CN115011542A - 多孔微载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多孔微载体及其制备方法。制备方法是首先将人源化基因重组胶原蛋白和/或可降解生物大分子溶液或其混合溶液调节pH至4.0‑9.0后预冷，与试剂A、试剂C按顺序混合，然后采用乳液法反应制备微载体，经清洗与收集、冻干后获得分散的三维微载体，即为可充分裂解的多孔微载体。所制得的多孔微载体具有较高的孔隙率，具有更大的比表面积和更高的细胞扩增效率，而且其可在细胞增殖期间保持稳定，待细胞扩增结束后，仅在胰酶替代物的作用下，可在短时间内完成充分裂解，从而收获具有高组织修复活性的细胞，这样既能够省去细胞收获后分离微载体的繁琐步骤，又能够避免因胰酶等带来的病毒跨物种传播。
Description
技术领域
本发明属于医药材料技术领域。更具体地，涉及多孔微载体及其制备方法。
背景技术
目前，为了收获组织修复活性更高的细胞，业内多将可降解生物材料制备成微载体后，将细胞接种于其上进行悬浮培养扩增。常用的商业化微载体如cytodex1、cytodex3等。
但现有的微载体不具备多孔特征，细胞仅能在其表面贴壁与增殖，扩增效率有限；此外，其不能被胰蛋白酶、胶原蛋白酶或胰酶替代物裂解，在收获细胞后还需进行细胞悬液与微载体的分离，操作步骤繁琐，且细胞扩增倍数有限；而且与二维培养类似，在收获细胞时需要使用胰蛋白酶对细胞进行消化，而目前上市场所能购买到的胰蛋白酶主要是从猪、牛等动物胰脏中提取而来，存在着潜在的病毒污染风险，因此，使用胰蛋白酶消化所收获的细胞将难以通过安全验证，从而无法回输到临床病人体内。另外，胰蛋白酶的长时间消化也会极大损伤细胞活性，降低其最终的组织修复效果。
中国专利申请提供了一种三维多孔微载体，具备多孔特征且能调节孔径，具有较高的孔隙率，因而比cytodex1、cytodex3具有更大的比表面积和更高的细胞扩增效率；但是，其在裂解时，还是需要使用到动物来源的酶，如胶原蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等配制的裂解液，存在病毒跨物种传播风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有微载体的缺陷和不足，提供一种可充分裂解的多孔微载体，其具有较高的孔隙率，具有更大的比表面积和更高的细胞扩增效率；合适的交联密度可使其可在细胞增殖期间保持稳定，待细胞扩增结束后，仅在胰酶替代物的作用下，可在短时间内完成充分裂解，这样既能够省去细胞收获后分离微载体的繁琐，又能够避免病毒的跨物种传播，收获具有高组织修复活性的细胞。
本发明的目的是提供多孔微载体及其制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
多孔微载体的制备方法，包括如下步骤：
S1.制备生物大分子溶液；
提供人源化基因重组胶原蛋白溶液和/或可降解生物大分子溶液或其混合溶液；
S2.制备水相溶液：
将步骤S1的生物大分子溶液调节pH值至4.0-9.0后预冷，与试剂A充分混合，得到均匀混合液；再添加体积终浓度为0.01-5％(或质量终浓度为0.001-8％)的试剂C，混合均匀，得水相溶液；
其中，所述试剂A包括试剂B或离子盐；所述试剂B选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇、二甘醇、乙二醇丁醚、丙二醇丁醚、二氯甲烷、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、乙二醇丁醚醋酸酯、二甲基亚砜、甲酰胺中的至少一种；
所述试剂C选自戊二醛、甲醛、京尼平、转谷酰胺酶、硫酸铵、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、二环己基碳二亚胺中的至少一种；
S3.乳液法反应制备微载体：
将油相溶剂充分预冷后，将步骤S2的水相溶液加入到油相溶剂中进行乳化，得到W/O型乳液；将乳液迅速冷却后转移至-20℃或更低温度，继续反应不低于6小时，优选12-24小时；
S4.微载体的清洗与收集：
取出乳液，待其融化，去除液体成分，沉淀物清洗干净后，筛分出所需粒径范围内的颗粒，冻干后获得分散的三维微载体，即为可充分裂解的多孔微载体。
上述制备获得的三维多孔微载体进行紫外或辐照灭菌后，可接种细胞进行悬浮培养，待其扩增结束后，仅通过添加胰酶替代物便可对微载体进行充分裂解，离心后去除上清即可收获细胞。
本发明所述“重组胶原蛋白”，是指：采用重组DNA技术，对编码所需人胶原蛋白质的基因进行遗传操作和(或)修饰，利用质粒或病毒载体将目的基因带入适当的宿主细胞(细菌、酵母或其它真核细胞等)中，表达并翻译成胶原蛋白或类似胶原蛋白的多肽，经过提取和纯化等步骤制备而成。本发明采用基于重组胶原蛋白制备的可充分裂解的多孔微载体，具有成分清晰、无病原体、孔径可调、孔隙率大、比表面积高、生物活性好等诸多优点。此外，胰酶替代物亦为非动物来源，其与采用基于重组胶原蛋白制备的微载体的配合使用，可以保证在整个细胞的规模化扩增过程中完全避免动物来源的任何原材料的使用，从而杜绝了生物安全隐患。
本发明所述人源化基因重组胶原蛋白包含各类工程菌构建的人源化基因重组胶原蛋白；所述人源化基因重组胶原蛋白亦可为其衍生物，包括但不限于甲基丙烯酸化人源基因重组胶原蛋白。
优选地，步骤S2中，所述生物大分子溶液的质量浓度为2-25％，生物大分子溶液与试剂A的质量比为5-22000。
优选地，步骤S2中，所述离子盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸一氢钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸镁、硝酸钠、硝酸钾、氯化镁、氯化钾、氯化钙、氯化钠和氯化钡中的至少一种。
优选地，步骤S3中，所述油相溶剂选自所述油相溶剂选自乙醇、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、季铵化物、正丙醇、异丙醇、氨基酸型表面活性剂、甜菜碱型表面活性剂、丙二醇、卵磷脂、丙三醇、甲苯、正己烷、食用油、二甲苯、石油醚、蓖麻油、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、吐温(或聚山梨酯)、净洗剂6501、花生油、大豆油、烷基葡糖苷(APG)、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦(或司盘)、橄榄油、山茶油、液态石蜡、环己烷、氢氟醚、油酸酯、亚油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸/癸酸甘油三酯、油酸/亚油酸甘油三酯中的至少一种；
优选地，步骤S3中，所述水相溶液和油相溶剂的体积比为1:2-1:30。
步骤S3中，迅速冷却的方法是利用-20℃、-80℃、冰水混合物、液氮，或温度介于冰水混合物与液氮之间的冷却液中的一种。
优选地，步骤S4中，乳液融化后可先用中和液进行中和，所述中和液可选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、磷酸钠溶液、磷酸钾溶液、磷酸氢钠溶液、磷酸氢钾溶液、氨水、硼氢化钠溶液、氰基硼氢化钠溶液、硼氢化钾溶液中的至少一种。
步骤S4中，去除上述乳液中的液体成分的方式为采用抽滤筛分或离心法去除。
优选地，步骤S4中，清洗沉淀物所用清洗试剂可选自去离子水、酒精、丙酮、无水乙醇、正己烷、异丙醇、氢氟醚、叔丁醇中的至少一种。
优选地，步骤S1中，所述可降解生物大分子选自可降解的人工合成大分子和/或天然大分子；
优选地，所述人工合成大分子选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乙交酯、聚二氧六环酮、聚富马酸二羟丙酯、聚酸酐、聚羟基丁酸、聚乙二醇及其衍生物、聚酰胺、聚赖氨酸、聚苯乙烯、聚丙烯、聚吡咯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)及其衍生物、聚原酸酯和聚缩醛中的至少一种；
优选地，所述天然大分子选自海藻酸盐、壳聚糖及其衍生物、葡聚糖及其衍生物、壳寡糖及其衍生物、透明质酸及其衍生物、普鲁兰多糖及其衍生物、胶原蛋白、蚕丝及其衍生物、明胶及其衍生物、细胞外基质中的单一组分或混合物、细胞外基质的降解产物、琼脂和糖蛋白中的至少一种。
更优选地，当可降解生物大分子同时包含人工合成大分子，以及天然大分子时，人工合成大分子的质量浓度为0-50％，天然大分子的质量浓度为50-100％。
本发明制备三维多孔微载体的方法可通过调节控制试剂C浓度制备出在细胞扩增过程中足够稳定、扩增结束后又可被胰酶替代物充分裂解(当然也可被胰蛋白酶、胶原蛋白酶等蛋白水解酶裂解)的多孔微载体。制备得到的三维多孔微载体进行紫外或辐照灭菌后，可接种细胞进行悬浮培养，待其扩增结束后，仅通过添加胰酶替代物便可对微载体进行充分裂解，离心后去除上清即可收获细胞。
本发明制备的微载体具有恰到好处的交联强度，且具有疏松多孔的性质，孔隙率介于70-97％，非常适合细胞的悬浮培养。其细胞接种率高于70％，且接种细胞后，在细胞的悬浮培养期间(最高可长达21d)可保持充分的稳定性，而在细胞扩增完成后，仅通过胰酶替代物就可在半小时内实现对微载体的充分降解，通过离心即可收获细胞，通常一个扩增周期内细胞的扩增倍数在6倍以上，且收获的细胞活率高于97％。如此，避免了动物来源的蛋白水解酶的使用，防止了病毒的跨物种传播。此外，通过对微载体的降解实现对细胞的快速收获，可以有效减少胰酶替代物的使用浓度和作用时间，从而有效提升细胞的组织修复活性。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的可充分裂解的多孔微载体，具有较高的孔隙率，且孔隙率可控，因而比cytodex1、cytodex3具有更大的比表面积，微载体数量相同的情况下，本发明制备的微载体可以扩增出更多的细胞，具有更高的细胞扩增效率。
而且，合适的交联密度可使其可在细胞增殖期间保持稳定，待细胞扩增结束后，仅在胰酶替代物的作用下，其可在短时间内完成充分裂解，裂解后通过一次离心即可获得细胞，这样既能够省去细胞收获后分离微载体的繁琐，又能够避免病毒的跨物种传播，收获具有高组织修复活性的细胞。而采用基于重组胶原蛋白制备的可充分裂解的多孔微载体，具有成分清晰、无病原体、生物活性好等诸多优点；同时胰酶替代物亦为非动物来源，其与采用基于重组胶原蛋白制备的微载体的配合使用，可以保证在整个细胞的规模化扩增过程中完全避免动物来源的任何原材料的使用，从而杜绝了生物安全隐患。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的多孔微载体在显微镜下的形貌图。
图2为本发明实施例1制备的多孔微载体在扫描电镜(SEM)下的形貌图。
图3为本发明实施例2制备的多孔微载体在显微镜下的形貌图。
图4为本发明实施例2制备的多孔微载体在扫描电镜(SEM)下的形貌结果。
图5为本发明实施例3制备的多孔微载体在显微镜下的形貌结果。
图6为本发明实施例3制备的多孔微载体在扫描电镜(SEM)下的形貌照片。
图7为本发明实施例4制备的多孔微载体的扫描电镜图。
图8为本发明实施例5制备的多孔微载体的扫描电镜图。
图9为本发明实施例6制备的多孔微载体的扫描电镜图。
图10为本发明实施例1制备的多孔微载体被胰酶替代物裂解后的结果。
图11为本发明实施例1制备的多孔微载体接种细胞并悬浮培养3天后死/活染色结果。
图12为本发明实施例1制备的多孔微载体悬浮培养结束后死/活染色结果。
图13为本发明实施例1制备的多孔微载体裂解后收获的细胞悬液结果。
图14为本发明实施例4制备的多孔微载体接种细胞1天后死/活染色结果图。
图15为本发明实施例4制备的多孔微载体接种细胞1天后HE切片图。
图16为本发明实施例4制备的多孔微载体接种细胞3天后死/活染色结果图。
图17为本发明实施例4制备的多孔微载体接种细胞7天后死/活染色结果图。
图18为本发明实施例4制备的培养扩增细胞后的微载体用胰酶替代物裂解后显微镜观察结果。
图19为本发明实施例4制备的多孔微载体接种细胞后细胞扩增曲线。
图20为对比例1制备的微载体在细胞培养过程中发生了解体的结果。
图21为对比例2制备的微载体在细胞培养结束后裂解后的结果。
图22为对比例3的多孔微载体经灭菌后重新分散于水溶液中且置于37℃下8h后的结果。
图23为对比例4的多孔微载体接种细胞进行悬浮扩增结束后，单纯使用胰酶替代物裂解的结果。
图24为对比例5的多孔微载体接种细胞进行悬浮扩增结束后，单纯使用胰酶替代物裂解的结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1基于人源化基因重组胶原蛋白制备可充分裂解的多孔微载体
(1)制备水相溶液：
配制质量浓度为20％的人源化基因重组胶原蛋白溶液100mL，调节溶液pH值为6.5，加入2mL二甲基亚砜，充分混合均匀后预冷，加入2mL甲醛溶液。
(2)制备乳液与乳液法反应制备微载体：
取300mL预冷后的大豆油加入反应釜中，调整转速为680rpm，将步骤(1)制备好的水相溶液加入进大豆油中，继续反应30min，形成稳定的充分乳化的油包水乳液，将乳液转移至-20℃冰箱，继续反应12小时。
(3)微载体的清洗与收集：
将乳液从-20℃冰箱中取出后室温融化，离心，去除大豆油，沉淀物分别用充分预冷的丙酮与去离子水洗涤；洗涤结束后，可根据需要用自动筛分机筛选出所需粒径范围的微载体(125-250μm)；冷冻干燥后即可获得可充分裂解的多孔微载体。
本实施例制备的重组胶原蛋白多孔微载体在显微镜下的形貌如图1所示；由图2可知，在扫描电子显微镜(SEM)观察下，本实施例制备的多孔微载体具备疏松多孔结构，且孔与孔之间相互贯穿联通，适合干细胞的贴壁与增殖。
实施例2基于人源化基因重组胶原蛋白与壳聚糖制备可充分裂解的多孔微载体
将实施例1中“质量浓度为20％的人源化基因重组胶原蛋白溶液100mL”替换为“称取23g人源化基因重组胶原蛋白与1g壳聚糖，加入100mL无菌水，配成均匀溶液”；
同时，将实施例1中所述“2mL二甲基亚砜”改为“3g氯化钠”，其余步骤均同实施例1；
本实施例制备的重组胶原蛋白多孔微载体在显微镜下的形貌如图3所示；本实施例制备的重组胶原蛋白多孔微载体在扫描电镜下的形貌如图4所示，可见本实施例制备的多孔微载体具备疏松多孔结构，且孔与孔之间相互贯穿联通，适合干细胞的贴壁与增殖。
实施例3基于甲基丙烯酸化重组胶原蛋白与透明质酸制备可充分裂解的多孔微载体
(1)制备水相溶液：
将3.5g甲基丙烯酸化重组胶原蛋白、0.2g透明质酸和100mL无菌水配制成均匀溶液，调节溶液pH值为5.0，加入2.5g硫酸镁，充分混合均匀后预冷，加入1.5mL戊二醛溶液。
(2)制备乳液与乳液法反应制备微载体：
取300mL预冷后的大豆油加入反应釜中，调整转速为650rpm，将步骤(1)中制备好的水相溶液加入进山茶油中，继续反应30min，形成稳定的充分乳化的油包水乳液，将乳液转移至-20℃冰箱，继续反应24小时。
(3)微载体的清洗与收集：
将乳液从-20℃冰箱中取出后室温融化，离心，去除山茶油，沉淀物分别用充分预冷的丙酮、乙醇与去离子水洗涤；洗涤结束后，可根据需要用自动筛分机筛选出所需粒径范围的微载体(125-250μm)；冷冻干燥后即可获得可充分裂解的多孔微载体。
本实施例制备的重组胶原蛋白多孔微载体在显微镜下的形貌如图5所示，本实施例制备的重组胶原蛋白多孔微载体在扫描电镜下的形貌如图6所示，可见本实施例制备的多孔微载体具备疏松多孔结构，且孔与孔之间相互贯穿联通，适合干细胞的贴壁与增殖。
实施例4基于明胶、胶原蛋白与壳聚糖制备可充分裂解的多孔微载体
(1)制备水相溶液：
称取6g明胶、0.5g胶原蛋白和0.5g壳聚糖，加入100mL去离子水后配成水溶液，调节溶液pH值为6.0，加入500mg氯化钠，充分混合均匀后预冷，加入1mL的甲醛溶液。
(2)制备乳液与乳液法反应制备微载体：
将1L花生油充分预冷后，在充分搅拌条件下，将步骤(1)制备好的水相溶液加入至花生油中，充分乳化适当时间后，将乳液转移至容器中置于-80℃冰箱，继续反应12小时。
(3)微载体的清洗与收集：
12小时后，将乳液从-80℃冰箱中拿出，室温解冻后，充分搅拌的条件下加入0.1M的氢氧化钠溶液将乳液pH值调节为8-9，继续搅拌适当时间后，离心或过滤去除液相，使用充分预冷的丙酮和乙醇对微载体进行洗涤，洗涤结束后将微载体充分溶胀在水中，使用自动筛分机筛选出需求粒径范围内(125-250μm)的微载体，冷冻干燥后获得多孔微载体。将多孔微载体进行扫描电子显微拍摄。其扫描电镜照片如图7所示，可见制备得到的微载体具有疏松多孔结构，适合干细胞的规模化扩增。
实施例5基于明胶、纤连蛋白与透明质酸制备可充分裂解的多孔微载体
(1)制备水相溶液：
称取9.5g明胶、0.1g纤连蛋白(fibronectin)和0.4g透明质酸，加入100mL去离子水后配成水溶液，调节溶液pH值为5.7，加入10g二甲基亚砜，充分混合均匀后预冷，加入1.5mL的戊二醛溶液。
(2)制备乳液与乳液法反应制备微载体：
将1L蓖麻油充分预冷后，在充分搅拌条件下，将步骤(1)制备好的水相溶液加入至蓖麻油中，充分乳化适当时间后，将乳液转移至容器中置于-80℃冰箱，继续反应18小时。
(3)微载体的清洗与收集：
18小时后，将乳液从-80℃冰箱中拿出，室温解冻后，充分搅拌的条件下加入0.5M的硼氢化钠溶液将乳液pH值调节为8-9，继续搅拌适当时间后，离心或过滤去除液相，使用充分预冷的丙酮和乙醇对微载体进行洗涤，洗涤结束后将微载体充分溶胀在水中，使用自动筛分机筛选出需求粒径范围内的微载体(125-250μm)，冷冻干燥后获得多孔微载体。将多孔微载体进行扫描电子显微拍摄。其扫描电镜照片如图8所示，可见制备得到的微载体具有疏松多孔结构，适合干细胞的规模化扩增。
实施例6基于细胞外基质溶液与透明质酸制备可充分裂解的多孔微载体
(1)制备水相溶液：
在100mL浓度为30mg/mL的细胞外基质溶液中加入0.5g透明质酸，充分混合均匀后调节溶液pH值为6.7，加入1g二甲基亚砜，充分混合均匀后预冷，加入1mL的戊二醛溶液。
(2)制备乳液与乳液法反应制备微载体：
将1L石油醚充分预冷后，在充分搅拌条件下，将步骤(1)制备好的水相溶液加入至石油醚中，充分乳化适当时间后，将乳液转移至容器中置于-20℃冰箱，继续反应24小时。
(3)微载体的清洗与收集：
24小时后，将乳液从-80℃冰箱中拿出，室温解冻后，充分搅拌的条件下加入0.5M的硼氢化钠溶液将乳液pH值调节为8-9，继续搅拌适当时间后，离心或过滤去除液相，使用充分预冷的丙酮和乙醇对微载体进行洗涤，洗涤结束后将微载体充分溶胀在水中，使用自动筛分机筛选出需求粒径范围内的微载体(125-250μm)，冷冻干燥后获得多孔微载体。将多孔微载体进行扫描电子显微拍摄。其扫描电镜照片如图9所示，可见制备得到的微载体具有疏松多孔结构，适合干细胞的规模化扩增。
实施例7多孔微载体的应用
利用上述实施例制备的多孔微载体进行细胞培养实验。
1、细胞接种与扩增：
将获得的多孔微载体灭菌后，称取200mg的微载体，待其在细胞培养液中浸润溶胀后加入300万人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)悬液进行悬浮培养。
2、裂解：
细胞培养结束后，将长满了细胞的多孔微载体转移至离心管中，待自然沉降(也可300g离心2min)后去除上清液，加入30mL胰酶替代物(如购自Gibco，12605028)，放入37℃培养箱裂解30min，离心去除上清液，且将收获的细胞用PBS洗涤3次。
3、结果：
取10mg实施例1制备的多孔微载体，加入5mL胰酶替代物溶液(购自Gibco，12605028)，37℃下孵育30min后置于显微镜下观察，如图10所示，微载体被充分裂解；如图11所示，干细胞在多孔微载体上接种并扩增3天后，进行live/dead染色，仅观察到布满整个微载体的绿色荧光(标记活细胞)，而未观察到红色荧光(标记死细胞)，说明本发明制备的多孔微载体十分适合干细胞的贴壁与增殖；如图12所示，细胞扩增结束后(细胞接种后第8天)，取部分微载体进行live/dead染色，依旧未观察到红色荧光，说明细胞在扩增期间活力良好，且微载体在细胞扩增的过程中保持了足够的稳定性；将步骤(2)中收集到的细胞悬液置于显微镜下观察，从图13可知，除去细胞外，未观察到任何微载体颗粒或其碎片，说明本发明制备的微载体在细胞扩增结束后亦可以被胰酶替代物充分裂解。
取实施例4制备的多孔微载体，当细胞接种1天后，取样测得其接种细胞数量为268万，算得其接种率为89.33％；同时取样进行死/活染色，结果如图14所示，可见干细胞(绿色荧光)均匀的接种在微载体的孔径中，以上数据说明本发明制备的微载体十分适合干细胞的悬浮接种；同时取样进行HE切片分析，如图15所示，在微载体的孔隙中发现了大量的干细胞，进一步证实在悬浮培养体系中，细胞可以有效接种在本发明制备的微载体的孔隙中；
当细胞接种3天后，取样进行死/活染色，结果如图16所示，视野中未观察到红色荧光(代表死细胞)，均匀而明亮的绿色荧光(代表活细胞)在微载体上均匀铺展，且较接种1天后密度更高，说明接种上的细胞在本发明制备的微载体上实现了显著的增殖；
细胞接种7天后，取样进行死/活染色，结果如图17所示，可见干细胞已经均匀的布满了整个微载体的孔径表面，此时干细胞扩增结束，停止搅拌，静置后去除上清液，将微载体用胰酶替代物裂解后离心，去除上清液且用PBS将收获的细胞洗涤3次，取样置于显微镜下观察，从图18中结果可知，本发明通过巧妙控制微载体的交联度，经过裂解微载体后，收获的细胞悬液中不存在微载体或其碎片；同时测得收获细胞的活率为97.25％，收获细胞总数为2307万，扩增倍数为7.69倍，整个扩增过程中的细胞扩增曲线如图19所示。
对比例1
将实施例1中加入的甲醛溶液变为10μL，其余条件不变。由于交联度不够，在细胞培养的过程中，重组胶原微载体发生了解体，如图20所示。
对比例2
将实施例1中加入的甲醛溶液变为12mL，其余条件不变。由于过度交联，在细胞扩增结束后，重组胶原多孔微载体不能被胰酶替代物充分裂解，在裂解结束后，细胞悬液中混有未被充分裂解的微载体碎片，如图21所示。
对比例3
参照本发明实施例4中相同方法制备多孔微载体，不同的是使用戊二醛体积浓度为0.001％。
所制备得到的多孔微载体经灭菌后重新分散于水溶液中，置于37℃下8h后，微载体发生了解体，如图22所示。
对比例4
参照本发明实施例4中相同方法制备多孔微载体，不同的是使用戊二醛体积浓度为10％。
参照实施例7的实验方法，将所制备得到的多孔微载体接种细胞进行悬浮扩增结束后，单纯使用胰酶替代物不能将其充分裂解，在裂解产物中出现了大量微载体碎片，如图23所示。
对比例5
市购北京华龛生物科技有限公司生产的多孔三维微载体，参照实施例7的实验方法进行实验，当其接种细胞进行悬浮扩增结束后，单纯使用胰酶替代物不能将其充分裂解，在裂解产物中出现了大量完整的微载体，如图24所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.多孔微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备生物大分子溶液；
提供人源化基因重组胶原蛋白溶液和/或可降解生物大分子溶液或其混合溶液；
S2.制备水相溶液：
将步骤S1的生物大分子溶液调节pH值至4.0-9.0后预冷，与试剂A充分混合，得到均匀混合液；再添加体积终浓度为0.01-5％或质量终浓度为0.001-8％的试剂C，混合均匀，得水相溶液；
其中，所述试剂A包括试剂B或离子盐；所述试剂B选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇、二甘醇、乙二醇丁醚、丙二醇丁醚、二氯甲烷、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、乙二醇丁醚醋酸酯、二甲基亚砜、甲酰胺中的至少一种；
所述试剂C选自戊二醛、甲醛、京尼平、转谷酰胺酶、硫酸铵、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、二环己基碳二亚胺中的至少一种；
S3.乳液法反应制备微载体：
将油相溶剂充分预冷后，将步骤S2的水相溶液加入到油相溶剂中进行乳化，得到W/O型乳液；将乳液迅速冷却后转移至-20℃或更低温度，继续反应不低于6小时；
S4.微载体的清洗与收集：
取出乳液，待其融化，去除液体成分，沉淀物清洗干净后，筛分出所需粒径范围内的颗粒，冻干后获得分散的三维微载体，即为可充分裂解的多孔微载体。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述生物大分子溶液的质量浓度为2-25％，生物大分子溶液与试剂A的质量比为5-22000。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述离子盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸一氢钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸镁、硝酸钠、硝酸钾、氯化镁、氯化钾、氯化钙、氯化钠和氯化钡中的至少一种。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述油相溶剂选自乙醇、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、季铵化物、正丙醇、异丙醇、氨基酸型表面活性剂、甜菜碱型表面活性剂、丙二醇、卵磷脂、丙三醇、甲苯、正己烷、食用油、二甲苯、石油醚、蓖麻油、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、吐温、、聚山梨酯、净洗剂6501、花生油、大豆油、烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、司盘、橄榄油、山茶油、液态石蜡、环己烷、氢氟醚、油酸酯、亚油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸/癸酸甘油三酯、油酸/亚油酸甘油三酯中的至少一种；所述水相溶液和油相溶剂的体积比为1:2-1:30。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S4中，乳液融化后先用中和液进行中和，所述中和液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、磷酸钠溶液、磷酸钾溶液、磷酸氢钠溶液、磷酸氢钾溶液、氨水、硼氢化钠溶液、氰基硼氢化钠溶液、硼氢化钾溶液中的至少一种。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S4中，清洗沉淀物所用清洗试剂选自去离子水、酒精、丙酮、无水乙醇、正己烷、异丙醇、氢氟醚、叔丁醇中的至少一种。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述可降解生物大分子选自可降解的人工合成大分子和/或天然大分子；
所述人工合成大分子选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乙交酯、聚二氧六环酮、聚富马酸二羟丙酯、聚酸酐、聚羟基丁酸、聚乙二醇及其衍生物、聚酰胺、聚赖氨酸、聚苯乙烯、聚丙烯、聚吡咯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)及其衍生物、聚原酸酯和聚缩醛中的至少一种；
所述天然大分子选自海藻酸盐、壳聚糖及其衍生物、葡聚糖及其衍生物、壳寡糖及其衍生物、透明质酸及其衍生物、普鲁兰多糖及其衍生物、胶原蛋白、蚕丝及其衍生物、明胶及其衍生物、细胞外基质中的单一组分或混合物、细胞外基质的降解产物、琼脂和糖蛋白中的至少一种。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当可降解生物大分子同时包含人工合成大分子，以及天然大分子时，人工合成大分子的质量浓度介于0-50％，天然大分子的质量浓度介于50-100％。
9.由权利要求1-8任一所述方法制备得到的可充分裂解的多孔微载体。
10.权利要求9所述可充分裂解的多孔微载体，其特征在于，其具有如下特征，粒径介于25-1000微米，孔径介于10-200微米，孔隙率介于70-99％，能被胰酶替代物完全裂解。
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