CN113444761B - 一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低免疫原性鱼皮胶原及其制备方法。所述制备方法以鱼皮为原料，经过鱼皮预处理、除杂脱脂、胶原蛋白的粗提及端肽的去除、胶原蛋白的精制及干燥、内毒素灭活等方式得到杂蛋白、脂肪、端肽、内毒素含量明显降低的胶原蛋白。本发明在鱼皮预处理阶段利用过氧化氢、氢氧化钠处理，在一定时间点换液可使鱼皮预处理效果更佳；在提取及进一步脱除免疫原阶段利用乙酸和蛋白酶进行酶切端肽处理，精制冻干得到胶原蛋白成品后通过辐照灭活内毒素。本发明提取方法简单，提取效率较高，得到的胶原蛋白免疫原物质含量低、纯度较高，有效降低胶原蛋白在医用过程中的不良反应，进一步扩大胶原蛋白的应用领域。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白提取技术领域，具体涉及一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是动物体内含量极其丰富的结构蛋白，是一种天然功能性生物大分子。原胶原分子是组成胶原蛋白的基本结构单位，由三条左手螺旋的α-肽链组成，三条α-肽链再通过相互作用缠绕成胶原蛋白的右手超螺旋结构。胶原蛋白具有(Gly-X-Y)n的三肽重复序列，其中X、Y常为脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp）。甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸共同作用，对氢键的形成和维持胶原三螺旋结构具有重要意义。
近年来中国渔业的快速发展，鱼类资源加工过程中产生的副产物增多，从鱼皮中提取胶原蛋白引起了研究者们的广泛关注。鱼皮中胶原蛋白含量丰富，从鱼皮中提取胶原可以提高资源利用率，具有重要的经济意义。另外，从鱼皮中提取的胶原蛋白在低过敏性、吸水性等特性都优于陆生胶原蛋白，具有较好的应用价值。
胶原蛋白因其良好的生物特性，在医疗领域具有广泛的应用。但胶原蛋白中存在的会引发免疫原性的物质如杂蛋白、脂肪、端肽、内毒素等，会使人体产生不良的免疫反应，限制了胶原基生物材料的进一步应用。因此，如何制备出低免疫原性的胶原蛋白成为一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）鱼皮前处理：将巴沙鱼皮去除残肉和结缔组织，剪成小块，用纯水清洗、沥干；
（2）鱼皮中杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除：向沥干的巴沙鱼皮加入过氧化氢-氢氧化钠溶液处理2~6h，巴沙鱼皮与过氧化氢-氢氧化钠溶液的料液比w/v为1:20-1:30；用氯化钠溶液洗净过氧化氢后，加入氢氧化钠溶液搅拌处理3~5h后，用纯水将巴沙鱼皮洗至中性；
（3）鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除：向步骤（2）中获得的巴沙鱼皮中加入乙酸溶液和酸性蛋白酶搅拌48~72h，巴沙鱼皮与乙酸溶液的料液比w/v为1:40~1:60；离心取上清液，得到去端肽的胶原蛋白粗提液；
（4）胶原蛋白的精制及干燥：将氯化钠粉末加入到胶原蛋白粗提液中进行盐析，离心得到胶原蛋白沉淀；将所述胶原蛋白沉淀复溶于乙酸溶液，用弱碱溶液透析至透析外液pH≥8灭酶后，先后用乙酸溶液和超纯水透析，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到冻干的胶原蛋白；
（5）内毒素灭活：将步骤（4）中冻干的胶原蛋白进行辐照处理，灭活细菌及内毒素；获得所述低免疫原性鱼皮胶原蛋白。
本发明中所述w/v中的w单位为g，v的单位为mL。
进一步的，所述制备方法的所有步骤在2~8℃下进行，纯水、过氧化氢-氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、乙酸溶液、弱碱溶液均在2~8℃预冷。
进一步的，所述步骤（2）中过氧化氢-氢氧化钠溶液中过氧化氢的质量浓度为1%~3%，氢氧化钠的摩尔浓度为0.1~0.2M。
进一步的，所述步骤（2）中氯化钠溶液的质量浓度为0.7~1.0%。
进一步的，所述步骤（2）中氢氧化钠溶液的浓度为0.01~0.15M。
进一步的，所述步骤（3）中乙酸溶液浓度为0.3~0.5M。
进一步的，所述步骤（3）中的酸性蛋白酶的加酶量为200~600U/g。
进一步的，所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶。
进一步的，所述步骤（4）中按照0.5~0.9M的摩尔浓度加入氯化钠。
进一步的，所述步骤（4）中弱碱溶液为摩尔浓度0.01~0.05M的磷酸氢二钠溶液。
进一步的，所述步骤（5）的辐照处理采用60Co辐照，辐照剂量为12-20kGy。
本发明还提供了根据所述制备方法制得的低免疫原性鱼皮胶原蛋白。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
本发明提供的制备方法简单，系统的除去了胶原中的免疫原性物质，所得的胶原蛋白具有免疫原性低、安全性高等优点，降低了胶原蛋白应用于人体后的不良副反应，为进一步拓展胶原蛋白的应用场景提供了理论基础。
本发明提供的制备方法可以系统有效的去除胶原中的免疫原性物质，所得的胶原蛋白杂蛋白、脂肪含量低，端肽和内毒素残留量少，纯度高。弥补了传统方法的不足，改善了由于免疫原性物质的存在所导致的不良反应。如胶原两侧非螺旋的端肽是引起胶原蛋白免疫应答的主要部位，端肽的降低可以有效降低由胶原自身引起的不良反应，而内毒素的降低可以改善由内毒素引起的发热、腹泻、微循环障碍及内毒素血症等不良反应。此外，本发明选取鱼类副产物为提取原料，提高了资源利用率和鱼类产品附加值，减少了由巴沙鱼皮导致的环境污染和资源浪费。
附图说明
图1是胶原蛋白的SDS-PAGE图，图中标记：Lane 1是marker；2是氢氧化钠单独处理；3是过氧化氢和氢氧化钠复合处理；4是胃蛋白酶切端肽；5是20kGy 60Co辐照。
图2是不同过氧化氢浓度下不同换液次数对脂肪脱除率的影响。
图3是不同料液比对胶原蛋白的端肽去除率的影响。
图4是不同乙酸浓度对胶原蛋白的端肽去除率的影响。
图5是不同氢氧化钠浓度对杂蛋白溶出率和胶原损失率的影响。
图6是不同加酶量对胶原蛋白的端肽去除率的影响。
图7是不同过氧化氢浓度处理得到的胶原蛋白辐照前后的内毒素含量。
具体实施方式
下述实施方式更好地说明本发明内容。但本发明不限于下述实施例。
实施例1
本实施例通过实验确定过氧化氢浓度和换液次数对脂肪脱除率的影响，具体步骤如下：
（1）鱼皮前处理：巴沙鱼皮化冻后，去除残肉和结缔组织，剪成1cm小块并用预冷的纯水清洗、沥干；
（2）鱼皮中杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除：向沥干的巴沙鱼皮加入含0%、1%、3%过氧化氢的0.1M氢氧化钠溶液，料液比为1:25（w/v），搅拌一定时间后，进行换液处理，处理方式为先用0.9%氯化钠溶液洗净过氧化氢，后用0.1M氢氧化钠溶液搅拌处理，期间再根据条件换液，共处理9h，处理结束后，用纯水将巴沙鱼皮洗至中性；
（3）鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除：向步骤（2）中洗至中性的巴沙鱼皮中加入0.4M乙酸溶液和600U/g胃蛋白酶，料液比为1:50（w/v），中低速搅拌提取60h，离心（9500rpm，4℃，30min）取上清液，得到去端肽的胶原蛋白粗提液；
（4）胶蛋白的精制及干燥：按照浓度为0.9M将研细的氯化钠粉末加入到步骤（3）获得的胶原蛋白粗提液中进行盐析，静置12h后离心（9500rpm，4℃，30min），得到胶原蛋白沉淀；将所述胶原蛋白沉淀复溶于0.5M乙酸溶液，0.02M磷酸氢二钠溶液透析至透析外液pH大于8，先后用0.1M乙酸溶液和超纯水透析，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到胶原蛋白；
（5）内毒素灭活：将冻干的胶原蛋白包装后，进行60Co辐照处理，辐照剂量为20kGy，进一步得到低免疫原性的胶原蛋白。
上述所有步骤在2~8℃下进行，使用的纯水及所用溶液包括过氧化氢-氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、乙酸溶液、磷酸氢二钠溶液等均需在2~8℃预冷。
本实施例中，在保持其他因素相同的条件下，研究了不同过氧化氢浓度和换液次数对鱼皮脂肪脱除率的影响。结果如图1、2所示，只用氢氧化钠单独处理时，换液次数需4~5次时才有较高脂肪脱除率。当过氧化氢含量为1%，换液次数共2次时，过氧化氢含量为3%，换液次数共1次时，脂肪脱除率分别有最大值，且二者脂肪脱除率均高于氢氧化钠单独处理时的脂肪脱除率。因此，过氧化氢的加入不仅可以提高脂肪脱除率，还可以减少换液次数，降低对资源的浪费和环境的污染。
实施例2
本实施例通过实验确定去端肽过程的料液比对端肽去除率的影响，具体步骤如下：
（1）鱼皮前处理：巴沙鱼皮化冻后，去除残肉和结缔组织，剪成1cm小块并用预冷的纯水清洗、沥干；
（2）鱼皮中杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除：向沥干的巴沙鱼皮加入含1%过氧化氢的0.1M氢氧化钠溶液，料液比为1:25（w/v），搅拌3h；0.9%氯化钠溶液洗净过氧化氢，0.1M氢氧化钠溶液搅拌处理6h，期间换液一次，处理结束后，用纯水将巴沙鱼皮洗至中性；
（3）鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除：向洗至中性的巴沙鱼皮中加入0.4M乙酸溶液和600U/g胃蛋白酶，分别采用1:30、1:40、1:50、1:60、1:70的不同料液比，中低速搅拌提取60h，离心（9500rpm，4℃，30min）取上清液，得到去端肽的胶原蛋白粗提液；
（4）胶蛋白的精制及干燥：按照浓度为0.9M将研细的氯化钠粉末加入到胶原蛋白粗提液中进行盐析，静置12h后离心（9000rpm，4℃，20min），得到胶原蛋白沉淀；将所述胶原蛋白沉淀复溶于0.5M乙酸溶液，0.02M磷酸氢二钠溶液透析至透析外液pH大于8，先后用0.1M乙酸溶液和超纯水透析，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到胶原蛋白；
（5）内毒素灭活：将冻干的胶原蛋白包装后，进行60Co辐照处理，辐照剂量为20kGy，获得低免疫原性鱼皮胶原蛋白。
上述所有步骤在2~8℃下进行，使用的纯水及所用溶液包括过氧化氢-氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、乙酸溶液、磷酸氢二钠溶液等均需在2~8℃预冷。
本实施例中，在保持其他因素相同的条件下，研究了鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除过程中的不同料液比对端肽去除率的影响。根据图3的结果显示，随着料液比的增加，端肽去除率呈现先增加后减小的趋势。当料液比采用1:40~1:60 （w/v）时具有较高的端肽去除率，其中为1:50(w/v)时，端肽去除率有最大值。
实施例3
本实施例通过实验确定去端肽过程中的乙酸浓度对端肽去除率的影响，具体步骤如下：
（1）鱼皮前处理：巴沙鱼皮化冻后，去除残肉和结缔组织，剪成1cm小块并用预冷的纯水清洗、沥干；
（2）鱼皮中杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除：向沥干的巴沙鱼皮加入含3%过氧化氢的0.1M氢氧化钠溶液，料液比为1:25（w/v），搅拌4.5h；用0.9%氯化钠溶液洗净过氧化氢，加入0.1M氢氧化钠溶液搅拌处理4.5h，处理结束后，用纯水将巴沙鱼皮洗至中性；
（3）鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除：向步骤（2）洗至中性的巴沙鱼皮中加入不同浓度的乙酸溶液和600U/g胃蛋白酶，料液比为1:50（w/v），中低速搅拌提取60h，离心（9500rpm，4℃，30min）取上清液，得到去端肽的胶原蛋白粗提液；
（4）胶蛋白的精制及干燥：按照浓度为0.9M将研细的氯化钠粉末加入到步骤（3）获得的胶原蛋白粗提液中进行盐析，静置12h后离心（9500rpm，4℃，30min），得到胶原蛋白沉淀；将所述胶原蛋白沉淀复溶于0.5M乙酸溶液，用0.02M磷酸氢二钠溶液透析至透析外液pH大于8灭酶，先后用0.1M乙酸溶液和超纯水透析，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到冻干的胶原蛋白；
（5）内毒素灭活：将冻干的胶原蛋白包装后，进行60Co辐照处理，辐照剂量为20kGy，获得低免疫原性鱼皮胶原蛋白。
上述所有步骤在2~8℃下进行，使用的纯水及所用溶液包括过氧化氢-氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、乙酸溶液、磷酸氢二钠溶液等均需在2~8℃预冷。
本实施例中，在保持其他因素相同的条件下，研究了不同乙酸浓度对端肽去除率的影响。结果如图4显所示，随着料液比的增加，端肽去除率呈现先增加后减小的趋势。乙酸浓度在0.3~0.5M具有较高的端肽去除率，当乙酸浓度为0.4M时，端肽去除率有最大值。
实施例4
本实施例提供的巴沙鱼皮胶原蛋白的制备方法包括以下步骤：
（1）鱼皮前处理：巴沙鱼皮化冻后，去除残肉和结缔组织，剪成2cm小块并用预冷的纯水清洗、沥干；
（2）鱼皮中杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除：向沥干的鱼皮加入含3%过氧化氢的0.1M氢氧化钠溶液，巴沙鱼皮与过氧化氢-氢氧化钠溶液料液比为1:25（w/v），搅拌4.5h；用0.9%氯化钠溶液洗净过氧化氢，加入0.1M氢氧化钠溶液搅拌处理4.5h，处理结束后，用纯水将巴沙鱼皮洗至中性；
（3）鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除：向步骤（2）中洗至中性的巴沙鱼皮中加入0.4M乙酸溶液和600U/g胃蛋白酶，巴沙鱼皮与乙酸溶液的料液比为1:50（w/v），中低速搅拌提取60h，离心（9500rpm，4℃，30min）取上清液，得到去端肽的胶原蛋白粗提液；
（4）胶原蛋白的精制及干燥：按照浓度为0.9M将研细的氯化钠粉末加入到步骤（3）获得的胶原蛋白粗提液中进行盐析，静置12h后离心（9500rpm，4℃，30min），得到胶原蛋白沉淀；将所述胶原蛋白沉淀复溶于0.5M乙酸溶液，用0.02M磷酸氢二钠溶液透析至透析外液pH大于8灭酶，先后用0.1M乙酸溶液和超纯水透析除盐、除酸，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到冻干的胶原蛋白；
（5）内毒素灭活：将冻干的胶原蛋白包装后，进行60Co辐照处理，辐照剂量为20kGy，获得低免疫原性的巴沙鱼皮胶原蛋白。
上述所有步骤在2~8℃下进行，使用的纯水及所用溶液包括过氧化氢-氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、乙酸溶液、磷酸氢二钠溶液等均需在2~8℃预冷。本发明中所述w/v中的w单位为g，v的单位为mL。
实施例5
本实施例提供的巴沙鱼皮胶原蛋白的制备方法包括以下步骤：
（1）鱼皮前处理：巴沙鱼皮化冻后，去除残肉和结缔组织，剪成1cm小块并用预冷的纯水清洗、沥干；
（2）鱼皮中杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除：向沥干的鱼皮加入含1%过氧化氢的0.1M氢氧化钠溶液，料液比为1:25（w/v），搅拌3h；用0.9%氯化钠溶液洗净过氧化氢，加入0.1M氢氧化钠溶液搅拌处理6h，期间换液一次，处理结束后，用纯水将巴沙鱼皮洗至中性；
（3）鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除：向步骤（2）中洗至中性的巴沙鱼皮中加入0.4M乙酸溶液和600U/g胃蛋白酶，料液比为1:48（w/v），中低速搅拌提取60h，离心（9500rpm，4℃，30min）取上清液，得到去端肽的胶原蛋白粗提液；
（4）胶蛋白的精制及干燥：按照浓度为0.9M将研细的氯化钠粉末加入到胶原蛋白粗提液中进行盐析，静置12h后离心（9000rpm，4℃，20min），得到胶原蛋白沉淀；将所述胶原蛋白沉淀复溶于0.5M乙酸溶液，用0.02M磷酸氢二钠溶液透析至透析外液pH大于8灭酶，先后用0.1M乙酸溶液和超纯水透析，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到冻干的胶原蛋白；
（5）内毒素灭活：将冻干的胶原蛋白包装后，进行60Co辐照处理，辐照剂量为20kGy，获得低免疫原性的巴沙鱼皮胶原蛋白。
上述所有步骤在2~8℃下进行，使用的纯水及所用溶液包括过氧化氢-氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、乙酸溶液、磷酸氢二钠溶液等均需在2~8℃预冷。
根据实施例4与实施例5的制备方法，巴沙鱼皮经过前处理及杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除后杂蛋白去除率和脂肪脱除率均在80%以上，并提供了氢氧化钠处理时浓度对杂蛋白溶出率和胶原损失率的影响（图5），显示0.15~0.2mol/L具有高杂蛋白溶出率但胶原损失率较高，氢氧化钠溶液浓度低于0.15M具有较高的杂蛋白溶出率且胶原损失率较低。较高的除杂脂肪脱除率有助于保证后续工作提取的胶原蛋白具有较高的纯度。
采用过氧化氢浓度及辐照剂量降低内毒素含量（图7），3%过氧化氢质量浓度下（0kGy）具有最好的内毒素脱除效果，用胃蛋白酶进行端肽去除，加酶量在200~600U/g（图6）能够实现去端肽效果。采用12~20 kGy辐照度能够较好的降低胶原蛋白内毒素含量，且不限于3%过氧化氢浓度。与传统方法相比，实施例4与实施例5制备的胶原蛋白终产品的端肽含量和内毒素含量均显著减少。因此，根据实施例4与实施例5的制备方法可以提取出纯度较高、免疫原性较低的巴沙鱼皮胶原蛋白。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）鱼皮前处理：将巴沙鱼皮去除残肉和结缔组织，剪成小块，用纯水清洗、沥干；
（2）鱼皮中杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除：向沥干的巴沙鱼皮加入过氧化氢-氢氧化钠溶液处理2 ~ 6h，巴沙鱼皮与过氧化氢-氢氧化钠溶液的料液比w/v为1:20-1:30；用氯化钠溶液洗净过氧化氢后，加入氢氧化钠溶液搅拌处理3 ~ 5h后，用纯水将巴沙鱼皮洗至中性；所述过氧化氢-氢氧化钠溶液中过氧化氢的质量浓度为1% ~ 3%，氢氧化钠的摩尔浓度为0.1 ~ 0.2M；
（3）鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除：向步骤（2）中获得的巴沙鱼皮中加入乙酸溶液和酸性蛋白酶搅拌48 ~ 72h，巴沙鱼皮与乙酸溶液的料液比w/v为1:40 ~ 1:60；离心取上清液，得到去端肽的胶原蛋白粗提液；所述酸性蛋白酶的加酶量为200 ~ 600U/g；
（4）胶原蛋白的精制及干燥：将氯化钠粉末加入到胶原蛋白粗提液中进行盐析，离心得到胶原蛋白沉淀；将所述胶原蛋白沉淀复溶于乙酸溶液，用弱碱溶液透析至透析外液pH≥8灭酶后，先后用乙酸溶液和超纯水透析，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到冻干的胶原蛋白；
（5）内毒素灭活：将步骤（4）中冻干的胶原蛋白进行辐照处理，灭活细菌及内毒素；获得所述低免疫原性鱼皮胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的所有步骤在2 ~ 8℃下进行，纯水、过氧化氢-氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、乙酸溶液、弱碱溶液均在2 ~ 8℃预冷。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中氯化钠溶液的质量浓度为0.7 ~ 1.0%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中乙酸溶液浓度为0.3 ~0.5M。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中弱碱溶液为摩尔浓度0.01 ~ 0.05M的磷酸氢二钠溶液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）的辐照处理采用 60 Co辐照，辐照剂量为12-20k Gy。
8.根据权利要求1所述的制备方法制得的低免疫原性鱼皮胶原蛋白。
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