CN113185603B

CN113185603B - 一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白及其制备方法及应用

Info

Publication number: CN113185603B
Application number: CN202110504433.0A
Authority: CN
Inventors: 刘楚怡; 李八方; 王园园; 代元坤; 宋文山; 杜芬
Original assignee: Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2041-05-10
Also published as: CN113185603A

Abstract

本发明提出了一种低免疫原性的海洋胶原蛋白及其制备方法和应用。所述低免疫原性的海洋胶原蛋白的制备方法包括：对鱼皮进行预处理、脱脂及除杂蛋白、去除糖蛋白及内毒素、粗提取、盐析、去端肽、脱盐、包装及灭菌，得到一种低免疫原性的海洋胶原蛋白。本发明通过合理的免疫原性物质去除手段，除去端肽、糖蛋白及内毒素等富含胶原蛋白的天然组织中存在的免疫原性物质，同时还可去除细胞抗原，使机体的免疫反应大大降低，从而减少了材料的免疫原性。所述低免疫原性的海洋胶原蛋白具有纯度高、保持三螺旋结构、活性强、性能好等特点，提供海洋胶原蛋白基医用材料和医疗器械开发的物质基础和技术保证。

Description

一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于医用材料制备技术领域，具体涉及一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白及其制备方法及应用。

背景技术

近年来，对胶原蛋白的研究已拓展到了生物医用领域。由于胶原蛋白在细胞外基质中的优势，以及其具有的生物可降解性、低免疫原性和良好的生物相容性等特点，使其在医学和组织工程中的应用越来越广泛。目前胶原蛋白已被成功应用于止血海绵、可吸收手术缝合线、植入性胶原蛋白膜、组织工程软骨、药物缓释载体等的制备中。市场对医用胶原蛋白的需求保持高速增长，医用胶原蛋白行业在国民经济中的地位将不断提高。预测未来几年医用胶原蛋白产品国产品牌会慢慢崛起，产品慢慢向高端市场渗透，市场占有率会越来越高。

海洋生物在地球上种类繁多、数量巨大，是胶原蛋白来源的宝库。国内外学者以已经从各种水生生物的皮、鳞和骨中分离和表征了多种海洋胶原蛋白，并证明海洋胶原蛋白既存在与陆生胶原蛋白类似的特征，又具有陆生胶原蛋白所没有的人群优势、安全优势以及资源优势。相比于陆生哺乳动物，水生生物胶原蛋白在功能特性上具有较多的优点，如低乳化性、高分散性和低免疫原性等，在组织骨架、止血敷料、创伤修复膜等领域具有巨大的应用潜力。

但是，在市场调研及课题组前期的研究中发现，目前所用用到的医用胶原蛋白产品均为哺乳动物中获得的，并没有以海洋来源胶原蛋白制备的医疗器械及海洋动物来源的胶原蛋白材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白及其制备方法及应用。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)鱼皮原料预处理：取海洋来源鱼类，去头、去内脏、除去鱼鳞，进行鱼皮肉分离，将得到的鱼皮洗净，沥干；

(2)原料脱脂及除杂蛋白：取步骤(1)预处理后的鱼皮，加入碱溶液搅拌，过滤后调整酸碱度至中性，获得除杂后的鱼皮；

(3)鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：在步骤(2)获得的鱼皮中加入过氧化氢溶液、氢氧化钠，搅拌至鱼皮变为淡黄色，过滤后调整酸碱度至中性，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的鱼皮；

(4)鱼皮胶原蛋白的粗提取：在步骤(3)获得的鱼皮中加入酸性溶液后搅拌，离心取上清液，获得胶原蛋白粗提液；

(5)胶原蛋白的盐析：加入盐进行盐析，收集沉淀，获得胶原蛋白沉淀；

(6)鱼皮胶原蛋白端肽的去除：将所述步骤(5)获得的胶原蛋白沉淀溶于酸性溶液中，加入蛋白酶后水解去端肽，使用弱碱溶液作为透析液进行，获得去端肽胶原蛋白；

(7)去端肽胶原蛋白的脱盐：步骤(6)中去端肽胶原蛋白酸碱度为中性后，再透析脱盐，得到高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液；

(8)去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥步骤(7)获得的高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液，进行包装及灭菌，得到所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。

进一步的，所述步骤(2)中的碱溶液、所述步骤(3)中的过氧化氢溶液进行2～8℃预冷；所述步骤(4)的搅拌温度、所述步骤(5)的盐析温度为2～8℃。

进一步的，所述步骤(1)中的海洋来源鱼类包括鳕鱼、罗非鱼。

进一步的，所述步骤(2)中鱼皮与碱性溶液的料液比为1∶10～1∶20(w/v)，所述碱溶液的浓度为0.1～0.2M。

进一步的，所述的步骤(2)使用的碱性溶液的溶质为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾或氢氧化钠中的至少一种。

进一步的，所述步骤(3)中鱼皮与过氧化氢溶液的料液比为1∶10～1∶20(w/v)；所述过氧化氢溶液的浓度为1％～2％；所述氢氧化钠在整个体系中的浓度为0.03～0.08M。

进一步的，所述步骤(4)中鱼皮与酸性溶液的料液比为1∶50～1∶65(w/v)，所述酸性溶液的浓度为0.3～0.5M。所述酸性溶液为醋酸溶液、柠檬酸溶液或盐酸溶液。

进一步的，所述步骤(5)中盐的最终浓度为0.8～1.0M；所述盐为NaCl。

进一步的，所述步骤(6)中的蛋白酶为胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶。

进一步的，所述步骤(6)中蛋白酶的用量为300～600U/g；水解温度为4～8℃；透析过程使用分子量小于14000Da的透析袋；透析液为0.2M弱碱溶液。

进一步的，所述步骤(7)中透析液为生理盐水或去离子水，透析至电导率为50us/cm以下。

进一步的，所述步骤(8)中采用辐照灭菌。

本发明还提供了所述制备方法制得的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。

本发明提供所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白在制备医用胶原蛋白中的应用。

进一步的，所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的羟脯氨酸含量为9.0～9.2％；核酸含量低于300ng/mg。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：

本发明是以富含胶原蛋白的海洋鱼类鱼皮、鱼鳞、鱼鳔等为原料，开发医用海洋胶原蛋白的制备纯化技术、免疫原消除技术、功能改性技术等关键技术，并针对特定医用需求的海洋胶原蛋白材料，按照《中华人民共和国医药行业标准》中的《动物源医疗器械风险管理标准》和《注册技术审查指导原则》进行全面的安全性评价及生物相容性研究，完成了高纯度、低免疫原性的医用海洋胶原蛋白的研制开发。本发明制备方法工艺简单、反应温度低，制备得到的医用胶原蛋白，对医用级海洋胶原蛋白关键制备技术的突破和开发，是海洋胶原蛋白基医用材料和医疗器械开发的物质基础和技术保证。本发明克服了现有的海洋来源的医用胶原蛋白产品开发中存在的纯度低、免疫原性高等问题，提供一种低免疫原性海洋来源胶原蛋白的制备方法，海洋胶原蛋白的热变性温度较低，提取过程中采用低温防止胶原蛋白变形，保证了胶原蛋白的三螺旋结构和分子量，具有活性强的特点。通过合理的免疫原性物质去除手段，除去端肽、糖蛋白及内毒素等富含胶原蛋白的天然组织中存在的免疫原性物质，同时还可去除细胞抗原，使机体的免疫反应大大降低，从而减少了材料的免疫原性，为海洋来源的医用胶原蛋白材料的临床安全性研究提供了依据，也为后续开发基于海洋胶原蛋白的医用材料及医疗器械提供理论依据及技术保证。

附图说明

图1是三种海洋胶原蛋白丹巴SDS-PAGE图；图中标号：1、罗非鱼鱼皮胶原蛋白；2、鳕鱼鱼皮胶原蛋白；3、鲴鱼鱼皮胶原蛋白。

图2是两种胶原蛋白的端肽去除率检测结果。

图3是两种去端肽胶原蛋白对细胞免疫的影响。

图4是低免疫原性海洋胶原蛋白的皮内刺激试验结果。

图5是胶原蛋白的急性全身毒性实验结果。

具体实施方式

下述实施方式更好地说明本发明内容。但本发明不限于下述实施例。

本发明所述的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法如下：

(1)鱼皮原料的预处理：取真鳕鱼及罗非鱼等海洋来源鱼类，去头、去内脏、除去鱼鳞，利用去皮机完成鱼皮肉分离，将得到的鱼皮洗净，绞碎成5×5mm左右的小块，沥干水分，称重。

(2)原料脱脂及除杂蛋白：取30g预处理的鱼皮，按照料液比为1∶10～1∶20(w/v)加入2～8℃预冷的0.1～0.2M的碱溶液，连续搅拌，每5～8h换液一次，共搅拌24～48h后，滤去溶液，鱼皮通过生理盐水反复洗2～5次至中性，以除去脂肪和肌原纤维蛋白等其他蛋白杂质，获得除杂后的鱼皮。

(3)鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：按照料液比为1∶10～1∶20(w/v)加入2～8℃预冷的1％～2％的过氧化氢溶液，再加入NaOH至浓度为0.03～0.08M，2～8℃连续搅拌0.5～2h，至鱼皮变为淡黄色，以除去鱼皮表面糖蛋白及部分内毒素，滤去溶液，鱼皮通过生理盐水反复洗3次至中性，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的鱼皮。

(4)鱼皮胶原蛋白的粗提取：向洗至中性的鱼皮中按照料液比为1∶50～1∶65(w/v)加入0.3～0.5M酸性溶液(醋酸、盐酸、柠檬酸)进行酸提，2～8℃中速搅拌12～24h后，用高速冷冻离心机在8000～9000r/min离心5～15min，收集上清液，得到胶原蛋白粗提液。

(5)胶原蛋白的盐析：2～8℃下，在胶原蛋白粗提液中缓慢加入研细的NaCl，至NaCl的最终浓度为0.8～1.0M，盐析后静置过夜，再次在8000～9000r/min离心5～15min，收集沉淀，获得胶原蛋白沉淀。

(6)鱼皮胶原蛋白端肽的去除：取盐析得到的胶原蛋白沉淀，称重，按照1∶10～1∶20的比例复溶于0.3～0.5M酸性溶液中，并以胶原蛋白沉淀重量为基础，按照300～600U/g加入蛋白酶，在4～8℃搅拌去端肽，水解6～24h后，移入截留分子量小于14000Da的透析袋，透析液为0.2M弱碱溶液，通过改变pH停止酶解，得到去端肽胶原蛋白。

(7)去端肽胶原蛋白的脱盐：透析袋中的去端肽胶原蛋白pH升至中性后，再用生理盐水和去离子水透析脱盐，透析液每6～8h更换一次，至电导率为50us/cm以下，得到高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液。

(8)去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥高纯度去端肽医用海洋胶原蛋白溶液30～50h后，再经包装及辐照灭菌，得到高纯度的所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。

实施例1：鳕鱼胶原蛋白的制备

1、用太平洋真鳕鱼皮制备胶原蛋白的方法步骤如下：

(1)鱼皮原料的预处理：取太平洋真鳕鱼，去头、去内脏、除去鱼鳞，利用去皮机完成鱼皮肉分离，将得到的鱼皮洗净，绞碎成5×5mm左右的小块，沥干水分，称重。

(2)原料脱脂及除杂蛋白：称30g预处理的鱼皮，按照料液比为1∶15(w/v)加入4℃预冷的0.15M的碱溶液，连续搅拌，每8h换液一次，共搅拌24h后，滤去溶液，鱼皮通过生理盐水反复洗3次至中性，以除去脂肪和肌原纤维蛋白等其他蛋白杂质，获得除杂后的太平洋真鳕鱼鱼皮。

(3)鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：按照料液比为1∶15(w/v)加入4℃预冷的2％的过氧化氢溶液，并向其中添加NaOH至浓度为0.05M，4℃连续搅拌1h，至鱼皮变为淡黄色，以除去鱼皮表面糖蛋白及部分内毒素，滤去溶液，鱼皮生理盐水反复洗3次至中性后，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的太平洋真鳕鱼鱼皮。

(4)鱼皮胶原蛋白的粗提取：按照料液比为1∶65(w/v)加入0.5M乙酸性溶液进行酸提，4℃中速搅拌18h后，用高速冷冻离心机在9000r/min离心10min，收集上清，得到胶原蛋白粗提液。

(5)胶原蛋白的盐析：在胶原蛋白粗提液中缓慢加入研细的NaCl，至NaCl的最终浓度为0.9M，盐析后静置过夜，再次离心，收集沉淀，获得胶原蛋白沉淀。

(6)取盐析得到的胶原蛋白沉淀，称重；按照1∶10的比例复溶于0.5M醋酸中，并以胶原蛋白沉淀重量为基础，按照400U/g加入蛋白酶，在4～8℃搅拌去端肽，水解11h后，移入截留分子量小于14000Da的透析袋，透析液为0.2M弱碱溶液，通过改变pH停止酶解。

(7)去端肽胶原蛋白的脱盐：透析袋中的去端肽胶原蛋白pH升至中性后，再用生理盐水和去离子水透析脱盐，透析液每8h更换一次，至电导率为50us/cm以下，得到高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液。

(8)去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥高纯度去.端肽医用海洋胶原蛋白溶液48h后，再经包装及辐照灭菌，得到高纯度去端肽医用海洋胶原蛋白成品1(鳕鱼胶原蛋白)。

实施例2：鲴鱼胶原蛋白的制备

1、用大西洋长吻鲴鱼制备胶原蛋白的方法步骤如下：

(1)鱼皮原料的预处理：取大西洋长吻鲴鱼皮，洗净，绞碎成5×5mm左右的小块，沥干水分。

(2)原料脱脂及除杂蛋白：称30g预处理的鱼皮，按照料液比为1∶20(w/v)加入4℃预冷的0.1M的碱溶液，连续搅拌，每8h换液一次，共搅拌24h后，滤去溶液，鱼皮通过生理盐水反复洗3次至中性，以除去脂肪和肌原纤维蛋白等其他蛋白杂质，获得除杂后的大西洋长吻鲴鱼鱼皮。

(3)鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：再按照料液比为1∶20(w/v)加入4℃预冷的2％的过氧化氢溶液，并向其中添加NaOH至浓度为0.08M，4℃连续搅拌1h，至鱼皮变为淡黄色，以除去鱼皮表面糖蛋白及部分内毒素，滤去溶液，鱼皮生理盐水反复洗3次至中性后，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的大西洋长吻鲴鱼鱼皮。

(4)鱼皮胶原蛋白的粗提取：按照料液比为1∶60(w/v)加入0.5M盐酸性溶液进行酸提，4℃中速搅拌18h后，用高速冷冻离心机在9000r/min离心10min，收集上清，得到胶原蛋白粗提液。

(6)取盐析得到的胶原蛋白沉淀，称重；按照1∶10的比例复溶于0.5M醋酸中，并以胶原蛋白沉淀重量为基础，按照500U/g加入蛋白酶，在4～8℃搅拌去端肽，水解9h后，移入截留分子量小于14000Da的透析袋，透析液为0.2M磷酸氢二钠溶液，通过改变pH停止酶解。

(7)去端肽胶原蛋白的脱盐：透析袋中的去端肽胶原蛋白pH升至中性后，再用生理盐水和去ha离子水透析脱盐，透析液每8h更换一次，至电导率为50us/cm以下，得到高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液。

(8)去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥高纯度去端肽医用海洋胶原蛋白溶液48h后，再经包装及辐照灭菌，得到高纯度去端肽医用海洋胶原蛋白成品2(鲴鱼胶原蛋白)。

实施例3：罗非鱼胶原蛋白的制备

1、用吉富罗非鱼制备胶原蛋白的方法步骤如下：

(1)鱼皮原料的预处理：取吉富罗非鱼皮，洗净，绞碎成5×5mm左右的小块，沥干水分，获得除杂后的吉富罗非鱼鱼皮。

(2)原料脱脂及除杂蛋白：称30g预处理的鱼皮，按照料液比为1∶10(w/v)加入4℃预冷的0.1M的碱溶液，连续搅拌，每6h换液一次，共搅拌24h后，滤去溶液，鱼皮通过生理盐水反复洗3次至中性，以除去脂肪和肌原纤维蛋白等其他蛋白杂质，获得除杂后的吉富罗非鱼鱼皮。

(3)鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：再按照料液比为1∶20(w/v)加入4℃预冷的1.5％的过氧化氢溶液，并向其中添加NaOH至浓度为0.05M，4℃连续搅拌1.5h，至鱼皮变为淡黄色，以除去鱼皮表面糖蛋白及部分内毒素，滤去溶液，鱼皮生理盐水反复洗3次至中性后，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的吉富罗非鱼鱼皮。

(4)鱼皮胶原蛋白的粗提取：按照料液比为1∶50(w/v)加入0.5M冰醋酸性溶液进行酸提，4℃中速搅拌24h后，用高速冷冻离心机在9000r/min离心10min，收集上清，得到胶原蛋白粗提液。

(5)胶原蛋白的盐析：在胶原蛋白粗提液中缓慢加入研细的NaCl，至NaCl的最终浓度为1.0M，盐析后静置过夜，再次离心，收集沉淀，获得胶原蛋白沉淀。

(6)鱼皮胶原蛋白端肽的去除：取盐析得到的胶原蛋白沉淀，称重；按照1∶10的比例复溶于0.5M醋酸中，并以胶原蛋白沉淀重量为基础，按照500U/g加入蛋白酶，在4～8℃搅拌去端肽，水解9h后，移入截留分子量小于14000Da的透析袋，透析液为0.2M磷酸氢二钠溶液，通过改变pH停止酶解。

(8)去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥高纯度去端肽医用海洋胶原蛋白溶液48h后，再经包装及辐照灭菌，得到高纯度去端肽医用海洋胶原蛋白成品3(罗非鱼胶原蛋白)。

实施例4：海洋胶原蛋白的医用性能

本实施例为实施例1、2、3得到的低免疫原性医用海洋胶原蛋白的性能表征及免疫原性分析相关实验研究资料。

1、SDS-PAGE分析电泳实验

三种鱼皮胶原蛋白的SDS-PAGE分析电泳结果如图1所示，电泳结果显示，提取的罗非鱼胶原蛋白、鳕鱼胶原蛋白和鲴鱼胶原蛋白中，三种胶原蛋白均存在胶原蛋白特定亚基条带，其中含有少量的γ链(三聚体)、较多的β链(二聚体)和至少两条不同的α链(α1和α2链)。说明本发明采用低温制备海洋胶原鱼皮蛋白的方法避免了三螺旋结构发生断裂，保证了胶原蛋白的三螺旋结构和分子量。

2、去端肽前后胶原蛋白的理化性能

以实施例工艺制备纯化胶原蛋白，并在此基础上，利用生物酶技术制备低免疫原性胶原蛋白，探索去端肽的鳕鱼和罗非鱼皮胶原蛋白的制备条件，并对其免疫原性相关指标进行表征，结果如图2所示，最优条件去端肽后，与未去端肽罗非鱼胶原蛋白(T-ASC)和未去端肽鳕鱼胶原蛋白(C-ASC)相比，去端肽罗非鱼胶原蛋白(T-AteloC)和去端肽鳕鱼胶原蛋白(C-AteloC)端肽清除率分别65.7％和73.2％。确定了低免疫原性去端肽胶原蛋白的制备条件，并制备得到了两种来源的低免疫原性高纯度医用胶原蛋白。

对去端肽前后的罗非鱼胶原蛋白和鳕鱼皮胶原蛋白的理化性能进行表征，包括纯度、DNA含量、端肽去除程度、内毒素等，结果如表1所示。

表1去端肽前后胶原蛋白的性能分析

编号	蛋白含量	羟脯氨酸μg/mg	DNA含量ng/mg	DNA含量％
					T-ASC	98.21％	82.84±3.34	47.61±8.01	0.00476％
T-AteloC	99.58％	90.22±5.96	44.00±1.90	0.00440％
					C-ASC	97.82％	78.11±2.25	29.31±0.761	0.00293％
C-AteloC	99.69％	92.62±4.35	29.41±28.42	0.00294％

对蛋白纯度分析结果显示，去端肽C-AteloC和T-AteloC的纯度均高于95％，去端肽起到了除杂效果使蛋白含量有所升高。对其羟脯氨酸(HYP)含量进行分析，发现去端肽的两种胶原蛋白的羟脯氨酸含量在9.0～9.2％，且由于去除了非重复端肽序列使其HYP含量升高。核酸检测结果显示，各组核酸含量均低于300ng/mg(1ug/ml)，符合要求。综上所述，验证其纯度、DNA含量、端肽去除程度各指标均满足医用胶原蛋白标准要求。

3、低免疫原性医用胶原蛋白的医用性测试

按照医疗器械免疫原性评价方法YY/T 1465.1-2016，利用体外T淋巴细胞转化试验分析C/T-ASC、C/T-AteloC及市售产品对照产品组(沪士达)的免疫原性结果如图3显示，四种胶原蛋白均未对淋巴细胞产生特异性或非特异性的免疫应答，且细胞增殖均低于阴性对照值，说明制备的去端肽胶原蛋白不会对机体的淋巴细胞产生特异性或非特异性免疫应答。因此，制得的去端肽胶原蛋白不会对生物体液免疫及细胞免疫产生干扰。

考察了制备得到的去端肽前后四种低免疫原性胶原蛋白的酸碱度、干燥失重、可消化性及液体吸收性等性能，对其进行表征。

表2低免疫原性医用胶原蛋白的表征

结果如表2所示，各指标均在标准要求范围内，且跟市售对照产品相比，部分指标远高于市售对照产品。

评价低免疫原性胶原蛋白的细胞毒性，按照GBT 16886.12-2017标准对其进行浸提，并GBT 16886.5-2017第5部分体外细胞毒性试验方法，将不同稀释倍数的浸提液用于细胞毒性研究中。

表3低免疫原性胶原蛋白的细胞毒性研究

	T-AteloC	C-AteloC	市售对照
				100mg/ml	157.5％	113.3％	55.1％
10mg/ml	116.9％	128.9％	108.1％
				1mg/ml	112.0％	111.3％	94.0％
0.1mg/ml	132.5％	137.3％	142.2％
				0.01mg/ml	113.9％	129.5％	101.6％
0.001mg/ml	116.4％	115.8％	165.3％

结果如表3所示，研究发现除市售对照产品外，得到的几种医用胶原蛋白在不同浓度下的细胞存活率均高于标准要求的80％，且均＞100％，说明得到的低免疫原性胶原蛋白不具有细胞毒性，且该胶原蛋白可促进细胞增殖，具有开发促愈合产品的潜力。

低免疫原性胶原蛋白的皮内刺激试验按照GBT 16886.10-2017医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验方法，对胶原蛋白的极性及非极性浸提液进行兔皮内刺激试验，实验结果如图4所示。结果显示，72小时内，极性及非极性浸提液对兔皮内平均刺激记分为0，不大于空白，说明低免疫原性胶原蛋白对皮肤的刺激符合试验要求。

低免疫原性胶原蛋白的急性全身毒性实验，按照GBT 16886.11-2011第11部分：全身毒性试验中对急性毒性实验的方法，对极性及非极性的浸提液浸提的各胶原蛋白样品进行极性全身毒性检测，结果如图5所示。对极性及非极性的浸提液浸提的各胶原蛋白样品进行极性全身毒性检测，结果判定两种去端肽胶原蛋白在极性及非极性环境下均不会产生全身毒性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

（1）鱼皮原料预处理：取海洋来源鱼类，去头、去内脏、除去鱼鳞，进行鱼皮肉分离，将得到的鱼皮洗净，沥干；

（2）原料脱脂及除杂蛋白：取步骤（1）预处理后的鱼皮，加入碱溶液搅拌，过滤后调整酸碱度至中性，获得除杂后的鱼皮；

（3）鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：在步骤（2）获得的鱼皮中加入过氧化氢溶液、氢氧化钠，搅拌至鱼皮变为淡黄色，过滤后调整酸碱度至中性，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的鱼皮；所述鱼皮与过氧化氢溶液的料液比为1:10~1:20（w/v）；所述过氧化氢溶液的浓度为1%~2%；所述氢氧化钠在整个体系中的浓度为0.03~0.08M；

（4）鱼皮胶原蛋白的粗提取：在步骤（3）获得的鱼皮中加入酸性溶液后搅拌，离心取上清液，获得胶原蛋白粗提液；所述鱼皮与酸性溶液的料液比为1:50~1:65（w/v），所述酸性溶液的浓度为0.3~0.5M；

（5）胶原蛋白的盐析：加入盐进行盐析，收集沉淀，获得胶原蛋白沉淀；

（6）鱼皮胶原蛋白端肽的去除：将所述步骤（5）获得的胶原蛋白沉淀溶于酸性溶液中，加入蛋白酶后水解去端肽，使用弱碱溶液作为透析液进行，获得去端肽胶原蛋白；所述蛋白酶的用量为300~600U/g；水解温度为4~8℃；透析过程使用分子量小于14000Da的透析袋；透析液为0.2M弱碱溶液；

（7）去端肽胶原蛋白的脱盐：步骤（6）中去端肽胶原蛋白酸碱度为中性后，再透析脱盐，得到高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液；

（8）去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥步骤（7）获得的高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液，进行包装及灭菌，得到所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的碱溶液、所述步骤（3）中的过氧化氢溶液进行2~8℃预冷；所述步骤（4）的搅拌温度、所述步骤（5）的盐析温度为2~8℃。

3.根据权利要求1所述的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的海洋来源鱼类包括鳕鱼、罗非鱼。

4.根据权利要求1所述的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中鱼皮与碱性溶液的料液比为1:10~1:20（w/v），所述碱溶液的浓度为0.1~0.2M。

5.权利要求1所述的制备方法制得的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。

6.权利要求5所述的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白在制备医用胶原蛋白中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的羟脯氨酸含量为9.0~9.2%；核酸含量低于300ng/mg。