CN116836266B - 一种羊脊柱髓核胶原蛋白及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胶原蛋白提取方法，公开了一种羊脊柱髓核胶原蛋白及其提取方法，提取方法包括以下步骤：先将切开的羊脊柱去除去除结缔组织和弹性纤维后提取髓核；然后用胰蛋白酶酶解，得到去细胞髓核；接着用核酸酶酶解，得到去核酸髓核；最后经酸酶结合法提取、离子平衡、透析得到羊脊柱髓核胶原蛋白。本发明同时利用胰蛋白酶和核酸酶对纤维环进行酶解，大大减少细胞碎片和核酸碎片对羊脊柱纤维环胶原蛋白提取效率的影响，有效解决了传统纤维环内胶原蛋白提取过程中杂质较多，胶原蛋白纯度和提取效率不足的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白，尤其涉及了一种胶原蛋白提取方法。
背景技术
髓核是由神经元、多种纤维蛋白与神经纤维构成的生物体控制中枢，是人类和动物维持生命活性的重要组分。
胶原蛋白作为髓核中最主要的成分之一，对髓核内神经元细胞的包裹与支撑，神经纤维的保护，以及多种神经核群的构建起到至关重要作用。除此之外，胶原蛋白作为自然界中分布最为广泛的一种糖蛋白，也借助其自身特殊的三螺旋结构受到广泛关注。
在食品领域，胶原蛋白被认为是具有极高营养价值的天然增稠剂、增粘剂；在医美领域，胶原蛋白由于其高度生物相容性而被广泛用在皮肤填充、保湿和抗衰老产品中；在科研领域，胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分而被用于细胞3D培养、伤口愈合、药物递送和人工血管等生物材料的研发中。
羊作为被人类最早驯化的家畜之一，其自身需求量随着人类社会进步和生活水平提高而逐年增加。然而占肉质原料重量10％-15％的羊脊柱则通常被视为非肉质边角料(除特殊用途外)而被抛弃。
羊脊柱髓核中胶原蛋白的提取恰好为羊脊柱边角料的处理提供了渠道，不但实现了生物资源的再生，同时利用髓核来源的胶原蛋白独有特性也能够实现促进骨骼健康、增强骨组织生长相关医美产品的生产。
目前，胶原蛋白提取的传统方法包括热水提取法、酸提取法、酶提取法和碱提取法等，但上述方法由于提取时间较长(产业化中时间通常长达数周)，容易对提取容器与设备造成严重腐蚀，对原料造成二次污染。
同时，由于羊脊柱髓核中含有多种神经细胞，传统方法提取后细胞碎片、核酸碎片、以及多种细胞内杂蛋白无法去除，造成提取所得的羊脊柱髓核胶原蛋白杂质较多，纯度和提取率较低等工业生产问题。
发明内容
本发明针对现有技术中羊脊柱髓核中胶原蛋白的提取问题，提供了一种羊脊柱髓核胶原蛋白及其提取方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法，其包括以下步骤：
步骤S1、将切开的羊脊柱去除结缔组织和弹性纤维后提取髓核，羊脊柱为普通羊脊柱；
步骤S2、将步骤S1中得到的髓核碎化后用胰蛋白酶酶解，得到去细胞髓核；
步骤S3、将步骤S2中得到的去细胞髓核用核酸酶酶解，得到去核酸髓核；
步骤S4、将步骤S3中得到的去核酸髓核清洗后经酸酶结合法提取得到髓核胶原蛋白上清液；
步骤S5、对步骤S4中髓核胶原蛋白上清液调节pH平衡和离子平衡，得到髓核胶原蛋白溶液；
步骤S6、利用透析袋对步骤S5得到的髓核胶原蛋白溶液进行透析；步骤S7、透析后经冻干得到羊脊柱髓核胶原蛋白。
作为优选，步骤S1中具体包括以下步骤：
步骤S11、对切开的羊脊柱剔除结缔组织和弹性纤维；
步骤S12、利用清洗液清洗3次，清洗后提取髓核，其中清洗液为灭菌水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基溶液。
作为优选，步骤S2中具体包括以下步骤：
步骤S21、将髓核剪成或切成小块，其中小块髓核的尺寸优选为1～3cm X 1～3cm。
步骤S22、将小块的髓核浸泡于胰蛋白酶溶液中酶解，得到去细胞髓核，其中胰蛋白酶包括酸性胰蛋白酶、中性胰蛋白酶、碱性胰蛋白酶，髓核与胰蛋白酶溶液的质量体积比为0.1g～2g:40～80mL，胰蛋白酶溶液浓度为0.1％～0.6％，更优选为0.4％。
作为优选，步骤S22中浸泡时间为24～48h，浸泡温度为30℃～37℃，更优选为37℃，浸泡过程更换六次胰蛋白酶溶液，优选每4h更换一次胰蛋白酶溶液。将髓核浸泡于胰蛋白酶溶液中能够有效去除髓核中多种细胞，如神经元细胞或神经胶质细胞，能够有效减少细胞内杂蛋白对目标胶原蛋白提取的影响，提高胶原蛋白提取效率。
作为优选，步骤S3中具体为将去细胞髓核浸泡于核酸酶溶液中酶解，得到去核酸髓核，其中核酸酶包括核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸内切酶、核糖核酸外切酶、脱氧核糖核酸外切酶中的一种或多种，去细胞髓核与核酸酶溶液的质量体积比为0.5g～3g:50～200mL，核酸酶溶液浓度为3％～8％，更优选5％；浸泡时间为8～16h，浸泡温度为30℃～37℃，更优选为37℃。
将去细胞髓核浸泡于核酸酶溶液中能够有效去除髓核中多种核酸，如脱氧核糖核酸，通过该种核酸酶处理，可以有效减少破碎细胞外泄核酸对目标胶原蛋白提取的影响，有效减少胶原蛋白内杂质含量，减少酸酶法提取时间，提高胶原蛋白提取效率。
作为优选，步骤S4中具体包括以下步骤：
步骤S41、将去核酸髓核浸泡于清洗液中，得到去杂质髓核；其中清洗液包括磷酸盐缓冲液、浓度为1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液或灭菌水；浸泡时间优选为24～48h，更优选为48h。
步骤S42、去杂质髓核经酸酶结合法提取，得到髓核胶原蛋白上清液，其中，酸酶结合法具体为将去杂质髓核加入酸溶液中，其中，
酸酶结合法中所使用的酸溶液为浓度为0.3～0.8mol/L的乙酸或盐酸溶液，优选为0.5mol/L的乙酸溶液；酸酶结合法所使用的酶为胃蛋白酶，胃蛋白酶用量与酶解的髓核质量之比为1～3：10～15，优选之比为1：8，酸酶结合法提取温度为1～8℃，提取时间为24～48h；
步骤S43、酸酶结合法提取完成后使用2000g～8000g超速离心，优选5000g，得到髓核胶原蛋白上清液。
作为优选，步骤S5中具体包括以下步骤：
步骤S51、将髓核胶原蛋白上清液静置24～48h；
步骤S52、利用2～8mol/L的NaOH溶液进行对髓核胶原蛋白上清液进行pH平衡调节；
步骤S53、用体积为髓核胶原蛋白上清液体积5-15倍的磷酸盐缓冲液对经步骤S52调节后的髓核胶原蛋白上清液进行离子平衡调节,得到髓核胶原蛋白溶液。
作为优选，步骤S6中透析袋的截留分子量为5000～10000，优选为7500透析时间为24～48h，优选为24h。
作为优选，步骤S7中冷冻干燥温度为-40℃～-80℃；冻干时间为24～72h，优选为48h。
一种羊脊柱髓核胶原蛋白，其采用一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法提取得到，提取得到的羊脊柱髓核胶原蛋白具有II型胶原蛋白特征，含有至少一条α链和一条β链。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：
本发明有效去髓核来源胶原蛋白中的杂蛋白，不仅可以制备得到高纯度的胶原蛋白，且其可以有效提高胶原蛋白的提取率。所提取的胶原蛋白动感后呈出白色海绵状固体,水溶性良好，与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度。
附图说明
图1为本发明实施例1中髓核胶原蛋白提取前与提取后实物对比图。
图2为本发明实施例1中髓核胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
图3为本发明实施例1髓核胶原蛋白的细胞粘附性柱状图。
图4为实施例1中髓核胶原蛋白的细胞相容性柱状图。
图5为本发明实施例1～5、对比例1～4髓核胶原蛋白提取率柱状图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
如图1-图5所示，一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：
步骤S1、取剔除结缔组织和弹性纤维的羊脊柱；
步骤S2、利用PBS清洗3次，随后将髓核剪成1cm×1cm的小块，得到所述碎化髓核后，将髓核浸泡0.4％浓度的胰蛋白酶溶液于37℃下中酶解36h，得到去细胞髓核，浸泡过程中每4h更换一次胰蛋白酶溶液。
步骤S3、将去细胞髓核浸泡5％浓度的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中酶解于37℃下中酶解12h，得到去核酸髓核。
步骤S4、将去核酸髓核浸泡于聚乙二醇辛基苯基醚溶液(1％)中清洗48h，然后将清洗后的髓核称重并加入0.5mol/L乙酸溶液中，随后向混合液中加入髓核重量1/8的胃蛋白酶，于4℃下酶解24h，酶解完成后用5000g超速离心，得到髓核胶原蛋白上清液。
步骤S5、将上清液静置24h，随后利用5mol/L的NaOH溶液将上清液pH调节至7.0，并用加入5倍上清液体积的磷酸盐缓冲液对上清液调节离子平衡，得到所述髓核胶原蛋白溶液。
步骤S6、得到所述髓核胶原蛋白溶液后，利用截留分子量7500的透析袋将溶液透析24h。
步骤S7、随后于-80℃下冻干48h，得到羊脊柱髓核胶原蛋白(图1)。
本实施例中对所得羊脊柱髓核胶原蛋白进行SDS-PAGE电泳测试，测试结果证明所得蛋白为胶原蛋白，没有杂带，纯度较高(图2)；利用人胚肺成纤维细胞(NHFL)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)人非小细胞肺癌细胞(A549)对所得羊脊柱髓核胶原蛋白进行细胞黏附(图3)与细胞相容性实验(图4)，测试结果证明所得髓核胶原蛋白生物相容性良好，可促进细胞黏附。
本实施例所述的羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法可有效去髓核来源胶原蛋白中的杂蛋白，不仅可以制备得到高纯度的胶原蛋白，且其可以有效提高胶原蛋白的提取率。所提取的胶原蛋白动感后呈出白色海绵状固体,水溶性良好，与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度。
所制得的胶原蛋白除可广泛应用于医美的皮肤保湿、填充产品外，也可也用于可生物医用植入材料、神经元细胞3D培养与神经纤维修复材料、药物递送材料的制备和生产。
同时采用该种方法能够有效解决羊脊柱边角料的浪费，有效实现了生物资源的再生。其所得到的羊脊柱髓核胶原蛋白可以达到工程医用材料的要求，填补国内市场髓核胶原蛋白空白，且还具有操过简单，易于工业化的特点。
实施例2
同实施例1，所不同的是本实施例步骤S2中将髓核浸泡于0.4％浓度的胰蛋白酶溶液于37℃下中酶解24h。
实施例3
同实施例1，所不同的是本实施例步骤S2中将髓核浸泡于0.2％浓度的胰蛋白酶溶液中。
实施例4
同实施例1，所不同的是本实施例步骤S3中将去细胞髓核浸泡于5％浓度的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中酶解于37℃下中酶解16h。
实施例5
同实施例1，所不同的是本实施例步骤S3中将去细胞髓核浸泡于3％浓度的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中。
对比例1
同实施例1，所不同的是本实施例具体包括以下步骤：
步骤S1、取剔除结缔组织和弹性纤维的羊脊柱；
步骤S2、利用PBS清洗3次，随后将髓核剪成1cm×1cm的小块，得到所述碎化髓核后，将髓核浸泡0.4％浓度的胰蛋白酶溶液于37℃下中酶解36h，得到去细胞髓核，浸泡过程中每4h更换一次胰蛋白酶溶液。
步骤S3、将去细胞髓核浸泡于聚乙二醇辛基苯基醚溶液(1％)中清洗48h，然后将清洗后的髓核称重并加入0.5mol/L乙酸溶液中，随后向混合液中加入髓核重量1/8的胃蛋白酶，于4℃下酶解24h，酶解完成后用5000g超速离心，得到髓核胶原蛋白上清液。
步骤S5、将上清液静置24h，随后利用5mol/L的NaOH溶液将上清液pH调节至7.0，并用加入5倍上清液体积的磷酸盐缓冲液对上清液调节离子平衡，得到所述髓核胶原蛋白溶液。
步骤S6、得到所述髓核胶原蛋白溶液后，利用截留分子量7500的透析袋将溶液透析24h。
步骤S7、随后于-80℃下冻干48h，得到羊脊柱髓核胶原蛋白。
对比例2
同实施例1，所不同的是本实施例具体包括以下步骤：
步骤S1、取剔除结缔组织和弹性纤维的羊脊柱；
步骤S2、利用PBS清洗3次，随后将髓核剪成1cm×1cm的小块，得到碎化髓核。
步骤S3、将碎化髓核浸泡5％浓度的脱氧核糖内切酶核酸酶溶液中酶解于37℃下中酶解12h，得到去核酸髓核。
步骤S4、将去核酸髓核浸泡于聚乙二醇辛基苯基醚溶液(1％)中清洗48h，然后将清洗后的髓核称重并加入0.5mol/L乙酸溶液中，随后向混合液中加入髓核重量1/8的胃蛋白酶，于4℃下酶解24h，酶解完成后用5000g超速离心，得到髓核胶原蛋白上清液。
步骤S5、将上清液静置24h，随后利用5mol/L的NaOH溶液将上清液pH调节至7.0，并用加入5倍上清液体积的磷酸盐缓冲液对上清液调节离子平衡，得到所述髓核胶原蛋白溶液。
步骤S6、得到所述髓核胶原蛋白溶液后，利用截留分子量7500的透析袋将溶液透析24h。
步骤S7、随后于-80℃下冻干48h，得到羊脊柱髓核胶原蛋白。
对比例3
采用传统胶原蛋白提取方式提取羊脊柱髓核胶原蛋白，具体操作步骤为：
步骤S1、取剔除结缔组织和弹性纤维的羊脊柱。
步骤S2、利用PBS清洗3次，随后将髓核剪成1cm×1cm的小块。步骤S3、得到所述碎化髓核后，将清洗后的髓核称重并加入0.5mol/L乙酸溶液中；随后向混合液中加入髓核重量1/8的胃蛋白酶，于4℃下酶解24h。
步骤S4、酶解完成后用5000g超速离心，将上清液静置24h。
步骤S5、向髓核胶原蛋白上清液中加入NaCl直至的混合液中NaCl的最终浓度为5mol/L，静置24h后，5000g离心取沉淀，得到盐析髓核胶原蛋白。
步骤S6、随后利用灭菌水将盐析髓核胶原蛋白复溶利用截留分子量7500的透析袋将溶液透析24h，随后于-80℃下冻干48h，得到羊脊柱髓核胶原蛋白。
如图5所示，通过实施例1与实施例2和实施例3的胶原蛋白提取率对比，说明本发明羊脊柱髓核胶原蛋白的提取过程中，胰蛋白酶的最佳使用浓度为0.4％，酶解时间为36h。
通过实施例1与实施例4和实施例5的胶原蛋白提取率对比，说明本发明羊脊柱髓核胶原蛋白的提取过程中，核酸酶的最佳使用浓度为5％，酶解时间为12h。
通过实施例1～5和对比例1与对比例2的胶原蛋白提取率对比，说明本发明羊脊柱髓核胶原蛋白的提取过程中，由于同时通过对髓核进行胰蛋白酶与核酸酶处理，可以有效避免因单独使用胰蛋白酶导致的核酸污染，或因单独使用核酸酶导致的细胞去除不足造成的杂蛋白污染，因而胰蛋白酶和核酸酶的结合处理会更加显著增加胶原蛋白提取率。
通过实施例1～5和对比例3的胶原蛋白提取率对比，说明本发明羊脊柱髓核胶原蛋白的提取方法对于羊脊柱髓核中的胶原蛋白提取率显著优于传统胶原蛋白提取方法。
实施例6
一种羊脊柱髓核胶原蛋白，如图1所示，其采用实施例1-5任意一个实施例中的羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法提取得到，提取得到的羊脊柱髓核胶原蛋白具有II型胶原蛋白特征，含有至少一条α链和一条β链。
所得到的羊脊柱髓核胶原蛋白溶解性良好，可以高浓度(＞30mg/mL)溶解于多种溶剂(如灭菌水、乙酸、盐酸等)。
容易理解的是，本领域技术人员在本申请提供的一个或几个实施例基础上，可以对本申请的实施例进行结合、拆分、重组等得到其他实施例，这些实施例均没有超出本申请的保护范围。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法，其特征在于其包括以下步骤：
步骤S1、将切开的羊脊柱去除结缔组织和弹性纤维后提取髓核；
步骤S2、将步骤S1中得到的髓核碎化后用胰蛋白酶酶解，得到去细胞髓核；
步骤S3、将步骤S2中得到的去细胞髓核用核酸酶酶解，得到去核酸髓核；
步骤S4、将步骤S3中得到的去核酸髓核清洗后经酸酶结合法提取得到髓核胶原蛋白上清液；
步骤S5、对步骤S4中髓核胶原蛋白上清液调节pH平衡和离子平衡，得到髓核胶原蛋白溶液；
步骤S6、对步骤S5得到的髓核胶原蛋白溶液进行透析；
步骤S7、透析后经冷冻干燥得到羊脊柱髓核胶原蛋白；
步骤S2具体包括以下步骤：
步骤S21、将髓核剪成或切成小块；
步骤S22、将小块的髓核浸泡于胰蛋白酶溶液中酶解，得到去细胞髓核，髓核与胰蛋白酶溶液的质量体积比为0.1g～2g:40～80mL，胰蛋白酶溶液浓度为0.1％～0.6％，浸泡时间为24～48h，浸泡温度为30℃～37℃，浸泡过程每4h更换一次胰蛋白酶溶液；
步骤S3中具体为将去细胞髓核浸泡于核酸酶溶液中酶解，得到去核酸髓核，其中去细胞髓核与核酸酶溶液的质量体积比为0.5g～3g:50～200mL，核酸酶溶液浓度为3％～8％，浸泡时间为8～16h，浸泡温度为30℃～37℃；
步骤S4中具体包括以下步骤：
步骤S41、将去核酸髓核浸泡于清洗液中，得到去杂质髓核；其中清洗液包括磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液或灭菌水；
步骤S42、去杂质髓核经酸酶结合法提取，得到髓核胶原蛋白上清液，其中，酸酶结合法具体为将去杂质髓核加入酸溶液中，其中，
酸酶结合法中所使用的酸溶液为浓度为0.3～0.8mol/L的乙酸或盐酸溶液，酸酶结合法所使用的酶为胃蛋白酶，胃蛋白酶用量与酶解的髓核质量之比为1～3：10～15，酸酶结合法提取温度为1～8℃，提取时间为24～48h；
步骤S43、酸酶结合法提取完成后使用2000g～8000g超速离心，得到髓核胶原蛋白上清液。
2.根据权利要求1所述的一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法，其特征在于，步骤S1具体包括以下步骤：
步骤S11、对切开的羊脊柱剔除结缔组织和弹性纤维；
步骤S12、利用清洗液清洗3次，清洗后提取髓核，其中清洗液为灭菌水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基溶液。
3.根据权利要求1所述的一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法，其特征在于，步骤S5中具体包括以下步骤：
步骤S51、将髓核胶原蛋白上清液静置24～48h；
步骤S52、利用2～8mol/L的NaOH溶液进行对髓核胶原蛋白上清液进行pH平衡调节；
步骤S53、用磷酸盐缓冲液对经步骤S52调节后的髓核胶原蛋白上清液进行离子平衡调节,得到髓核胶原蛋白溶液。
4.根据权利要求1所述的一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法，其特征在于：步骤S6中透析袋的截留分子量为5000～10000，透析时间为24～48h。
5.根据权利要求1所述的一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法，其特征在于：步骤S7中冷冻干燥温度为-40℃～-80℃；冻干时间为24～72h。
6.一种羊脊柱髓核胶原蛋白，其特征在于：其采用权利要求1-5任意一项所述的一种羊脊柱髓核胶原蛋白提取方法提取得到，提取得到的羊脊柱髓核胶原蛋白具有II型胶原蛋白特征，含有至少一条α链和一条β链。
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