CN112760351A - 一种鱼皮胶原蛋白的提取方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于胶原蛋白提取技术领域，尤其涉及一种鱼皮胶原蛋白的提取方法及应用。本发明提供了一种快速提取非变性鱼皮胶原的方法，解决淡水鱼加工副产物浪费的问题，克服了传统胶原蛋白提取方法提取率低，提取时间长的缺点；本发明技术方法简单可行，提取时间短，提取效率高，最重要的是保证了胶原大分子结构的完整性，相比于其他方法大大缩短了提取时间。本发明在传统“酸‑酶”结合法提取胶原蛋白之前对其进行超声处理，保证所提鱼皮胶原分子的天然活性，通过测定得到的鱼皮胶原保持Ⅰ型胶原蛋白的天然结构，为非变性的Ⅰ型胶原蛋白。该方法操作简单，耗能较低，提取效率高，易于放大应用于生产。

Description

一种鱼皮胶原蛋白的提取方法及应用
技术领域
本发明属于胶原蛋白提取技术领域，尤其涉及一种鱼皮胶原蛋白的提取方法及应用。
背景技术
我国水产资源丰富，淡水鱼加工过程中产生大量鱼皮、鱼鳞等加工副产物，约占水产品总量的40％-60％。而胶原主要分布于鱼皮和鱼鳞这些副产物中，其中鱼皮胶原含量高达25％，且主要为高价值的Ⅰ型胶原。由于来源充足，将鱼皮作为提取Ⅰ型胶原的主要原料不仅可以避免浪费大量宝贵资源、提高鱼类加工的附加值、减少环境污染；同时还可获得良好的经济效益与社会效益；另外水生生物的抗原性比陆生哺乳动物源性胶原蛋白的抗原性更弱，且更易提取；并具备较高的水溶解度；最重要的是水生动物源胶原避免了陆生哺乳动物源性疾病和病原体传播的风险。因此使用鱼皮、鱼鳞等加工副产物作为提取Ⅰ型胶原原材料具有广阔的研究前景，而如何在快速、高效提取的同时避免破坏胶原分子结构逐渐成为当前研究的热点与重点。
Ⅰ型胶原已被公认为是最有用的生物材料之一，与其他生物材料相比，具有极好的生物相容性，能够促进细胞的黏附、生长、增殖、分化。广泛应用于骨组织修复材料、人工皮肤材料、人造血管、心脏瓣膜或细胞移植装置等。国内外提取水产品中胶原常用方法有酸法、碱法、盐法及酶提法。酸法提取法提取时间短，且能在最大程度上保持胶原分子结构完整，保持天然活性，尤其适用于生物医用材料的制备。但胶原末端存在醛基相互作用和分子共价交联作用，导致酸溶出的胶原量较少；另外酸提取法还存在溶剂残留、设备受腐蚀和环境污染等问题。碱法操作简单、提取速度快，但碱法会造成肽键水解，胶原分子中含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏，产生消旋。因此，实际应用相对较少。盐法指的是一定浓度的中性盐溶液如NaCl、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、柠檬酸盐等可使胶原溶解。在提取过程中使用NaCl使胶原表面电荷增加，从而与水分子间的作用力增强，加速胶原的溶出。但当盐浓度过高时盐析反应会降低得率。酶法提取是目前最常用的方法，酶法提取胶原，具有提取时间短、得率高，且对环境污染较小等特点；同时由于酶法提取条件温和所以能获得具有良好生物活性的胶原。但酶法提取最大的问题就是水解不够彻底，为了提高胶原得率的同时保证胶原具有良好生物活性，探究新型提取方式就显得尤为重要。
超声辅助提取鱼皮胶原的原理主要有两个：一是由于超声波产生空化效应和机械效应能够让溶剂有效、迅速地进入组织内部，使组织结构变松散，胶原纤维发生膨胀，加快了后续提取中醋酸溶液进入纤维间隙的速度，从而加快提取效率；二是松散的组织结构更易在后续酶解过程中与胃蛋白酶的酶切位点结合，提高酶解效率(Defu Li,2009)。研究表明适当功率下超声处理只将胶原的部分氢键轻微破坏，既不影响三股螺旋结构的完整性又提高活性胶原的提取率，在生物大分子分离提取方面成效显著(梁建华2016)。梁建华等人研究超声波辅助提取鱼皮中非变性胶原蛋白的方法，超声波辅助提取能够显著提高胶原蛋白的得率，超声辅助提取30min胶原蛋白的得率为28.32％(较传统搅拌提取12h高8.0％)，随着超声脉冲时间的增加，胶原蛋白的得率也增加，SDS电泳表明超声辅助提取能够促进胶原蛋白多聚链的溶解(梁建华，2015)。对超声辅助胃蛋白酶酶提鳙鱼鱼鳞胶原蛋白工艺进行研究，最终得出超声波功率420W、超声时间30min、固液比1：15(g/mL)、胃蛋白酶用量6％、酶解液pH 1、酶提时间3h。在此条件下,胶原蛋白提取率为56.01％。紫外-可见分光光度仪、傅立叶变换红外光谱仪和X-射线衍射分析仪的表征及氨基酸分析仪的分析表明,产品为Ⅰ型胶原蛋白,其氨基酸成分和含量与典型的哺乳动物和鱼类胶原蛋白基本一致(万丽娟，熊磊，2017)。
现有技术如中国发明专利授权文献，授权公告号为CN190336966A，该发明属于天然蛋白提取技术领域，具体涉及以金枪鱼皮为原料、采用脉冲超声辅助酶解提取胶原蛋白的方法。包括原材料脱脂、脱杂蛋白处理，提取、盐析、纯化透析干燥步骤。其中，所述原料处理采用乙醚和NaOH进行脱脂、脱杂蛋白。超声辅助提取步骤为：原料以料液比1:200(mg/mL)浸泡于0.5M乙酸溶液中，于冰浴中均质5min，进行频率为28kHz，功率为100～400W，时间为10～50min；超声结束后加入0.06％(W/V)1800U/g的胃蛋白酶(pH＝2)酶提48h，于4℃下离心得上清液透析后冷冻干燥，即得冻干胶原样品。超声辅助酶提加速胶原蛋白的提取过程，最终制备获得结构完整的I型金枪鱼皮胶原蛋白，能耗较低。该方法提取率虽然有所提高，但超声辅助处理后酶提时间仍然较长，提取效率不高。且长时间高功率超声处理不仅会使得胶原大分子形成热聚集，高强度超声产生的剪切力还会破坏胶原分子结构的完整度，使提取的胶原蛋白失去生物活性。因此，为了保持胶原蛋白的螺旋结构和生物活性，超声条件必须严格控制。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
淡水生物源性胶原蛋白比哺乳动物胶原蛋白更具优势的生物材料，其抗原性更弱而且容易提取；具有更好的生物安全性，不会引起哺乳动物源性疾病和病原体传播，来源充足。但传统提取方式存在提取周期长、提取率较低、不能保证胶原结构的完整性等问题，如何在提高提取率缩短提取时间的同时保证胶原结构的完整性就需要探索新型提取方式。本发明所涉及的鱼皮胶原蛋白的提取方法主要包括脱脂﹑除杂蛋白、超声处理、酶法提取﹑离心、盐析、离心、沉淀溶解﹑盐溶液透析、纯水透析﹑冷冻干燥等步骤。所提取的胶原呈现出白色丝状粉末状并聚集成白色海绵状态固体，溶解性良好。本发明制备的鱼皮胶原可应用于创面修复材料、人工皮肤、可植入医疗材料等产品领域。
本发明是这样实现的，一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：
S1鱼皮预处理：除去鱼肉和色素；
S2脱脂、除杂蛋白：按照料液比1：20的比例，使用NaOH溶液搅拌处理，周期性更换NaOH溶液；之后用蒸馏水洗至中性，按照料液比1：20的比例，使用异丙醇搅拌处理，用蒸馏水洗至中性，沥干；
S3超声处理：将脱脂、除杂蛋白后的鱼皮置于料液为比1：20的醋酸溶液中进行超声破碎处理，超声条件为150-550W，时间为10-30min；
S4酶法提取：取前处理后的鱼皮烘干，按鱼皮干重的2％称取胃蛋白酶，溶于0.5M，pH为2的醋酸溶液中，醋酸体积按料液比1:20计；
S5离心取上清；
S6盐析：调上清液的pH至中性，加入硫酸铵，静置；
S7离心取沉淀；
S8沉淀溶解：将沉淀溶于醋酸溶液中；重复S6-S8的操作；
S9盐溶液透析：用截留分子量为10000D，预处理过的透析袋透析，先用0.04M的磷酸氢二钠透析2天，再用0.02M的磷酸氢二钠透析1天，最后用蒸馏水透析2天；
S10冷冻干燥：将透析后的溶液分装于干燥容器中，冷冻干燥36-50小时，制备出成品为白色海绵状固体。
进一步地，步骤S2中NaOH溶液浓度为0.01M，NaOH溶液处理温度为4℃，处理时间为24h，每8h换一次NaOH；异丙醇溶液浓度为10％，处理条件为4℃搅拌8h。
进一步地，步骤S3中醋酸溶液浓度为0.5M。
进一步地，步骤S3中超声条件为350W，时间为30min。
进一步地，步骤S5中4℃条件下搅拌处理4h后，10000rpm冷冻离心10min。
进一步地，步骤S7中在10000r/min，4℃，冷冻离心15min，取沉淀。
进一步地，步骤S10中冷冻干燥36-50小时。
本发明还披露了如上述的一种鱼皮胶原蛋白的提取方法在鱼皮胶原蛋白提取中的应用。
本发明提供了一种快速提取非变性鱼皮胶原的方法，解决淡水鱼加工副产物浪费的问题，克服了传统胶原蛋白提取方法提取率低，提取时间长的缺点；本发明技术方法简单可行，提取时间短，提取效率高，最重要的是保证了胶原大分子结构的完整性，相比于其他方法大大缩短了提取时间。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)本发明在传统“酸-酶”结合法提取胶原蛋白之前对其进行超声处理，在大大缩短了提取时间，提高了提取率的同时保证所提鱼皮胶原分子的天然活性，通过测定得到的鱼皮胶原保持Ⅰ型胶原蛋白的天然结构，为非变性的Ⅰ型胶原蛋白。该方法操作简单，耗能较低，提取效率高，易于放大应用于生产。
(2)鱼皮等水产品加工副产物，不仅避免浪费大量宝贵资源，还能提高鱼类加工的附加值、减少环境污染。
(3)所提取的胶原蛋白分子具有完整的螺旋结构和生物活性，胶原蛋白分子结构非常稳定，在生物医药学、组织工程、生物材料等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是原料白鲢鱼皮原料图；
图2是对白鲢鱼皮在同一频率下进行不同时间、不同功率超声处理提取鱼皮胶原得率点线图；
图3、4是对白鲢鱼皮在频率为20Hkz下进行不同时间、不同功率超声处理提取鱼皮胶原SDS-PAGE电泳图谱；
图5是对白鲢鱼皮在频率为20Hkz下进行不同功率超声处理30min提取鱼皮胶原CD图谱；
图6是对白鲢鱼皮在频率为20Hkz下进行不同功率超声处理30min提取鱼皮胶原的FT-IR图谱；
图7、图8是对白鲢鱼皮在频率为20Hkz下进行不同功率超声处理30min提取鱼皮胶原扫描电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一种鱼皮胶原蛋白的提取方法及应用，所得的鱼皮胶原与人体胶原在组分上有极高的相似度，在大大缩短提取时间、提高提取率的同时保证胶原分子三螺旋结构的完整性，所制备胶原具有无毒、抗原性低、生物相容性好、易被生物降解、易加工等优点，在医疗、美容、保健等领域均存在巨大应用潜力。具体如下实施例所示。
实施例1制备超声处理功率为150W、250W、350W、450W、550W时间为20min的鱼皮胶原
白鲢鱼皮原料如图1，采用自动去皮机获得鱼皮，并手工去除鱼皮残存鱼肉及黑色杂质。将鱼皮切成5mm×5mm、洗净，粗砂布沥干，称重为163.93g。
脱脂、除杂蛋白：
(1)0.01M NaOH体积为3L，4℃下搅拌24h，每8h换一次NaOH，用蒸馏水反复冲洗至中性，充分沥干
(2)10％异丙醇体积为3L，4℃搅拌8h，用蒸馏水反复冲洗至中性，充分沥干，称重为365.69g。
超声处理：
分别称取脱脂、除杂蛋白后的鱼皮60.16g、60.13g、60.28、60.35、60.80g，将其置于1L的0.5M醋酸溶液中后进行超声处理；使用频率为20KHz的超声细胞破碎仪，探头置于液面1-2cm处进行超声处理。超声功率梯度设置为150W、250W、350W、450W、550W；超声时间设置为20min。
酶法提取：
(1)脱脂、除杂蛋白后的鱼皮水分含量为87.69％，按鱼皮干重的2％分别称取0.156g的胃蛋白酶(1:3000)
(2)在4℃下用电动搅拌器搅拌4h。将酶解液用冷冻离心机在4℃下，转速为10000rpm冷冻离心10min，取上清液体积为720ml。
(3)用10mol/LNaOH溶液对酶解上清液调pH至7.0调至中性的酶解液体积约为780ml，按硫酸铵最终浓度为1.5mol/L，称取154.60g硫酸铵立即加入至酶解液中，搅拌使其溶解。在4℃冰箱中静置过夜，盐析液体积为850ml。
(4)对盐析液在10000r/min，4℃，冷冻离心15min，取沉淀，用800ml的0.5mol/L的醋酸溶解。按第一次盐析的操作调pH至7左右，按硫酸铵最终浓度为1mol/L，称取105.71g硫酸铵立即加入硫酸铵至酶解液中，搅拌使其溶解。在4℃冰箱中静置过夜。对盐析液在10000r/min，4℃，冷冻离心15min，取沉淀，用600ml0.5mol/L的醋酸溶解。
(5)用截留分子量为10000D，预处理过的透析袋透析。透析液为10L，先用0.04M的磷酸氢二钠透析2天，用6L蒸馏水将143.256g的磷酸氢二钠充分溶解与4kg的碎冰混合制成冰水混合物，将装好的透析袋放入其中。每8小时更换透析液一次，保温箱进行保存。再用0.042M的磷酸氢二钠透析1天用，6L蒸馏水将71.56g磷酸氢二钠充分溶解与4kg的碎冰混合制成冰水混合物，最后用蒸馏水透析2天。
(6)将透析后的溶液分装于五个盘子中，冷冻干燥48h，制备出成品为白色海绵状固体。
实施例2制备超声处理功率为150W、250W、350W、450W、550W时间为30min的鱼皮胶原
采用自动去皮机获得鱼皮，并手工去除鱼皮残存鱼肉及黑色杂质。将鱼皮切成5mm×5mm、洗净，粗砂布沥干，称重为121.68g。
脱脂、除杂蛋白：
(1)0.01M NaOH体积为3L，4℃下搅拌24h，每8h换一次NaOH，用蒸馏水反复冲洗至中性，充分沥干。
(2)10％异丙醇体积为3L，4℃搅拌8h，用蒸馏水反复冲洗至中性，充分沥干，称重为271.44g。
超声处理：
分别称取脱脂、除杂蛋白后的鱼皮60.04g、60.35g、60.07、60.15、60.89g，将其置于1L的0.5M醋酸溶液中后进行超声处理；使用频率为20KHz的超声细胞破碎仪，探头置于液面1-2cm处进行超声处理。超声功率梯度设置为150W、250W、350W、450W、550W；超声时间设置为30min。
酶法提取：
(1)取3.04g前处理后的鱼皮在105℃下烘干至恒重，测定水分含量为87.69％，按鱼皮干重的2％分别称取0.156g的胃蛋白酶(1:3000)。
(2)在4℃下用电动搅拌器搅拌4h。将酶解液用冷冻离心机在4℃下，转速为10000rpm冷冻离心10min，取上清液体积约为700ml。
(3)用10mol/LNaOH溶液对酶解上清液调pH至7.0调至中性的酶解液体积约为750ml，按硫酸铵最终浓度为1.5mol/L，称取148.65g硫酸铵立即加入至酶解液中，搅拌使其溶解。在4℃冰箱中静置过夜，盐析液体积为850ml。
(4)对盐析液在10000r/min，4℃，冷冻离心15min，取沉淀，用800ml的0.5mol/L的醋酸溶解。按第一次盐析的操作调pH至7左右，按按硫酸铵最终浓度为1mol/L，称取105.71g硫酸铵立即加入硫酸铵至酶解液中，搅拌使其溶解。在4℃冰箱中静置过夜。对盐析液在10000r/min，4℃，冷冻离心15min，取沉淀，用500ml0.5mol/L的醋酸溶解。
(5)用截留分子量为10000D，预处理过的透析袋透析，进行透析。透析液为10L，先用0.04M的磷酸氢二钠透析2天，用6L蒸馏水将143.256g的磷酸氢二钠充分溶解与4kg的碎冰混合制成冰水混合物，将装好的透析袋放入其中。每8小时更换透析液一次，保温箱进行保存。再用0.042M的磷酸氢二钠透析1天用，6L蒸馏水将71.56g磷酸氢二钠充分溶解与4kg的碎冰混合制成冰水混合物，最后用蒸馏水透析2天。
(6)将透析后的溶液分装于五个盘子中，冷冻干燥48h，制备出成品为白色海绵状固体。
胶原得率的计算：分别将烘干后的白鲢鱼皮和冷冻干燥后的胶原蛋白称重，并按以下公式计算胶原蛋白得率：
胶原得率(％)＝提取物干重(g)÷鱼皮干重(g)×100％
由图2可知，超声处理能够显著提高胶原得率，随着超声功率的增加胶原得率呈现先上升后下降，当超声功率350W 30min时，胶原得率达到最大值46％，之后便开始下降。且当超声功率小于250W时，超声时间对胶原得率的影响不大，当超声功率大于350W时，随着超声时间的延长胶原得率迅速下降。这可能是由于随着超声功率的增大和超声时间的延长会干扰气泡动力学，导致空化效应变差，继而影响得率。说明低功率超声处理能够显著提高胶原得率，但当超声功率继续增加反而不利于提取。因此确定超声350W 30min为鱼皮胶原提取的最佳条件。
实施例1、2中胶原聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
选用7％分离胶和4％浓缩胶，样品上样量为20μL。样品的处理：样品为5mg/ml的胶原溶液，在10000r/min下离心10min除去不溶物，取上清液与十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液按照体积比2：3混合，使胶原浓度为2mg/ml。电泳条件：初始电压80V，电泳时间40min，之后调节电压至110V.电泳时间约为90min，直至样品中的染料迁移至离下端2cm时停止电泳。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色30min，再用乙醇：乙酸：蒸馏水＝5：1：4的混合溶液脱色1h，最后在蒸馏水里浸泡过夜。
不同超声功率及超声时间的电泳条带如图3、4所示：其中，A条带为Marker，选择已知分子量为250KDa、150KDa、100KDa、75KDa的蛋白质进行电泳分析。M-maker；K-未超声；A-超声150W10、20、30min；B-超声250W10、20、30min；C-超声350W10、20、30min；D-超声450W10、20、30min；E-550W10、20、30min，所有胶原样品均有4条比较清晰的条带即：α1、α2、β和γ。α链由α1和α2组成，其中α1谱的宽度明显大于α2，表明该胶原是由2条α1和1条α2肽链组成的三聚体，且β链含量较高，并含有少量的γ链，这是典型的Ⅰ型胶原的特征。其中，γ条带为三条肽链扭结在一起的胶原蛋白分子；β链为两条α肽链的聚合体，它的分子量是α肽链的两倍，分子量在260kDa左右；α1链分子量高于α2链，分子量在130kDa左右。电泳结果表明实验制备的胶原分子完整，分子量大于300kDa，表明提取的胶原为I型胶原。随着超声功率的增大样品中的杂条带逐渐增多，这是由于长时间高功率超声处理导致胶原分子发生断裂，超声时的剪切力将胶原分子剪切成小分子。低功率处理鱼皮胶原电泳图谱较为清晰，并无杂条带出现，说明蛋白纯度较好，基本保持了其原有的结构。
不同超声功率处理的胶原圆二色谱图如图5所示。利用以上实施例2获得的产品，通过前处理，制备0.1mg/mL的胶原蛋白溶液，液池厚度1cm，扫描波长范围190～250nm，扫描速度50nm/min，进行分析。Ⅰ型胶原蛋白溶液在波长220nm左右处出现正吸收峰，在波长198nm左右处出现负吸收峰，其正、负吸收峰均存在，并未出现正吸收峰消失或负吸收峰红移的现象，表明制备的胶原三螺旋结构保持完整，二级结构并没有发生变化。
图6是对白鲢鱼皮在频率为20Hkz下进行不同功率超声处理30min提取鱼皮胶原的FT-IR图谱。其中A-未超声；B-150W30min；C-250W30min；D-350W30min；E-450W30min；F-550W30min。与未超声组对比，超声功率为450W、550W时酰胺A带呈现下降的趋势，说明较高功率超声处理能够破坏胶原中的N-H基团参与形成H键。当H键减少，基团位置会向低的频率移动。不同功率超声处理的鱼皮胶原酰胺B带并无差异，吸收峰均为2924cm-1，表明不同频率超声处理对鱼皮胶原酰胺B带吸收无影响。酰胺I和II峰的振动频率和胶原的分子有序度呈正相关。随着超声功率的增加，酰胺Ⅰ带的吸收峰为1633cm-1并未发生变化，但当超声功率为550W30min时，酰胺Ⅱ带的吸收峰从1545cm-1下降到1536cm-1说明低功率超声处理对胶原分子的有序度影响不大，当高功率长时间超声处理会导致胶原的二级结构发生改变，使胶原分子的有序度降低。表明350W30min并未破坏胶原分子的二级结构，仍保留了天然Ⅰ型胶原的结构。
图7、8是对白鲢鱼皮在频率为20Hkz下进行超声处理提取鱼皮胶原扫描电镜图。在600倍和1000倍下胶原呈现均匀而致密的网络结构。表明所制备胶原为较为疏松多孔的胶原海绵。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1鱼皮预处理：除去鱼肉和色素；
S2脱脂、除杂蛋白：按照料液比1：20的比例，使用NaOH溶液搅拌处理，周期性更换NaOH溶液；之后用蒸馏水洗至中性，按照料液比1：20的比例，使用异丙醇搅拌处理，用蒸馏水洗至中性，沥干；
S3超声处理：将脱脂、除杂蛋白后的鱼皮置于料液为比1：20的醋酸溶液中进行超声破碎处理，超声条件为150-550W，时间为10-30min；
S4酶法提取：取前处理后的鱼皮烘干，按鱼皮干重的2％称取胃蛋白酶，溶于0.5M，pH为2的醋酸溶液中，醋酸体积按料液比1:20计；
S5离心取上清；
S6盐析：调上清液的pH至中性，加入硫酸铵，静置；
S7离心取沉淀；
S8沉淀溶解：将沉淀溶于醋酸溶液中；重复S6-S8的操作；
S9盐溶液透析：用截留分子量为10000D，预处理过的透析袋透析，先用0.04M的磷酸氢二钠透析2天，再用0.02M的磷酸氢二钠透析1天，最后用蒸馏水透析2天；
S10冷冻干燥：将透析后的溶液分装于干燥容器中，冷冻干燥36-50小时，制备出成品为白色海绵状固体。
2.根据权利要求1所述的一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤S2中NaOH溶液浓度为0.01M，NaOH溶液处理温度为4℃，处理时间为24h，每8h换一次NaOH；异丙醇溶液浓度为10％，处理条件为4℃搅拌8h。
3.根据权利要求1所述的一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤S3中醋酸溶液浓度为0.5M。
4.根据权利要求1所述的一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤S3中超声条件为350W，时间为30min。
5.根据权利要求1所述的一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤S5中4℃条件下搅拌处理4h后，10000rpm冷冻离心10min。
6.根据权利要求1所述的一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤S7中在10000r/min，4℃，冷冻离心15min，取沉淀。
7.根据权利要求1所述的一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤S10中冷冻干燥36-50小时。
8.如权利要求1-7任一所述的一种鱼皮胶原蛋白的提取方法在鱼皮胶原蛋白提取中的应用。
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