CN117018298A - 一种降解时间可控的可注射多孔微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可注射多孔微球，所述可注射多孔微球的体外酶降解时间为24‑48h，且通过以下步骤制备：步骤1，将底物和与缓冲溶液或去离子水充分混合得到预混液；步骤2，配制有机相溶液并进行预冷；步骤3，将步骤1得到的预混液与交联剂混合得到水相溶液；将所述水相溶液加入有机相溶液中进行搅拌乳化，得到W/O型的乳液，然后进行乳化反应；步骤4，后处理得到所需的微球；步骤5，将步骤4所述微球洗涤、干燥，即可得到所述可注射多孔微球。本发明的可注射多孔微球成分安全、能够促进细胞黏附、增殖和迁移，刺激自身组织细胞修复，从而产生新的胶原蛋白和其他结缔组织胶原，修复自身组织细胞且效果维持时间可控的微球材料具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种降解时间可控的可注射多孔微球及其制备方法和应用。
背景技术
微球在生物医学应用中有着广泛的前景，其应用范围包括细胞和药物的治疗递送及组织修复、填充。微球通常以注射的方式用于生物制剂的微创递送，如：可以在悬浮液中配制以递送治疗剂，也可以负载细胞、生长因子等后再注射至病灶部位，以形成促进细胞渗透的微孔支架，并使负载的细胞及因子快速浸润至局部，促进组织快速修复并减轻局部炎症反应。此外，注射类微球因操作灵活简便且治疗时间短、术后无明显可见痕迹、治疗后效果较为明显、术后恢复快等特点在组织填充领域也占据了大量的市场。
根据注射填充材料的性质来源，可以将其分为三类：生物材料、非生物材料及混合材料。其中，非生物材料多为人工合成的生物医用高分子，如：聚左旋乳酸(PLLA)、聚乙丙交酯(PLGA)、聚己内酯(PCL)等，但这些高分子材料存在诸如制备过程中尺寸及形态难控、细胞黏附性差、对注射技术要求高，部分产品起效较慢，成本高等问题。生物材料通常为透明质酸、琼脂糖等，这类材料的维持效果时间较短，需要长期持续使用才能维持效果。公告号为CN109010910B的专利文献公开了一种可注射的PLLA微球，但是未能解决微球形态难控的问题。公告号为CN113663126A的专利文献公开了一种透明质酸/壳聚糖微球，但是过于光滑的表面不利于细胞黏附增殖，仅能起到支撑填充的效果 。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中微球的粘附性差、降解时间不可控以及维持效果时间较短等问题，而提供一种降解时间可控的可注射多孔微球。
本发明的另一目的，提供一种所述可注射多孔微球的制备方法。
本发明的另一目的，提供一种所述可注射多孔微球的应用。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种降解时间可控的可注射多孔微球，所述可注射多孔微球的体外酶降解时间至少为24小时，且通过以下步骤制备：
步骤1，将生物材料和与缓冲溶液或去离子水充分混合得到预混液；
步骤2，将表面活性剂和有机溶剂配制成有机相溶液并进行预冷；
步骤3，乳液的制备：将步骤1得到的预混液与交联剂混合得到水相溶液；将所述水相溶液加入有机相溶液中进行搅拌乳化，得到W/O型的乳液，然后将W/O型的乳液置于低温避光环境下进行乳化反应；
步骤4，待步骤3乳化反应完毕后，选用筛网将所述乳液的有机相滤除得到所需粒径范围内的微球；
步骤5，将步骤4所述微球用清洗剂充分洗涤，然后进行干燥，即可得到所述可注射多孔微球。
在上述技术方案中，所述生物材料为胶原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、明胶、明胶衍生物、甲壳素、壳聚糖、淀粉、琼脂、纤维素及其衍生物、藻酸盐及其衍生物、透明质酸、纤维蛋白原、层连接蛋白、纤维连接蛋白和基质胶中的至少一种；
所述缓冲溶液为硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液和醋酸缓冲液中的至少一种。
在上述技术方案中，所述有机溶剂为氢氟醚、四氯化碳、石油醚、环己烷、液态石蜡、大豆油、橄榄油、花生油、三氯甲烷、二氯甲烷和四氯乙烯中的至少一种；
所述表面活性剂为烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基/芳基磺酸盐、烯烃磺酸盐、磺基琥珀酸酯、烷基铵盐类表面活性剂、十二烷基乙氧基磺基甜菜碱、十二烷基羟丙基磺基甜菜碱、十二烷基二甲基磺丙基甜菜碱、十四烷酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、椰油酸单乙醇酰胺、失水山梨醇脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯、脂肪酸钾皂、月桂酸酯、月桂基磺化琥珀酸单酯二钠、烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、司班、PO-500、单油酸酯和吐温中的至少一种。
在上述技术方案中，所述交联剂为二乙烯基苯、二异氰酸酯，N-羟基琥珀酰亚胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺，甲醛、戊二醛、乙酸酐、二缩水甘油基乙醚、辛二亚氨酸甲酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、氯化钙、四甲基乙二胺、硫酸铵、京尼平和转谷酰胺酶中的至少一种。
在上述技术方案中，所述步骤3中搅拌乳化的搅拌转速为100-1500 rpm，搅拌乳化的时间为10-60min。
在上述技术方案中，所述步骤3中搅拌反应的时间为10-48小时，所述低温避光的温度为-80℃--5℃。
在上述技术方案中，所述清洗剂为丙酮、无水硫酸铜、氯化钙、硫酸钠、无水乙醇、医用酒精、氢氟醚、烷基苯磺酸钠、脂肪醇硫酸钠、三聚磷酸钠和去离子水中的至少一种。
在上述技术方案中，所述可注射多孔微球的细胞增殖率不小于169%；
所述可注射降解微球的体内降解时间为12-36周。
本发明的另一方面，提供一种所述的可注射多孔微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将生物材料和与缓冲溶液或去离子水充分混合得到预混液；
步骤2，将表面活性剂和有机溶剂配制成有机相溶液并进行预冷；
步骤3，乳液的制备：将步骤1得到的预混液与交联剂混合得到水相溶液；将所述水相溶液加入有机相溶液中进行搅拌乳化，得到W/O型的乳液，然后将W/O型的乳液置于低温避光环境下进行乳化反应；
步骤4，待步骤3乳化反应完毕后，选用筛网将所述乳液的有机相滤除得到所需粒径范围内的微球；
步骤5，将步骤4所述微球用清洗剂充分洗涤，然后进行干燥，即可得到所述可注射多孔微球。
本发明的另一方面，提供一种所述的注射多孔微球药物缓释、组织修复、组织工程、医美填充或细胞培养中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明的可注射多孔微球成分安全、能够促进细胞黏附、增殖和迁移，刺激自身组织细胞修复，从而产生新的胶原蛋白和其他结缔组织胶原，修复自身组织细胞且效果维持时间可控的微球材料具有重要意义。
2.本发明创造性的发现通过调整可注射多孔微球制备过程中交联剂的用量可以调整可注射多孔微球的降解时间，扩展了可注射多孔微球的应用场景。
3.本发明的可注射多孔微球具有良好的细胞增殖率，细胞增殖率不低于169%，部分材料可以高达200%。
附图说明
图1为本发明实施例1-6的可注射多孔微球的光学显微镜照片，其中，图1A-1F分别为实施例1-实施例6的可注射多孔微球。
图2为本发明实施例2的可注射多孔微球的扫描电镜照片。
图3为本发明实施例2的可注射多孔微球的细胞迁移实验的微球光学显微镜照片，其中，图3A为0h空白对照组照片，图3B为0h实施例2的可注射多孔微球的照片，图3C为24h空白对照组照片，图3D为24h实施例2的可注射多孔微球的照片。
图4为本发明实施例2、4、5及空白对照组的动物实验注射皮丘日常观察图片。
图5为本发明实施例2、4、5及空白对照组的第12周动物实验HE染色切片结果，其中，图5A-5B为实施例2的可注射多孔微球，图5C-5D为实施例4的可注射多孔微球，图5E-5F为实施例5的可注射多孔微球，图5G-5H为空白对照组。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
步骤1，水相溶液的配制
称量0.35 g的透明质酸以及1.05 g明胶粉末，使用35 mL去离子水充分溶解。
步骤2，有机相溶液的配制
将三氯甲烷和石油醚以体积比2:1混合均匀后再加入终浓度6%v/v (ml/ml)吐温80，继续搅拌混合均匀。随后将有机相溶液转移到-40℃制冷机中预冷5小时。
步骤3，乳液的制备
1）将预冷好的有机相溶液转移至低温反应搅拌器中，并设置搅拌器的转速为800rpm。
2）将0.042 mL（0.12%）的戊二醛水溶液加入至水相溶液中并迅速震荡混合均匀。
3）将混合好的水相溶液迅速加入至低温搅拌器中，其中水相与有机相的体积比为1：10，以800 rpm的转速充分搅拌15 分钟得到稳定的油包水乳液，后可将搅拌转速降低至100 rpm。
4）在-20℃条件下继续反应16小时即可得到所需微球。
步骤4，微球的后处理，反应完毕，选用目数为100-200目的筛网将有机相溶液滤除，得到固体微球。
步骤5，使用清洗剂丙酮对微球进行清洗以去除表面的有机相溶液，共计清洗3次。再将经丙酮清洗过3次的微球进行去离子水洗，共计5次。将清洗过的微球置于液氮中冷冻，随后移至冷冻干燥机内进行冻干操作48小时，最后得到粒径分布均匀的所述可注射多孔微球。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，底物选用胶原蛋白，称量1.645 g的胶原蛋白粉末，使用35 mL去离子水充分溶解。
实施例3
本实施例与实施例2的区别在于，本实施例将0.12%戊二醛水溶液替换为0.33%戊二醛水溶液，其余步骤与实施例2保持一致。
实施例4
本实施例与实施例2的区别在于，本实施例将0.12%戊二醛水溶液替换为0.54%戊二醛水溶液，其余步骤与实施例2保持一致。
实施例5
本实施例与实施例2的区别在于，本实施例将0.12%戊二醛水溶液替换为0.76%戊二醛水溶液，其余步骤与实施例2保持一致。
实施例6
步骤1，水相溶液的配制
称量0.175 g的壳聚糖粉末、0.105 g胶原蛋白粉末，使用35 mL浓度为0.2 mol/L的醋酸溶液充分溶解。
步骤2，有机相溶液的配制
将四氯化碳和石油醚以体积比3:1混合均匀后再加入终浓度10%v/v (ml/ml)司班80，继续搅拌混合均匀。随后将有机相溶液转移到-40℃制冷机中预冷5小时。
步骤3，乳液的制备
1）将预冷好的有机相溶液转移至低温反应搅拌器中，并设置搅拌器的转速为1000rpm。
2）将0.4%的戊二醛水溶液加入至水相溶液中并迅速震荡混合均匀。
3）将混合好的水相溶液迅速加入至低温搅拌器中，其中水相与有机相的体积比为1：15，以1000 rpm的转速充分搅拌20分钟得到稳定的油包水乳液，后可将搅拌转速降低至200 rpm。
4）在-20℃条件下继续反应16小时即可得到所需微球。
步骤4、步骤5与实施例1保持一致。
实施例7
对实施例1-6得到的可注射多孔微球进行了表征测试：
7.1光学显微镜下可注射多孔微球的形态
如图1所示，实施例1-6所制备的微球均粒径均匀、形态良好。如图2所示，实施例2所制备的可注射多孔微球呈球形多孔结构。
7.2过针后形态及粒径统计以及体外降解实验
可注射多孔微球微球过30G针后形态及粒径统计：分别测试实施例1-6的微球在生理盐水中浸泡60 min后能否通过30G针头并统计粒径分布。
可注射多孔微球微球的体外降解实验：分别取实施例1-6微球样品0.036g，加入20U/ml的胰酶或胶原酶（本实施例中选用I型胶原酶溶液）3ml，混匀。将各样品管放入37℃恒温箱内降解，在降解反应开始后的60min、120min、180min、240min、360min、480min、24h、48h、72h时间点处取样，并在光学显微镜下观察，当在显微镜下无明显球形样品后即视为降解完全，结果详见表1。
7.3体外细胞毒性实验
将经过25 kGy辐照灭菌的微球制备成100 mg/3.7 mL 最低必需培养基培养基(MEM培养基，额外加5% FBS，1% Gln)的浸提液，浸提条件：(37±1) ℃，(24±2) h。使用40μm细胞筛收获1ml浸提液。将小鼠成纤维细胞(L929)置于培养基中增殖培养2-3天，然后以每孔1×104个细胞的浓度转移至96孔板中。继续培养24h后观察细胞粘附情况。当L929的生长密度达到90％后，将实施例2-5及对比例1的微球浸提液与细胞一起孵育24h。将CellCounting Kit-8(CCK-8)试剂加入孔板中，再孵育1-4h。最后，通过酶标仪测量450nm波长处的光密度(OD)值，可以间接定量活细胞的数量，反映细胞的活力。结果详见表1，如表1所示，实施例1-6所制备的微球在过针后未出现明显变形，且粒径未随浸泡时间的增长发生明显变化；实施例1-6所制备微球能够促进细胞增殖，细胞毒性为0级，并且实施例2-5的体外降解时间的不同证明通过调整交联剂用量可以达到可注射多孔微球可以控制填充注射效果的时间的目的，其次，实施例1-6的可注射多孔微球的细胞增殖率均超过150%，且实施例1和5的可注射多孔微球的细胞增殖率超过200%。
表1过针后形态及粒径统计以及体外降解实验结果表
7.4细胞迁移实验
按每孔约(5-15)×105个播种细胞，培养1-2天后生长密度达到90％。后用marker笔用直尺在孔板底部画3条横线，用10 μL枪头比着直尺垂直对准孔板，向下轻推纵向划线形成划痕，用PBS漂洗细胞3次，去除划除的细胞，在样品组加入2 ml无血清培养基配制的实施例2微球样品(1mg/ml)，空白对照组只加入无血清培养基。置于37℃，5% CO2培养箱培养，于0h、24h后，以横向和纵向划线的交点为核心，在10倍显微镜下进行观察。如图3所示，空白对照组无明显细胞迁移，实施例2的样品组在24h的孵育后出现了明显的细胞迁移现象。
动物实验：选择实施例1-3作为样品组，透明质酸溶液作为对照组。挑选新西兰兔，将背部毛发剃干净，沿中轴线左右两侧各标记10个注射点，在20个部位分别注入不同材料约0.2 mL，使注射部位形成隆起的皮丘。注射填充部位在新西兰兔的浅表层，注射填充时注意层次的一致性。每天观察皮球的突起，并进行拍照，记录每个皮丘消失的时间。1周、4周、12周、26周进行动物解剖，每个节点取2只，取组织切片利用苏木精-伊红染色法（HE染色法）进行病理学观察。其中，位点1代表实施例2，位点2代表实施例4，位点3代表实施例5，位点4代表对照组。
如图4所示，第0、4、12及26周对实施例2、4、5及对照组的注射皮丘位点观测，对照组（位点4）在第4周已经明显在体内降解完全，实施例2的微球注射皮丘位点（位点1）在第12周降解完全，实施例4的微球注射皮丘位点（位点2）在第26周降解完全，实施例5的微球注射皮丘位点（位点3）在第26周还存在微隆的小皮丘，在第36周完全降解，说明微球的不同工艺的微球在体内降解时间不同，即微球降解时间可控。
如图5所示，实施例2、4、5及对照组（仅注射透明质酸溶液）的第12周取样HE染色结果显示皮肤组织的表皮完整，结构清晰，并可见角化层；真皮层胶原纤维排列整齐；皮下组织位于真皮下方，由疏松结缔组织及肌层组成，未见明显异常。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种降解时间可控的可注射多孔微球，其特征在于，所述可注射多孔微球的体外酶降解时间至少为24小时，且通过以下步骤制备：
步骤1，将生物材料和与缓冲溶液或去离子水充分混合得到预混液；
步骤2，将表面活性剂和有机溶剂配制成有机相溶液并进行预冷；
步骤3，乳液的制备：将步骤1得到的预混液与交联剂混合得到水相溶液；将所述水相溶液加入有机相溶液中进行搅拌乳化，得到W/O型的乳液，然后将W/O型的乳液置于低温避光环境下进行乳化反应；
步骤4，待步骤3乳化反应完毕后，选用筛网将所述乳液的有机相滤除得到所需粒径范围内的微球；
步骤5，将步骤4所述微球用清洗剂充分洗涤，然后进行干燥，即可得到所述可注射多孔微球。
2.如权利要求1所述的降解时间可控的可注射多孔微球，其特征在于，所述生物材料为胶原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、明胶、明胶衍生物、甲壳素、壳聚糖、淀粉、琼脂、纤维素及其衍生物、藻酸盐及其衍生物、透明质酸、纤维蛋白原、层连接蛋白、纤维连接蛋白和基质胶中的至少一种；
所述缓冲溶液为硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液和醋酸缓冲液中的至少一种。
3.如权利要求1所述的降解时间可控的可注射多孔微球，其特征在于，所述有机溶剂为氢氟醚、四氯化碳、石油醚、环己烷、液态石蜡、大豆油、橄榄油、花生油、三氯甲烷、二氯甲烷和四氯乙烯中的至少一种；
所述表面活性剂为烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基/芳基磺酸盐、烯烃磺酸盐、磺基琥珀酸酯、烷基铵盐类表面活性剂、十二烷基乙氧基磺基甜菜碱、十二烷基羟丙基磺基甜菜碱、十二烷基二甲基磺丙基甜菜碱、十四烷酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、椰油酸单乙醇酰胺、失水山梨醇脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯、脂肪酸钾皂、月桂酸酯、月桂基磺化琥珀酸单酯二钠、烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、司班、PO-500、单油酸酯和吐温中的至少一种。
4.如权利要求1所述的降解时间可控的可注射多孔微球，其特征在于，所述交联剂为二乙烯基苯、二异氰酸酯，N-羟基琥珀酰亚胺、N ,N-亚甲基双丙烯酰胺，甲醛、戊二醛、乙酸酐、二缩水甘油基乙醚、辛二亚氨酸甲酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、氯化钙、四甲基乙二胺、硫酸铵、京尼平和转谷酰胺酶中的至少一种。
5.如权利要求1所述的降解时间可控的可注射多孔微球，其特征在于，所述步骤3中搅拌乳化的搅拌转速为100-1500 rpm，搅拌乳化的时间为10-60min。
6.如权利要求1所述的降解时间可控的可注射多孔微球，其特征在于，所述步骤3中搅拌反应的时间为10-48小时，所述低温避光的温度为-80℃--5℃。
7.如权利要求1所述的降解时间可控的可注射多孔微球，其特征在于，所述清洗剂为丙酮、无水硫酸铜、氯化钙、硫酸钠、无水乙醇、医用酒精、氢氟醚、烷基苯磺酸钠、脂肪醇硫酸钠、三聚磷酸钠和去离子水中的至少一种。
8.如权利要求1所述的降解时间可控的可注射多孔微球，其特征在于，所述可注射多孔微球的细胞增殖率不小于169%；
所述可注射降解微球的体内降解时间为12-36周。
9.一种如权利要求1-8任意一项所述的可注射多孔微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将生物材料和与缓冲溶液或去离子水充分混合得到预混液；
步骤2，将表面活性剂和有机溶剂配制成有机相溶液并进行预冷；
步骤3，乳液的制备：将步骤1得到的预混液与交联剂混合得到水相溶液；将所述水相溶液加入有机相溶液中进行搅拌乳化，得到W/O型的乳液，然后将W/O型的乳液置于低温避光环境下进行乳化反应；
步骤4，待步骤3乳化反应完毕后，选用筛网将所述乳液的有机相滤除得到所需粒径范围内的微球；
步骤5，将步骤4所述微球用清洗剂充分洗涤，然后进行干燥，即可得到所述可注射多孔微球。
10.一种如权利要求1-8任意一项所述的可注射多孔微球在药物缓释、组织修复、组织工程、医美填充或细胞培养中的应用。
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