胶体凝胶在365nm，50mw/cm2紫外光下交联30s，得到双网络水凝胶。
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表2)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。其中明胶颗粒的尺寸和聚乙二醇二丙烯酸酯的分子量均对水凝胶的力学性能产生影响。
表2
Figure RE-GDA0002386588650000061
实施例2 调控明胶浓度
(1)明胶颗粒的制备
使用实施例1制备的正电荷明胶纳米颗粒。
(2)聚乙二醇聚合基团的接枝
使用分子量为0.6kDa和20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯(购买自中国西格玛-奥德里奇化学试剂公司)
(3)分别将0.1g的0.6kDa和20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g的2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL水性溶液中与0.2g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到预聚合胶体凝胶，其可注射和自修复性能如图1,2所示，图1表明在未形成高分子网络时，预聚合胶体凝胶具有剪切变稀的力学性能，且光学图像表明其具有优异的可注射性能，图2表明在未形成高分子网络时，预聚合胶体凝胶具有自修复的力学性能，且光学图像表明水凝胶的自修复性能。
(4)上述预聚合胶体凝胶在365nm，50mw/cm2紫外光下交联30s，得到双网络水凝胶，成胶过程中凝胶强度通过流变仪监控如图3所示，随着第二重聚合物网络的交联，水凝胶的储能模量和损耗模量显著增加。形成的双网络水凝胶的微观结构如图4所示，可以观察到多空聚合物网络的内部分布着相互堆积的明胶颗粒；
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表3)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。
表3
Figure RE-GDA0002386588650000071
实施例3 调控聚乙二醇浓度
(1)明胶颗粒的制备
使用实施例1制备的正电荷明胶纳米颗粒。
(2)聚乙二醇聚合基团的接枝
使用分子量为0.6kDa和20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯(购买自中国西格玛-奥德里奇化学试剂公司)
(3)分别将0.05g的0.6kDa,20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g的2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL水性溶液中与0.2g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到可注射，自修复预聚合胶体凝胶；
(4)上述预聚合胶体凝胶在365nm，50mw/cm2紫外光下交联30s，得到双网络水凝胶。
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表4)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。
表4
Figure RE-GDA0002386588650000072
对比例1聚乙二醇二丙烯酸酯不同浓度分子量
使用分子量为0.6kDa和20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯(购买自中国西格玛-奥德里奇化学试剂公司)
将0.05g和0.1g分子量为0.6,20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g的2-羟基-4’-(2- 羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL水性溶液中；在365nm，50mw/cm2紫外光下交联30s，得到聚乙二醇水凝胶。
上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表5)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。
表5
Figure RE-GDA0002386588650000081
实施例4
(1)明胶颗粒的制备
5g B型明胶溶解在100mL去离子水溶液中，并保持加热到40℃，得到澄清透明的明胶水溶液，滴加盐酸将溶液pH值调节至2.5，分别将300,380mL的丙酮溶液滴加至上述明胶水溶液中并保持加热40℃和持续搅拌(1000rpm)，滴加总时间为20min，向上述纳米颗粒悬液中加入74μL的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联时间12hrs，待反应结束后，向混合物中加入 100mM浓度的甘氨酸，终止未反应完全的戊二醛的端基。将纳米颗粒悬浮液反复离心和在去离子水中重悬。将悬浊液在-60℃下冷冻干燥，得到明胶纳米颗粒干粉。
通过纳米粒度仪测试明胶颗粒的颗粒尺寸和表面电荷。(表6)
表6
不良溶剂添加量 300mL丙酮 380mL丙酮
颗粒尺寸 200nm 1000nm
表面电荷 -18.5mV -16.1mV
(2)聚乙二醇聚合基团
使用分子量为0.6kDa和20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯(购买自中国西格玛-奥德里奇化学试剂公司)
(3)将0.1g得到的0.6,20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g的2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2- 甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL水性溶液中与0.2g上述明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到可注射，自修复预聚合胶体凝胶；
(4)上述预聚合胶体凝胶在365nm,50mw/cm2紫外光下交联30s，得到双网络水凝胶。
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表7)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。且与表面带有正电荷的A型明胶相比，相同质量分数下，得到的双网络水凝胶的强度略微增加。
表7
Figure RE-GDA0002386588650000091
对比例2明胶纳米颗粒
使用实施例1，4制备的明胶粉末0.1和0.2g，分别与1mL水性溶液混合通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次得到明胶胶体凝胶，胶体凝胶的微观结构如图4所示。
上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表8)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。与实施例2中双网络水凝胶相比单纯的明胶胶体凝胶的力学性能明显降低。
表8
Figure RE-GDA0002386588650000092
实施例5 多臂结构
(1)明胶颗粒的制备
使用实施例1制备的正电荷明胶纳米颗粒。
(2)聚乙二醇聚合基团的接枝
使用分子量为20kDa的四臂聚乙二醇二丙烯酸酯(购买自中国赛诺邦格生物科技有限公司)
(3)将0.1g得到的20kDa的四臂聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g的2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL水性溶液中与0.2g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到可注射，自修复预聚合胶体凝胶；
(4)上述预聚合胶体凝胶在365nm，50mw/cm2紫外光下交联30s，得到双网络水凝胶。
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表9)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。
表9
200nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 77.3kPa 68.9kPa
损耗模量 5.24kPa 4.78kPa
压缩应变 0.91 0.92
断裂强度 1623kPa 1422kPa
实施例6 叠氮化物/炔烃
(1)明胶颗粒的制备
使用实施例1制备的正电荷明胶纳米颗粒。
(2)聚乙二醇聚合基团的接枝
使用分子量为20kDa的叠氮端基修饰聚乙二醇和炔烃修饰聚乙二醇(购买自中国厦门赛诺邦格生物科技有限公司)
(3)将0.05g的20kDa的叠氮端基修饰聚乙二醇和0.05g的20kDa炔烃修饰聚乙二醇以相同质量比在水性溶液混合均匀，再与0.2g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，室温等待1hrs，等到双网络水凝胶；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表10)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。
表10
200nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 30.1kPa 28.6kPa
损耗模量 1.4kPa 1.3kPa
压缩应变 0.89 0.91
断裂强度 673.3kPa 621.9kPa
实施例7 调控聚合方式化学交联
(1)明胶颗粒的制备
使用实施例1制备的正电荷明胶纳米颗粒。
(2)聚乙二醇聚合基团的接枝
使用分子量为0.6kDa和20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯(购买自中国西格玛-奥德里奇化学试剂公司)
(3)将0.1g的0.6,20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g过硫酸铵，0.004g四甲基亚胺溶解在1mL水性溶液中并与0.2g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，室温等待1hrs，过硫酸铵和四甲基亚胺诱导烯烃的自由基聚合使得聚乙二醇网络的交联得到双网络水凝胶。
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表11)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。与光交联的成胶方式相比，使用化学交联成胶得到的双网络水凝胶的强度类似。
表11
Figure RE-GDA0002386588650000111
实施例8 共同混合的方式
(1)明胶颗粒的制备
5g A型明胶溶解在100mL去离子水溶液中，并保持加热到40℃，得到澄清透明的明胶水溶液，滴加盐酸将溶液pH值调节至2.5，分别将240mL的丙酮溶液滴加至上述明胶水溶液中并保持加热40℃和持续搅拌(1000rpm)，滴加总时间为20min，向上述纳米颗粒悬液中加入74μL 的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联时间12hrs，待反应结束后，向混合物中加入100mM 浓度的甘氨酸，终止未反应完全的戊二醛的端基。将纳米颗粒悬浮液反复离心和在去离子水中重悬。将50mL的20mg/mL的明胶纳米颗粒悬浊液中分别加入分子量为0.6kDa和20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯(购买自中国西格玛-奥德里奇化学试剂公司)1g，搅拌24h后，在-60℃下冷冻干燥，得到明胶纳米颗粒/聚乙二醇二丙烯酸酯混合干粉。
(2)将0.2明胶纳米颗粒/聚乙二醇二丙烯酸酯混合干粉和0.005g的2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL水性溶液中通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到可注射，自修复预聚合胶体凝胶；
(3)上述预聚合胶体凝胶在365nm，50mw/cm2紫外光下交联30s，得到双网络水凝胶。
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表12)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。
表12
Figure RE-GDA0002386588650000121
实施例9 原子力显微镜
通过原子力显微镜定量表征明胶纳米颗粒在不同分子量聚乙二醇溶液中相互作用力的区别。具体而言，将金镀层的微悬臂(MLCT，布鲁克仪器公司)在乙醇溶液超声清洗1h，等待微悬臂表面乙醇溶液挥发后，将微悬臂浸泡于食人鱼洗液中，完全清除悬臂表面杂质。微悬臂浸泡在2mL10％的巯基乙酸溶液。进一步将微悬臂浸泡在含有0.1g/mL的EDC和NHS 的明胶纳米颗粒悬浮液中(1mg/mL)反应12hrs。
将硅片浸泡在乙醇溶液中超声1h，待硅片表面干燥后，进一步将硅片浸泡在氨基化硅烷偶联剂溶液中1hrs，再将微悬臂浸泡在含有0.1g/mL的EDC和NHS的明胶纳米颗粒悬浮液中(1mg/mL)反应12hrs。
通过原子力显微镜使用接触模式测试分别修饰在探针上和硅片上的纳米颗粒在相互靠近和离开过程中的力与位移曲线，其中液态接枝为分子量为0.6和20kDa的10mg/mL的聚乙二醇高分子溶液中(分散在pH＝7的Hepes缓冲液)，通过力学曲线的峰值计算明胶纳米颗粒在不同分子量聚乙二醇溶液中的相互作用力大小。结果如图5所示，明胶纳米颗粒在20kDa 聚乙二醇中的相互作用力大于0.6kDa聚乙二醇中的相互作用力，这是因为纳米颗粒之间排空力的大小与聚合物分子的分子量成正比，所以在20kDa的聚乙二醇介质中，明胶颗粒之间的排空力作用更大，进而颗粒之间相互作用越强。
对比例3原子力显微镜
通过原子力显微镜定量表征明胶纳米颗粒再不同分子量聚乙二醇溶液中相互作用力的区别。具体而言，将金镀层的微悬臂(MLCT，布鲁克仪器公司)在乙醇溶液超声清洗1h，等待微悬臂表面乙醇溶液挥发后，将微悬臂浸泡于食人鱼洗液中，完全清除悬臂表面杂质。微悬臂浸泡在2mL10％的巯基乙酸溶液。进一步将微悬臂浸泡在含有0.1g/mL的EDC和NHS 的明胶纳米颗粒悬浮液中(1mg/mL)反应12hrs。
将硅片浸泡在乙醇溶液中超声1h，待硅片表面干燥后，进一步将硅片浸泡在氨基化硅烷偶联剂溶液中1hrs，再将微悬臂浸泡在含有0.1g/mL的EDC和NHS的明胶纳米颗粒悬浮液中(1mg/mL)反应12hrs。
通过原子力显微镜使用接触模式测试分别修饰在探针上和硅片上的纳米颗粒在相互靠近和离开过程中的力与位移曲线，其中液态介质为pH＝7的Hepes缓冲液。
由图5可以看出，实施例9中明胶颗粒在20kDa的聚乙二醇溶中的相互作用力比0.6kDa中的大，实施例9比对比例3中的相互作用力大，说明聚合物网络的加入有利于增加明胶颗粒之间的相互作用，进一步组装形成胶体凝胶网络。
实施例10 荧光共聚焦成像观察聚合过程
使用实施例1-7中制备的明胶颗粒0.1g溶解在10mL去离子水中，加入0.01g异氰酸酯基罗丹明粉末，并在40℃共混搅拌12小时。之后反复离心(8000rpm，10min)并用去离子水重悬，得到荧光标记的明胶颗粒，分散在pH＝6的Hepes缓冲液中。
10mg/mL罗丹明标记明胶纳米颗粒和1mg/mL的0.6kDa和20kDa聚乙二醇高分子共混30 分钟之后，通过激光共聚焦显微镜实时监测聚乙二醇单体诱导胶体网络组装形成的最终结构。
以实施例1中表面电荷为+8mV，颗粒尺寸为200nm的明胶颗粒为例，加入聚乙二醇高分子之后网络组装之后结构如图6所示，可以看到明胶颗粒网络(红色)。与明胶颗粒悬浮液相比，形成的网络结构的链长和链厚度明显增加。图6中的的三幅图说明在聚乙二醇高分子的存在下，颗粒之间会产生排空力，在其诱导下，颗粒会自组装形成胶体凝胶网络。并且在分子量为20kDa的聚乙二醇溶液中组装网络结构的链长和厚度比在0.6kDa聚乙二醇中形成的凝胶网络更大。
实施例11 压缩回复过程
用实施例1-7中制备的聚乙二醇基分子量为20kDa双网络水凝胶，通过在三维打印模具中成型得到圆柱形支架(直径12mm，高8mm)。使用万能力学测试机将双网络水凝胶压缩至自身的0.8倍形变时，快速抬起压缩探头(10mm/s)。以实施例1中双网络水凝胶为例，图7为探头快速抬起过程中双网络水凝胶结构变化的光学图片，双网络水凝胶能快速跟随探头回复，并且结构完整，表明双网络水凝胶具有高弹性。
实施例12 拉伸性能
用实施例1-7中制备的聚乙二醇基分子量为20kDa双网络水凝胶，通过三维打印模具中成胶得到标准单轴拉伸测试样条(根据ISO 527-2标准的5B型设计)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以50mm/min的变形速度对水凝胶进行拉伸试验，以实施例1中双网络水凝胶为例，根据图8光学图像可以看到双网络拉伸形变至自身2.5倍，结构保持完整。
实施例13 3D打印支架力学性能
分别将0.1g的0.6,20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g的2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL水溶液中与0.2g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，使用3D生物打印机将水凝胶打印成特定结构，之后在365nm，50mw/cm2紫外光下交联30s，得到双网络水凝胶支架(长，宽：15mm，高：2mm)。如图9a所示，0.6kDa聚乙二醇基高分子与明胶颗粒复合的双网络水凝胶展示了高弹性模量，打印支架可完整承受2kg的砝码；如图9b所示，20kDa聚乙二醇基高分子与明胶颗粒复合的双网络水凝胶显示了高拉伸性能。
实施例14 3D生物打印
将0.1g得到的0.6,20kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和0.005g的2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2- 甲基苯丙酮光引发剂溶解在1mL含有间充质干细胞的高糖培养基溶液中(500000个/cm2接种) 与0.2g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，使用3D生物打印机将水凝胶打印成特定结构，之后在365nm，50mw/cm2紫外光下交联30s，得到载细胞双网络水凝胶支架。双网络水凝胶支架在培养基中培养第7，21天，使用2mM钙黄绿素(绿色荧光标记活细胞) 和4mM乙锭同型二聚体(红色荧光标记死细胞)对支架进行死活染色，并使用激光共聚焦显微镜观察细胞增殖情况。根据图10结果表明，第21天小鼠间充质干细胞的数量明显高于第七天在双网络水凝胶支架中的数量，表明细胞在双网络支架增殖，证实双网络水凝胶具有良好的生物相容性。
实施例15 3D打印支架红外光谱观察
使用实施例14中培养至21天的载细胞支架，进行冷冻干燥，并将冷冻干燥样品使用红外光谱仪进行分析。如图11所示，载细胞双网络支架中观察到明显的磷酸根峰，这是细胞在支架中成骨分化的象征，说明间充质干细胞在双网络凝胶支架中具有成骨分化行为。
实施例16 皮下植入
取SD大鼠(4周，雄性)，根据小鼠的体重注射质量分数为2％的戊巴比妥麻醉剂并固定在手术台上。在小鼠背部两侧切开两个1厘米长的切口，沿切口在每侧做一个皮下口袋。在皮下袋中用实施例1中的通过3D打印的双网络水凝胶支架种植每只小鼠后，将伤口缝合并分别饲养。2，4周后，取出植入双网络水凝胶并进行HE切片染色。对切片染色观察如图12所示，材料在植入第二周后有部分组织发生降解且有部分细胞迁移至胶体凝胶内部。胶体凝胶植入背部皮下四周后，材料大部分发生降解，且植入物周围被新生的组织包围看不出明显的边界层。说明双网络胶体凝胶具有优异的生物相容性和生物降解性。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法为下述两种方法中的一种：
方法一、将构成第一重网络的聚合物单体溶解在水性溶液中与构成第二重网络的明胶颗粒共混，加入引发剂后混合均匀得到预聚合胶体凝胶，第一重网络单体聚合反应固化从而将构成第二重网络的明胶颗粒包封在第一重网络中，即得到所述双网络水凝胶；
方法二、将构成第一重网络的聚合物单体溶解在构成第二重网络的明胶颗粒悬浮液中，冷冻干燥，得到双网络水凝胶预聚合粉末，再加入引发剂和水性溶液后混合均匀，第一重网络单体聚合反应固化从而将第二重网络的明胶颗粒包封在第一重网络中，得到所述双网络水凝胶；
其中，所述构成第一重网络的聚合物单体是端基修饰有引发聚合反应的基团的聚乙二醇基高分子，浓度为0.02-1g/mL；聚乙二醇基高分子为直链的或多支化的聚乙二醇基高分子中的一种或几种的组合，所述聚乙二醇的分子量为0.1kDa-100kDa；
所述构成第二重网络的胶体网络是由明胶胶体颗粒相互链接形成的均匀分布的、多分枝状、多孔的连续网络，其中明胶颗粒尺寸为50nm～500μm；明胶颗粒表面电荷为-40～20mV；所述构成第二重网络的胶体网络明胶颗粒的体积分数为
Figure FDA0002307318130000011
明胶颗粒和聚乙二醇混合时的质量比例为0.1～10:1。
2.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶颗粒的交联度范围：当交联反应是基于明胶氨基基团时，交联反应体系中交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比0.1～10；当交联反应是基于明胶氨基和羧基基团时，交联剂与氨基基团的摩尔比为0.1～10。
3.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述构成第一重网络的聚乙二醇基高分子的端基修饰的引发聚合反应的基团选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、烯丙基异氰酸酯、氨基/醛基、叠氮化物/炔烃、巯基/双键、双烯/单烯中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述聚合反应为自由基聚合反应时，为紫外光诱导聚合反应或化学引发剂诱导聚合反应。
5.根据权利要求4所述的由聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述紫外光诱导聚合反应固化的引发剂选自2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-二甲氨基-2-苄基-1-[4-(4-吗啉基)苯基]-1-丁酮、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮、苯甲酰甲酸甲酯中的一种或几种的组合，浓度为0.0025-0.05g/mL；所述紫外光诱导聚合反应的条件为：波长为200-400nm，紫外光强度为10-500mW/cm2，时间为1-200s；所述化学引发剂诱导聚合反应固化的引发剂选自氧化二苯甲酰、叔丁基过氧化氢、过硫酸铵/四甲基亚胺中的一种或多种，浓度为0.0001-0.02g/mL。
6.一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶，其特征在于，所述双网络水凝胶由权利要求1-5中任意一项所述方法制备得到。
7.根据权利要求6所述的一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶作为3D生物打印墨水、细胞载体、人工细胞外基质的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将悬浮有细胞的水性溶液与含有第一重网络单体的明胶胶体凝胶混合后进行三维生物打印成特定结构后，交联第一重网络形成双网络水凝胶以实现高强度载细胞支架打印。
9.根据权利要求6所述的一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶作为药物缓释载体实现药物的控制释放，其中药物可以是蛋白类药物，抗生素或生物活性因子。
10.根据权利要求6所述的一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶在组织工程支架材料中的应用，所述用于组织修复填充为用于骨组织、软骨组织、肌肉、或血管组织缺损的修复填充。
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