CN115232203A - 一种提取胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胶原蛋白提取技术领域，公开了一种提取胶原蛋白的方法，包括原料前处理、一次酸解、二次酸解、一次酶解、一次盐析、二次酶解、二次盐析等步骤，本发明综合利用各种酸、中性盐以及复合酶来处理动物原材料，在提高效率的同时，可以去除动物胶原蛋白的端侧肽，以去除动物的免疫原，通过多次离心和层析等方式，去除细菌、病毒、内毒素、杂蛋白等杂质，提取保留生物活性的胶原蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白提取技术领域，特别是涉及一种从动物组织中提取胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是广泛存在于人和动物细胞外基质的一种结构性蛋白，同时也是一种功能蛋白，它与细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑、伤口愈合等密切相关，广泛应用于生物医学研究、生物工程、生物医药、化妆品、化工、食品等领域。
胶原蛋白分子层次结构的第一个证据是在20世纪30年代中期提出的，从此之后，许多知名学者，包括诺贝尔奖获得者克里克、鲍林和 Yonath，以及其他人如布罗茨基、曼和Ramachandran，集中研究胶原单体的构象。三重螺旋“马德拉斯”模型提供了基本上正确结构模型的胶原蛋白分子的结构，正确的处理了每个肽链的构成。
胶原蛋白是三重螺旋结构，一般由两个完全相同的链(α1)和在化学成分稍有不同的额外链(α2)组成。氨基酸组成是胶原典型的蛋白质，特别是胶原的高羟脯氨酸含量。胶原蛋白的氨基酸序列中最常见的图案是甘氨酸-脯氨酸-X和甘氨酸-X-羟基脯氨酸，其中X可以是任何氨基酸，由鱼和哺乳动物皮肤的平均氨基酸组成，除甘氨酸、脯氨酸或羟脯氨酸之外。胶原蛋白的生物活性由该三螺旋结构决定。
研究发现，人类的胶原蛋白家族超过28型，其中Ⅰ型、Ⅲ型含量最多，尤以Ⅰ型为甚，占比最高，动物胶原蛋白和人体胶原蛋白在结构上有着同性结构(Homologous)的相似性。因此，从动物组织中获取胶原蛋白，并做相应处理后，可以作为人类胶原蛋白使用，特别是Ⅰ型胶原蛋白，具有很高的实用价值。目前从动物组织中提取胶原蛋白的方法包括酸法、碱法、盐法和酶法四种，但是单独采用某一种方法提取胶原蛋白的效率较低，而且很难在保留三螺旋结构的同时去除其他杂质。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶原蛋白的提取方法，解决了目前提取胶原蛋白的方法效率低、生物活性低的问题。
为了实现上述目的，本发明提供了一种提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)原料前处理：取动物肌腱进行解冻，去除杂质、清洗、切片、晾干，得到动物肌腱切片；
(2)一次酸解：将所述动物肌腱切片在乙醇溶液，次氯酸钠溶液， Triton-X114溶液中浸泡处理，取出后晾干；
(3)二次酸解：将经过步骤(2)处理的动物肌腱切片在丙酮溶液和Triton-X100溶液的混合溶液，柠檬酸溶液，乙酸和EDTA-2Na溶液的混合溶液，氢氧化钠溶液中浸泡处理，冲洗后晾干；
(4)一次酶解：将经过步骤(3)处理的动物肌腱切片浸泡于胃蛋白酶酶解液中，低温静置、离心，得到的上清液即为胶原蛋白粗液；
(5)一次盐析：在所述胶原蛋白粗液中加入盐析液和SSPE缓冲溶液，搅拌均匀、离心；
(6)二次酶解：取步骤(5)离心后的沉淀物，加入无花果酶酶解液，充分搅拌后低温静置、离心；
(7)二次盐析：取步骤(6)离心后的沉淀物，加入盐析液，充分搅拌后低温静置，加入缓冲溶液调节pH值至7.1±0.05，离心，得到的沉淀物即为胶原蛋白。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(1)包括：
A.将冰冻动物肌腱置于15-20℃环境中解冻，去除表面残余组织，用去离子水冲洗；
B.将经过步骤A处理的动物肌腱用10％过氧化氢溶液浸泡30min，再次处理动物肌腱表面至无杂质残留，用纯化水冲洗、晾干；
C.将经过步骤B处理的动物肌腱切成薄片，浸泡在0.1％的碳酸钠溶液中2h，用蒸馏水冲洗、晾干。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(2)中所述动物肌腱切片在体积浓度为75％的乙醇溶液中浸泡30min，在0.1％次氯酸钠溶液中浸泡1h，在0.1％Triton-X114溶液中浸泡20min。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(3)中所述动物肌腱切片在0.1％丙酮溶液和0.05％Triton-x100溶液的混合溶液中浸泡 30min，在0.1％柠檬酸溶液中浸泡30min，在0.1％乙酸和0.1％EDTA-2Na 溶液中浸泡5min，在0.05％氢氧化钠溶液中浸泡5min。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(4)中所述胃蛋白酶酶解液由胃蛋白酶溶解于体积浓度为25％的乙醇溶液制备而成，且所述胃蛋白酶酶解液的质量体积浓度为0.04％；
所述低温静置的温度为2-8℃，时间为24h；
所述离心转速为8000-10000rpm，离心时间为30min。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(5)中所述一次盐析包括以下步骤：
A.在所述胶原蛋白粗液中加入盐析液充分搅拌，置于2-8℃环境中静置24h，得到盐析粗液；
B.在所述盐析粗液中加入SSPE缓冲溶液，搅拌均匀、离心后去除上清液。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(5)中所述盐析液由氯化钠和氢氧化钠溶于超纯水制备而成，且所述盐析液的pH值为 7.5±0.1；
所述SSPE缓冲溶液由SSPE缓冲剂溶于超纯水制备而成。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(5)中所述离心转速为5000rpm，离心时间为10min。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(6)中所述无花果酶酶解液由无花果酶溶于体积浓度为25％的乙醇溶液制备而成；
所述低温静置的温度为2-8℃，时间为12h；
所述离心转速为15000rpm，离心时间为30min。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(7)中所述盐析液由氯化钾和氢氧化钾溶于超纯水制备而成，且所述盐析液的pH值为 7.5±0.1；
所述低温静置的温度为2-8℃，时间为24h。
优选的，在上述提取胶原蛋白的方法中，步骤(7)中所述缓冲溶液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。
所述离心转速为13000-15000rpm，离心时间为20min。
本发明提供了一种提取胶原蛋白的方法，与现有技术相比，其有益效果在于：
本发明综合利用各种酸、中性盐以及复合酶来处理动物原材料，在提高效率的同时，可以去除动物胶原蛋白的端侧肽，以去除动物的免疫原，通过多次离心和层析等方式，去除细菌、病毒、内毒素、杂蛋白等杂质，提取保留生物活性的胶原蛋白。
附图说明
图1是本发明实施例标准品、产品、中间产物及纯化水的对比示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)取冰冻牛肌腱约100g，在15-20℃清水中解冻，以手术刀剪去除表面残余的筋膜、肌肉等组织，用去离子水冲洗；
(2)用10％的过氧化氢溶液浸泡牛肌腱30min，再次用手术刀剪修剪肌腱表面，确保无其他杂质残留，用纯化水冲洗后，晾干；
(3)将牛肌腱切成1mm×1mm左右的薄片，浸泡在0.1％的碳酸钠溶液中2h，蒸馏水反复冲洗后，晾干；
(4)将牛肌腱切片浸泡在75％乙醇溶液中，振荡搅拌30min，取出后以0.1％次氯酸钠溶液浸泡1h，取出后浸泡在0.1％Triton-X114 溶液中，振荡搅拌20min，取出晾干；
(5)将肌腱切片在0.1％丙酮溶液和0.05％Triton-X100溶液的混合溶液中浸泡20min，振荡搅拌10min，取出后采用注射用水反复冲洗，再浸泡于0.1％柠檬酸溶液中30min，取出后浸泡于0.1％乙酸和0.1％ EDTA-2Na混合溶液中，振荡搅拌5min，取出后浸泡于0.05％氢氧化钠溶液中5min，采用注射用水反复冲洗后晾干；
(6)将0.2g胃蛋白酶加入500ml的25％乙醇溶液，制备得到胃蛋白酶酶解液，将肌腱切片完全浸泡于胃蛋白酶酶解液中，使用玻璃罐作为反应容器，置于2-8℃的低温层析柜静置24h；
(7)初步酶解后，将步骤(6)静置后得到的混悬液在8000-10000rpm的转速下离心30min，取上清液，即为胶原蛋白粗液；将氯化钠和氢氧化钠混合溶于超纯水中，控制PH值在7.5±0.1，制备成盐析液，加入胶原蛋白粗液充分搅拌，置于2-8℃的低温层析柜静置 24h；
(8)将1-2g的SSPE缓冲剂溶于超纯水制成SSPE缓冲液，取出首次盐析后的粗液，与SSPE缓冲液混合，搅拌5min，5000rpm离心10min，弃去上清液；
将0.1g无花果酶溶于25％的乙醇溶液中，制备成无花果酶酶解液，加入离心后的沉淀物，使用玻璃罐作为反应容器，置于2-8℃的低温层析柜静置12h；
(9)对步骤(8)中得到的物质在15000rpm离心30min，弃去上清液，取沉淀物；
将氯化钾和氢氧化钾混合溶于超纯水中，控制PH值在7.5±0.1，制备成盐析液；在离心沉淀物中加入盐析液，充分搅拌后置于2-8℃的低温层析柜静置24h；
(10)在步骤(9)得到的溶液中加入磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，振荡搅拌10min，调整pH值在7.1±0.05，在13000-15000rpm离心20min，得到的沉淀物即为胶原蛋白。
本发明实施例胶原蛋白的提取方法中，以标准样品作为参照，使用蛋白电泳等方法和仪器设备分别检测经过一次盐析后的中间物和最终提取物，具体检测结果参见附图1。
本发明综合利用各种酸、中性盐以及复合酶来处理动物原材料，在提高效率的同时，可以去除动物胶原蛋白的端侧肽，以去除动物的免疫原，通过多次离心和层析等方式，去除细菌、病毒、内毒素、杂蛋白等杂质，提取保留生物活性的胶原蛋白。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的方案而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料前处理：取动物肌腱进行解冻，去除杂质、清洗、切片、晾干，得到动物肌腱切片；
(2)一次酸解：将所述动物肌腱切片在乙醇溶液，次氯酸钠溶液，Triton-X114溶液中浸泡处理，取出后晾干；
(3)二次酸解：将经过步骤(2)处理的动物肌腱切片在丙酮溶液和Triton-X100溶液的混合溶液，柠檬酸溶液，乙酸和EDTA-2Na溶液的混合溶液，氢氧化钠溶液中浸泡处理，冲洗后晾干；
(4)一次酶解：将经过步骤(3)处理的动物肌腱切片浸泡于胃蛋白酶酶解液中，低温静置、离心，得到的上清液即为胶原蛋白粗液；
(5)一次盐析：在所述胶原蛋白粗液中加入盐析液和SSPE缓冲溶液，搅拌均匀、离心；
(6)二次酶解：取步骤(5)离心后的沉淀物，加入无花果酶酶解液，充分搅拌后低温静置、离心；
(7)二次盐析：取步骤(6)离心后的沉淀物，加入盐析液，充分搅拌后低温静置，加入缓冲溶液调节pH值至7.1±0.05，离心，得到的沉淀物即为胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)包括：
A.将冰冻动物肌腱置于15-20℃环境中解冻，去除表面残余组织，用去离子水冲洗；
B.将经过步骤A处理的动物肌腱用10％过氧化氢溶液浸泡30min，再次处理动物肌腱表面至无杂质残留，用纯化水冲洗、晾干；
C.将经过步骤B处理的动物肌腱切成薄片，浸泡在0.1％的碳酸钠溶液中2h，用蒸馏水冲洗、晾干。
3.根据权利要求1所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中所述动物肌腱切片在75％乙醇溶液中浸泡30min，在0.1％次氯酸钠溶液中浸泡1h，在0.1％Triton-X114溶液中浸泡20min。
4.根据权利要求1所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中所述动物肌腱切片在0.1％丙酮溶液和0.05％Triton-X100溶液的混合溶液中浸泡30min，在0.1％柠檬酸溶液中浸泡30min，在0.1％乙酸和0.1％EDTA-2Na溶液中浸泡5min，在0.05％氢氧化钠溶液中浸泡5min。
5.根据权利要求1所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)中所述胃蛋白酶酶解液由胃蛋白酶溶解于25％乙醇溶液制备而成，且所述胃蛋白酶酶解液的质量体积浓度为0.04％；
所述低温静置的温度为2-8℃，时间为24h。
6.根据权利要求1所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(5)中所述一次盐析包括以下步骤：
A.在所述胶原蛋白粗液中加入盐析液充分搅拌，置于2-8℃环境中静置24h，得到盐析粗液；
B.在所述盐析粗液中加入SSPE缓冲溶液，搅拌均匀、离心后去除上清液。
7.根据权利要求1或6所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述盐析液由氯化钠和氢氧化钠溶于超纯水制备而成，且所述盐析液的pH值为7.5±0.1。
8.根据权利要求1所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述无花果酶酶解液由无花果酶溶于25％乙醇溶液制备而成；
所述低温静置的温度为2-8℃，时间为12h。
9.根据权利要求1所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述盐析液由氯化钾和氢氧化钾溶于超纯水制备而成，且所述盐析液的pH值为7.5±0.1；
所述低温静置的温度为2-8℃，时间为24h。
10.根据权利要求1所述的一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述缓冲溶液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。
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| CN (1) | CN115232203A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117143693A (zh) * | 2023-09-11 | 2023-12-01 | 鲟力泰悦(武汉)生物科技有限公司 | 一种护肝鲟鱼蛋白肽酒及其制备工艺 |
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2022
- 2022-07-25 CN CN202210877933.3A patent/CN115232203A/zh active Pending
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