CN115820552A - 细胞三维培养支架及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞三维培养支架，是通过以下方法制备得到的：围产期组织依次用水、NaCl溶液、PBS溶液浸泡处理，反复冻融，粉碎，脱细胞处理，水解磷脂，降解核酸，冻干，得细胞外基质粉末；胃蛋白酶处理，冻干即得。本发明的细胞三维培养支架在培养细胞中的应用。本发明还公开了利用该细胞三维培养支架培养细胞的方法。本发明的细胞三维培养支架，保留了围产期组织中丰富的内源性生长因子等细胞可以识别的激活信号，增强细胞间信号的转导作用，利于细胞的高效增殖。培养细胞时无需胶原酶的长时间处理，有效避免了胶原酶、胰蛋白酶长时间处理或连续物理剪切力作用造成的细胞损伤。本发明对于细胞的培养和收集具有十分重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞三维培养支架及其制备方法与应用，属于细胞培养技术领域。
背景技术
传统的二维细胞培养技术被用于体外扩增培养不同类型的细胞，以进行医学、生物学、药学的相关研究。通常被培养的细胞在聚酯或玻璃表面进行平面生长。然而，二维细胞培养时细胞之间的接触抑制会极大地延缓细胞增殖的速度和效果，同时所培养的细胞在平面培养的条件下增殖会逐渐丧失原有的生理特征，导致培养的细胞形态、结构、形状和功能的丧失。为了增加细胞增殖的速度以及维持培养细胞的生理特性，基于三维细胞培养的动态培养体系已被开发。三维细胞培养技术可以实现细胞在三维载体空间结构中的迁移、生长，这一技术既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势，维持细胞原有的生理特性。
现有技术中的细胞三维培养扩增载体技术主要有两种方式。其中一种方式是利用微载体的形式构建细胞的三维培养空间，如CN 112245658 A公开了一种可注射晶胶微球细胞扩增载体及其制备方法，CN 109837235 A公开了水凝胶微载体在细胞的黏附、扩增、冻存和消化中的应用，CN 113201525 A公开了干细胞微球组及干细胞的体外扩增方法和应用；这种三维培养细胞技术可以有效地提高细胞扩增效率，维持细胞生理特性，但是在细胞收集的过程中，需要较长时间的胶原酶、胰蛋白酶处理，不可避免地对细胞的生理活性造成较大影响。另一种方式是无载体的动态培养系统，如CN 102796701 A公开了体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，CN 113755481 A公开了一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用；这些技术均基于无载体动态培养系统，细胞采取搅拌等物理方法实现悬浮，虽然可以避免胶原酶、胰蛋白酶处理对细胞造成的损伤，但包括剪切力在内的多种因素直接作用于细胞本身，也会导致细胞的物理损伤。因此需要更加安全、有效、快速的细胞培养方式。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种细胞三维培养支架，及其制备方法。本发明还提供了该细胞三维培养支架在培养细胞中的应用，还提供了一种利用该细胞三维培养支架培养细胞的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种细胞三维培养支架的制备方法，包括以下步骤：
(一)取围产期组织，剪碎，依次用水、NaCl溶液、PBS溶液浸泡处理，反复冻融，匀浆粉碎，加入SDS溶液或Triton-X100溶液进行脱细胞处理，加入含苯甲基磺酰氟、抑酶肽或亮抑酶肽的磷脂酶A水解磷脂，加入含苯甲基磺酰氟、抑酶肽或亮抑酶肽的DNase(脱氧核糖核酸酶)和RNase(核糖核酸酶)降解核酸，冻干，得细胞外基质粉末；所述围产期组织选自脐带、羊膜、绒毛膜、蜕膜；
(二)细胞外基质粉末用含胃蛋白酶的盐酸处理后，调整pH至中性，冻干，得细胞外基质预凝胶，即为细胞三维培养支架。
进一步地，所述步骤(一)具体如下：
(1)将新鲜或冰冻的围产期组织剪碎，用PBS溶液清洗，去除残余血液；
(2)加入0.5～10倍(重量倍数)的水，浸泡10～120分钟，优选30分钟；离心(100～150g，5分钟)，弃去上清；
(3)加入0.5～10倍的NaCl溶液(重量体积倍数，g:ml，下同)，浸泡1～6小时，优选3小时；离心(100～150g，5分钟)，弃去上清；所述NaCl溶液的浓度为0.8～1.2mol/L；
(4)加入0.5～10倍(重量体积倍数)的PBS溶液，浸泡0.5～6小时，优选1小时；离心(100～150g，5分钟)，弃去上清；
(5)用PBS溶液漂洗3～10次，离心(100～150g，5分钟)弃去PBS溶液，将围产期组织剪碎成0.5～1cm3的小块；
(6)于-80℃条件下冷冻8～48小时，优选24小时，然后于37℃的水浴中彻底解冻；如此反复冻融1～10次，优选5次；
(7)加入0.5倍的水，使用匀浆机彻底粉碎(50～60Hz，1～5分钟)，离心(10000～20000g，5分钟)，弃去上清；
(8)加入0.5～10倍(重量体积倍数)的1％ Triton-X100溶液或SDS溶液(体积分数)，浸泡0.5～6小时以脱细胞，优选1小时，离心(10000～20000g，5分钟)，弃去上清；
(9)加入0.5～10倍的水，漂洗10～120分钟，优选30分钟，离心(10000～20000g，5分钟)，弃去上清；重复漂洗1～10次；
(10)加入0.5～10倍(重量体积倍数)的含有苯甲基磺酰氟、抑酶肽或亮抑酶肽的磷脂酶A溶液，浸泡水解磷脂2～24小时，优选12小时，离心(10000～20000g，5分钟)，弃去上清；所述磷脂酶A的浓度为50～500U/mL，优选100U/mL，所述苯甲基磺酰氟的浓度为0.05-10mM/mL，优选0.5mM/mL，所述抑酶肽的浓度为0.5～100μg/mL，优选10μg/mL，所述亮抑酶肽的浓度为5～500μg/mL，优选50μg/mL；
(11)加入0.5～10倍的水，漂洗10～120分钟，优选30分钟，离心(10000～20000g，5分钟)，弃去上清；重复漂洗1～10次；
(12)加入0.5～10倍(重量体积倍数)的含有苯甲基磺酰氟、抑酶肽或亮抑酶肽混合DNase和RNase的NaCl溶液，浸泡降解核酸2～24小时，优选12小时，离心(10000～20000g，5分钟)，弃去上清；所述NaCl溶液中，NaCl的浓度为0.8～1.2mol/L，DNase的浓度为50～500U/mL，优选100U/mL，RNase的浓度为50～500μg/mL，优选100μg/mL，所述苯甲基磺酰氟的浓度为0.05-10mM/mL，优选0.5mM/mL，所述抑酶肽的浓度为0.5～100μg/mL，优选10μg/mL，所述亮抑酶肽的浓度为5～500μg/mL，优选50μg/mL；
(13)加入0.5～10倍的水，漂洗10～120分钟，优选30分钟，离心(10000～20000g，5分钟)，弃去上清；重复漂洗1～10次；
(14)于-80℃条件下冷冻8～48小时，优选24小时，然后在-50℃条件下冻干，得细胞外基质粉末，用环氧乙烷或γ射线灭菌(5～25kGy)，保存，备用。
进一步地，所述步骤(二)具体如下：将细胞外基质粉末加入到含1～10mg/ml胃蛋白酶的0.01～0.1mol/L盐酸中，细胞外基质粉末的浓度为1～20mg/ml，置于恒温搅拌器(0～30℃)搅拌增溶2～96小时；调节pH值至7.2～7.4(使用1mol/L的NaOH溶液)；于-80℃条件下冷冻8～48小时，优选24小时，然后在-50℃、20Pa条件下冻干，得细胞外基质预凝胶，保存，备用。
进一步地，所述步骤(一)中的浸泡、漂洗，均是置于恒温摇床上，在37℃条件下摇匀。
进一步地，所述步骤(二)中，盐酸的浓度为0.01mol/L，胃蛋白酶的浓度为4mg/ml，搅拌增溶时间为8小时。
利用上述制备方法制备得到的细胞三维培养支架。
所述细胞三维培养支架在培养细胞中的应用，所述培养的细胞可以是脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐静脉内皮细胞等。
一种利用上述细胞三维培养支架培养细胞的方法，包括以下步骤：
(三)细胞外基质微凝胶的制备与培养：将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，加入细胞悬液，于37℃条件下孵育，形成细胞外基质微凝胶；将细胞外基质微凝胶置于培养液中培养；
或：将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，于37℃条件下孵育，形成不含细胞的细胞外基质微凝胶；将不含细胞的细胞外基质微凝胶与细胞悬液混合，置于培养液中培养；
或：将细胞外基质预凝胶与不含细胞的细胞外基质微凝胶混合，二者体积比为0.5～2:0.5～2，优选1:1，置于培养液中培养；
(四)培养细胞的收集：培养液离心，加入PBS溶液溶解细胞外基质微凝胶，加入胶原酶，处理0.5～2小时，离心，收集得到培养的细胞。
进一步地，所述步骤(三)具体如下：
(1)4℃条件下，将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，细胞外基质预凝胶的浓度为2～20mg/ml，优选10mg/ml；
(2)加入0.5～2倍(体积倍数)的细胞悬液，充分混匀，得混合液；所述细胞悬液中细胞的浓度为1×105～1×107/ml，优选1×106/ml；
(3)将混合液注入到模具(使用10μl排枪)(所述模具的材质为聚乙烯、聚四氟乙烯等疏水材料)中，于37℃的恒温箱中孵育20～60分钟，优选30分钟，形成细胞外基质微凝胶；
(4)收集细胞外基质微凝胶，置于培养液(选择相应细胞的培养液，常规市场购买得到)中培养3～21天，优选7天，隔天更换培养液。
进一步地，所述步骤(三)还可以具体如下：
(1)4℃条件下，将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，细胞外基质预凝胶的浓度为2～20mg/ml，优选10mg/ml；
(2)注入到模具(使用10μl排枪)中，于37℃的恒温箱中孵育20～60分钟，优选30分钟，形成不含细胞的细胞外基质微凝胶；
(3)将不含细胞的细胞外基质微凝胶与0.5～2倍(体积倍数)的细胞悬液混合，所述细胞悬液中细胞的浓度为1×105～1×107/ml，优选1×106/ml；置于培养液(选择相应细胞的培养液，常规市场购买得到)中培养3～21天，优选7天，隔天更换培养液。
进一步地，所述步骤(三)还可以具体如下：
(1)4℃条件下，将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，细胞外基质预凝胶的浓度为2～20mg/ml，优选10mg/ml；加入0.5～2倍(体积倍数)的细胞悬液，充分混匀，得混合液；所述细胞悬液中细胞的浓度为1×105～1×107/ml，优选1×106/ml；将混合液注入到模具(使用10μl排枪)(所述模具的材质为聚乙烯、聚四氟乙烯等疏水材料)中，于37℃的恒温箱中孵育20～60分钟，优选30分钟，形成细胞外基质微凝胶；
(2)4℃条件下，将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，细胞外基质预凝胶的浓度为2～20mg/ml，优选10mg/ml；注入到模具(使用10μl排枪)中，于37℃的恒温箱中孵育20～60分钟，优选30分钟，形成不含细胞的细胞外基质微凝胶；
(3)将细胞外基质微凝胶与不含细胞的细胞外基质微凝胶混合，置于培养液(选择相应细胞的培养液，常规市场购买得到)中培养3～21天，优选7天，隔天更换培养液。
进一步地，所述步骤(四)具体如下：
(1)细胞的培养液，离心(500～5000g，5分钟；优选800g)，收集细胞外基质微凝胶；
(2)加入5～20倍(体积倍数)的PBS溶液，于4℃条件下静置0.5～5小时，优选1小时，溶解细胞外基质微凝胶；
(3)加入终浓度为0.0005～0.02g/mL的胶原酶(优选0.001g/mL)，于37℃条件下处理0.5～2小时，优选0.5小时；
(4)离心(500～5000g，5分钟；优选1200g)，收集培养的细胞。
本发明的细胞三维培养支架，是以围产期组织制成的，培养人源性细胞时可采用人源性围产期组织，避免了人源性细胞培养扩增过程中使用异种细胞外基质可能带来的种属差异风险，脱细胞处理有效地去除了组织原有的细胞成分，避免了细胞膜外表面抗原所带来的相关免疫风险。同时保留了围产期组织中丰富的内源性生长因子等细胞可以识别的激活信号，增强细胞间信号的转导作用，利于细胞的高效增殖。用于培养细胞时，配合专用培养液可以实现多种不同细胞短时间的快速扩增；细胞外基质微凝胶在生理条件下可以实现溶胶到凝胶的转变，并具有在远离生理条件下重新分散的特性，使用降温、稀释的方法实现微凝胶的分散，可以减少胶原酶的处理时间，实现细胞的分离和富集，有效避免了胶原酶、胰蛋白酶长时间处理或连续物理剪切力作用造成的细胞损伤。可以使用简单的含细胞的胞细胞外基质微凝胶和不含细的胞细胞外基质微凝胶共混的方式，或使用细胞悬液和不含细胞的细胞外基质微球共混的方式，实现细胞在细胞外基质微凝胶之间的迁移，不需重复制作含细胞的凝胶微球，操作简便。本发明对于细胞的培养和收集具有十分重大的应用价值。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：细胞外基质微凝胶的形貌示意图。
图2：细胞外基质微凝胶的形貌示意图。
图3：不同处理方法后羊膜中DNA含量对比示意图。
图4：不同培养方法的细胞数量对比示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1细胞三维培养支架的制备与细胞的培养
将新鲜的脐带剪碎成小块，用1×PBS溶液清洗除去残余血液后，加入1倍的蒸馏水，37℃浸泡摇匀30分钟，150g离心5分钟弃去上清。再加入组织1倍的1M NaCl溶液，37℃浸泡摇匀3小时，150g离心5分钟弃去上清。随后，加入1倍的1×PBS溶液，37℃漂洗1小时，150g离心5分钟弃去上清，重复5次。漂洗的组织在-80℃(24小时)和37℃反复冻融5次后，加入0.5倍蒸馏水，在60Hz、3分钟的条件下彻底粉碎，12000g离心5分钟弃去上清得到组织匀浆。组织匀浆加入1倍的1％SDS溶液，37℃脱细胞1小时，12000g离心5分钟弃去上清后使用1倍的蒸馏水反复漂洗5次，每次30分钟。漂洗后的组织匀浆使用1倍含0.5mM/mL苯甲基磺酰氟的100U/mL磷脂酶A溶液浸泡摇匀12小时，12000g离心5分钟后用1倍的蒸馏水反复漂洗3次，每次30分钟。漂洗后的组织匀浆使用1倍含有10μg/mL抑酶肽、100U/ml DNase和100μg/mlRNase的1M NaCl溶液37℃浸泡摇匀12小时，12000g离心5分钟后用1倍的蒸馏水反复漂洗3次，每次30分钟。脱细胞组织匀浆-80℃冷冻24小时后于-50℃、20Pa条件下冻干24小时。细胞外基质冻干粉使用15kGy剂量的γ射线灭菌。将细胞外基质冻干粉加入等体积含有4mg/ml胃蛋白酶的0.01M HCl溶液中，20℃搅拌增溶8小时后，在4℃环境中使用1M NaOH溶液调节pH值至7.4。
加入等体积细胞量为1×106/ml的脐带间充质干细胞悬液，充分混匀后使用10μl排枪将预凝胶注入到聚乙烯模具中，37℃孵育30分钟形成细胞外基质微凝胶(如图1、2所示)。
细胞外基质微凝胶在含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中培养5天后，800g离心收集微凝胶，并加入10倍的1×PBS溶液于4℃环境中溶解1小时，加入0.001g/mL胶原酶处理0.5小时，1200g离心5分钟，收集培养的脐带间充质干细胞。
实施例2细胞三维培养支架的制备与细胞的培养
将新鲜的羊膜剪碎成小块，用1×PBS溶液清洗出去残余血液后，加入1倍的蒸馏水，37℃浸泡摇匀30分钟，150g离心5分钟弃去上清。再加入组织1倍的1M NaCl溶液，37℃浸泡摇匀3小时，150g离心5分钟弃去上清。随后，加入1倍的1×PBS溶液，37℃漂洗1小时，150g离心5分钟弃去上清，重复5次。漂洗的组织在-80℃(24小时)和37℃反复冻融5次后，加入0.5倍蒸馏水，在50Hz、2分钟的条件下彻底粉碎，并使用12000g离心5分钟弃去上清得到组织匀浆。组织匀浆加入1倍的1％Triton-X100溶液，37℃脱细胞1小时，12000g离心5分钟弃去上清后使用1倍的蒸馏水反复漂洗5次，每次30分钟。漂洗后的组织匀浆使用1倍含10μg/mL抑酶肽的100U/mL磷脂酶A溶液浸泡摇匀12小时，12000g离心5分钟后用1倍的蒸馏水反复漂洗3次，每次30分钟。漂洗后的组织匀浆使用1倍含有50μg/mL亮抑酶肽、100U/ml DNase和100μg/ml RNase的1M NaCl溶液37℃浸泡摇匀12小时，12000g离心5分钟后用1倍的蒸馏水反复漂洗3次，每次30分钟。脱细胞组织匀浆-80℃冷冻24小时后于-50℃、20Pa条件下冻干24小时。细胞外基质冻干粉使用环氧乙烷灭菌。将细胞外基质冻干粉加入等体积含有6mg/ml胃蛋白酶的0.01M HCl溶液中，15℃搅拌增溶8小时后，在4℃环境中使用1M NaOH调节pH值至7.4。
加入等体积细胞量为1×106/ml的脂肪间充质干细胞悬液，充分混匀后使用10μl排枪将预凝胶注入到聚四氟乙烯模具中，37℃孵育30分钟形成细胞外基质微凝胶。细胞外基质微凝胶在含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中培养3天后，800g离心收集微凝胶，并加入10倍的1×PBS于4℃环境中溶解1小时，加入0.001g/mL胶原酶处理0.5小时，1200g离心5分钟收集培养的脂肪间充质干细胞。
实施例3细胞三维培养支架的制备与细胞的培养
将新鲜的蜕膜剪碎成小块，用1×PBS溶液清洗出去残余血液后，加入1倍的蒸馏水，37℃浸泡摇匀30分钟，150g离心5分钟弃去上清。再加入组织1倍的1M NaCl溶液，37℃浸泡摇匀3小时，150g离心5分钟弃去上清。随后，加入1倍的1×PBS溶液，37℃漂洗1小时，150g离心5分钟弃去上清，重复5次。漂洗的组织在-80℃(24小时)和37℃反复冻融5次后，加入0.5倍蒸馏水，在50Hz、2分钟的条件下彻底粉碎，并使用12000g离心5分钟弃去上清得到组织匀浆。组织匀浆加入1倍的1％Triton-X100溶液，37℃脱细胞1小时，12000g离心5分钟弃去上清后使用1倍的蒸馏水反复漂洗5次，每次30分钟。漂洗后的组织匀浆使用1倍含50μg/mL亮抑酶肽的100U/mL磷脂酶A溶液浸泡摇匀12小时，12000g离心5分钟后用1倍的蒸馏水反复漂洗3次，每次30分钟。漂洗后的组织匀浆使用1倍含有0.5mM/mL苯甲基磺酰氟、100U/mlDNase和100μg/ml RNase的1M NaCl溶液37℃浸泡摇匀12小时，12000g离心5分钟后用1倍的蒸馏水反复漂洗3次，每次30分钟。脱细胞组织匀浆-80℃冷冻24小时后于-50℃、20Pa条件下冻干24小时。细胞外基质冻干粉使用15kGy剂量的γ射线灭菌。将细胞外基质冻干粉加入等体积含有6mg/ml胃蛋白酶的0.01M HCl溶液中，15℃搅拌增溶8小时后，在4℃环境中使用1M NaOH调节pH值至7.4。
使用10μl排枪将预凝胶注入到聚四氟乙烯模具中，37℃孵育30分钟形成不含细胞的细胞外基质微凝胶。在不含细胞的细胞外基质微凝胶加入等体积细胞量为1×106/ml的脐静脉内皮细胞悬液，并在含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素、20ng/ml EGF的DMEM/F12培养基中培养7天后，800g离心收集微凝胶，并加入10倍的1×PBS于4℃环境中溶解1小时，加入0.001g/mL胶原酶处理0.5小时，1200g离心5分钟收集培养的脐静脉内皮细胞。
实施例4DNA含量测定
使用Solarbio PicoGreenDNA定量检测试剂盒对新鲜羊膜和脱细胞样品(羊膜分别经SDS脱细胞技术处理、Triton-X100脱细胞技术处理)中残留DNA进行定量分析，步骤如下：
(A)提取DNA：
(1)冷冻干燥脱细胞脐带完全浸入无菌水中3～5min复水；取10mg脐带组织移入预冷的研钵中，快速用力研磨成匀浆；
(2)加入350μl的Buffer PBS和0.9μl的RNase A后温和研磨30s；
(3)收集350μl研磨好的组织匀浆转入2ml离心管；
(4)加入150μl的Proteinase K，立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管置于56℃水浴10min；
(5)加入500μl的Buffer TE，漩涡振荡30s混合均匀，12000g离心10min；
(6)将上述离心后的上清液移至96孔板中，配成浓度梯度为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml溶液各100μl；
(B)测定DNA含量：
(1)打开微型荧光酶标仪并使其预热。将激发波长设置为488nm和发射波长为520nm。
(2)在环境温度下以488nm激发和520nm发射测定样品和空白对照的荧光值；
(3)用标准品溶液的浓度(ng/mL)对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线；
(4)根据标准曲线，计算新鲜和脱细胞脐带样品中残留DNA含量。
结果如图3所示，由图可知，新鲜羊膜中DNA含量为350.45±20.56μg/mg，分别经SDS、Triton-X100脱细胞技术处理后，羊膜中DNA含量分别为2.83±1.12μg/mg和14.4±2.26μg/mg，DNA残留显著减少。
实施例5细胞扩增
使用培养瓶2D培养、Matrigel基质胶上3D培养和围产期组织细胞外基质支架3D培养脂肪间充质干细胞进行细胞扩增测试，步骤如下：
(A)培养瓶2D培养脂肪间充质干细胞
(1)脂肪间充质干细胞用PBS洗一次，胰酶消化并制备单细胞悬液，室温下1200g离心5分钟沉淀细胞；
(2)用含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞，调节细胞密度至5×105个/mL，分装于培养瓶中，置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
(3)继续培养3至7天，每2天更换一次含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基。培养结束后，加入0.25％胰蛋白酶处理2分钟，1200g离心5分钟收集培养的脂肪间充质干细胞。
(B)Matrigel基质胶上3D培养脂肪间充质干细胞：
(1)使用前将Matrigel基质小瓶浸入置于4℃冰箱的冰中过夜解冻。Matrigel解冻后，旋转小瓶以确保混匀；
(2)向预冷的24孔板中加入8-11mg/mL浓度为200μL/孔的Matrigel，用移液枪头迅速均匀铺开，在37℃下孵育30分钟使Matrigel成胶；
(3)脂肪间充质干细胞用PBS洗一次，胰酶消化并制备单细胞悬液，室温下1200g离心5分钟沉淀细胞；
(4)用含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞，调节细胞密度至5×105个/mL，取250μL细胞悬液加入到Matrigel包被的24孔板中，37℃下孵育30分钟；
(5)冰上冷却含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基，加入终浓度0.8-1.1mg/mL的Matrigel基质。取250μL的Matrigel基质/培养液混合物，轻轻加入到24孔板中；
(6)继续培养3至7天，每2天更换一次Matrigel基质/培养液混合物。培养结束后，加入0.25％胰蛋白酶处理0.5小时，1200g离心5分钟收集培养的脂肪间充质干细胞。
(C)围产期组织细胞外基质支架3D培养脂肪间充质干细胞：细胞扩增过程见实施例2。
结果如图4所示，由图4可知，本发明的三维培养细胞方法的效果最佳，收获细胞数量明显优于另外两种方法。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种细胞三维培养支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)取围产期组织，剪碎，依次用水、NaCl溶液、PBS溶液浸泡处理，反复冻融，匀浆粉碎，加入SDS溶液或Triton-X100溶液进行脱细胞处理，加入DNase和RNase降解核酸，冻干，得细胞外基质粉末；所述围产期组织选自脐带、羊膜、绒毛膜、蜕膜；
(二)细胞外基质粉末用含胃蛋白酶的盐酸处理后，调整pH至中性，冻干，得细胞外基质预凝胶，即为细胞三维培养支架。
2.根据权利要求1所述的细胞三维培养支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(一)具体如下：
(1)将新鲜或冰冻的围产期组织剪碎，用PBS溶液清洗，去除残余血液；
(2)加入0.5～10倍的水，浸泡10～120分钟；离心，弃去上清；
(3)加入0.5～10倍的NaCl溶液，浸泡1～6小时；离心，弃去上清；所述NaCl溶液的浓度为0.8～1.2mol/L；
(4)加入0.5～10倍的PBS溶液，浸泡0.5～6小时；离心，弃去上清；
(5)用PBS溶液漂洗3～10次，离心弃去PBS溶液，将围产期组织剪碎成0.5～1cm3的小块；
(6)于-80℃条件下冷冻8～48小时，然后于37℃的水浴中彻底解冻；如此反复冻融1～10次；
(7)加入0.5倍的水，使用匀浆机彻底粉碎，离心，弃去上清；
(8)加入0.5～10倍的1％Triton-X100溶液或SDS溶液，浸泡0.5～6小时以脱细胞，离心，弃去上清；
(9)加入0.5～10倍的水，漂洗10～120分钟，离心，弃去上清；重复漂洗1～10次；
(10)加入0.5～10倍的含有苯甲基磺酰氟、抑酶肽或亮抑酶肽的磷脂酶A溶液，浸泡水解磷脂2～24小时，离心，弃去上清；
(11)加入0.5～10倍的水，漂洗10～120分钟，，离心，弃去上清；重复漂洗1～10次；
(10)加入0.5～10倍的含有苯甲基磺酰氟、抑酶肽或亮抑酶肽混合DNase和RNase的NaCl溶液，浸泡降解核酸2～24小时，离心，弃去上清；
所述NaCl溶液中，NaCl的浓度为0.8～1.2mol/L，DNase的浓度为50～500U/mL，RNase的浓度为50～500μg/mL；
(11)加入0.5～10倍的水，漂洗10～120分钟，离心，弃去上清；重复漂洗1～10次；
(12)于-80℃条件下冷冻8～48小时，然后在-50℃条件下冻干，得细胞外基质粉末。
3.根据权利要求1所述的细胞三维培养支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(二)具体如下：将细胞外基质粉末加入到含1～10mg/ml胃蛋白酶的0.01～0.1mol/L盐酸中，细胞外基质粉末的浓度为1～20mg/ml，0～30℃条件下搅拌增溶2～96小时；调节pH值至7.2～7.4；于-80℃条件下冷冻8～48小时，然后在-50℃、20Pa条件下冻干，得细胞外基质预凝胶。
4.利用权利要求1～3中任一项所述的细胞三维培养支架的制备方法制备得到的细胞三维培养支架。
5.权利要求4所述的细胞三维培养支架在培养细胞中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述培养的细胞选自脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐静脉内皮细胞。
7.一种利用权利要求4所述的细胞三维培养支架培养细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(三)细胞外基质微凝胶的制备与培养：将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，加入细胞悬液，于37℃条件下孵育，形成细胞外基质微凝胶；将细胞外基质微凝胶置于培养液中培养；
或：将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，于37℃条件下孵育，形成不含细胞的细胞外基质微凝胶；将不含细胞的细胞外基质微凝胶与细胞悬液混合，置于培养液中培养；
或：将细胞外基质预凝胶与不含细胞的细胞外基质微凝胶混合，二者体积比为0.5～2:0.5～2，置于培养液中培养；
(四)培养细胞的收集：培养液离心，加入PBS溶液溶解细胞外基质微凝胶，加入胶原酶，处理0.5～2小时，离心，收集得到培养的细胞。
8.根据权利要求7所述的培养细胞的方法，其特征在于：所述培养的细胞选自脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐静脉内皮细胞。
9.根据权利要求7所述的培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(三)具体如下：
(1)4℃条件下，将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，细胞外基质预凝胶的浓度为2～20mg/ml；
(2)加入0.5～2倍的细胞悬液，充分混匀，得混合液；所述细胞悬液中细胞的浓度为1×105～1×107/ml；
(3)将混合液注入到模具中，于37℃的恒温箱中孵育20～60分钟，形成细胞外基质微凝胶；
(4)收集细胞外基质微凝胶，置于培养液中培养3～21天，隔天更换培养液；
或：
(1)4℃条件下，将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，细胞外基质预凝胶的浓度为2～20mg/ml；
(2)注入到模具中，于37℃的恒温箱中孵育20～60分钟，形成不含细胞的细胞外基质微凝胶；
(3)将不含细胞的细胞外基质微凝胶与0.5～2倍的细胞悬液混合，所述细胞悬液中细胞的浓度为1×105～1×107/ml；置于培养液中培养3～21天，隔天更换培养液；
或：
(1)4℃条件下，将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，细胞外基质预凝胶的浓度为2～20mg/ml；加入0.5～2倍的细胞悬液，充分混匀，得混合液；所述细胞悬液中细胞的浓度为1×105～1×107/ml；将混合液注入到模具中，于37℃的恒温箱中孵育20～60分钟，形成细胞外基质微凝胶；
(2)4℃条件下，将细胞外基质预凝胶溶解在PBS溶液中，细胞外基质预凝胶的浓度为2～20mg/ml；注入到模具中，于37℃的恒温箱中孵育20～60分钟，形成不含细胞的细胞外基质微凝胶；
(3)将细胞外基质微凝胶与不含细胞的细胞外基质微凝胶混合，置于培养液中培养3～21天，隔天更换培养液。
10.根据权利要求7所述的培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(四)具体如下：
(1)细胞的培养液，离心，收集细胞外基质微凝胶；
(2)加入5～20倍的PBS溶液，于4℃条件下静置0.5～5小时，溶解细胞外基质微凝胶；
(3)加入终浓度为0.0005～0.02g/mL的胶原酶，于37℃条件下处理0.5～2小时；
(4)离心，收集培养的细胞。
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