CN112501229A - 一种牛骨胶原肽的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白肽制备技术领域，具体涉及一种牛骨胶原肽的生产工艺。本发明提供的牛骨胶原肽的生产工艺，包括S1、原料预处理；S2、油水分离；S3、酶解；S4、微波灭酶；S5、纯化；S6、干燥制粉等步骤。采用本发明提供的牛骨胶原肽的生产工艺制得的牛骨胶原肽粉具有分子量小且分布集中，吸收快、脂肪含量低等优点，并且水溶性好，溶于水不易产生沉淀，人体生物利用度高，长期服用能有效提高人体免疫力，减缓身体疲劳，能广泛应用于保健食品、配方食品和化妆品等领域。
Description
技术领域
本发明属于蛋白肽制备技术领域，具体涉及一种牛骨胶原肽的生产工艺。
背景技术
胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，它是由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30％以上。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分。一个成年人的身体内约有3公斤胶原蛋白，主要存在于人体的皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、心脏、胃、肠、血管等部位，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质。在人体皮肤成分中，有70％是由胶原蛋白所组成。当胶原蛋白不足时，不仅皮肤及骨骼会出现问题，对内脏器官也会产生不利影响。由此可见，胶原蛋白是维持人体正常生理活动所不可缺少的重要成分。
牛骨胶原蛋白肽主要是从牛骨中提取出来的一种胶原蛋白，这种胶原蛋白肽有利于被人体所吸收，可以有效的增加皮肤的弹性、增加骨骼的强度。不但可以美白皮肤，而且可以降低因钙质缺失导致的骨质疏松现象。其中含有的矿物质也比较丰富，能够调节身体内电解质的平衡。能够促进身体细胞的修复，能够防癌、抗癌。
目前，生产牛骨胶原蛋白肽常用的工艺方法有：酸水解法、碱水解法和蛋白酶水解法。酸、碱水解工艺生产蛋白肽过程中虽然得率较高，但水解时严重破坏了产品中的氨基酸，使蛋白肽产品的营养价值降低，另外该方法生产过程中还会带入大量盐分，必要时还要做脱盐处理。相比之下，酶法生产蛋白肽的工艺条件较为缓和，生产过程中不会造成氨基酸的破坏，所以酶法制得的蛋白肽产品营养价值更高。
中国专利申请CN104413406A公开了一种从牦牛骨中提取复合骨胶原的加工工艺，通过将牦牛骨选料、破碎、蒸煮、分离、磨浆、酸浸、退酸、过滤、酒精沉淀、脱水和干燥等11道工序，将牦牛骨中的复合骨胶原提取出来，制成高度浓缩的复合骨胶原粉粒颗粒。虽然该方法采用碱性蛋白酶将大分子胶原蛋白酶解成胶原短肽，但是其得到的牛骨胶原蛋白肽的分子量很难集中在100～1000Da之间，导致胶原蛋白产品分子区段不严格，不集中，大分子蛋白与小分子蛋白共同存在，而人体对大分子蛋白的吸收利用率较低，服用效果差等问题，需要加大服用量来达到预期效果，这样就造成了胶原蛋白的浪费，而且会因服用大量胶原蛋白而造成便秘、肠胃不适等不良的反应。
中国专利申请CN106148466A公开了一种牦牛胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：(1)将牦牛组织粉碎；(2)将经步骤(1)的牦牛组织进行酶解，得到组织液；(3)从所述组织液中分离中胶原蛋白液；(4)将所述胶原蛋白液层析，得到胶原蛋白固体。该制备方法中采用了层析的纯化方法对胶原蛋白液进行分离，得到的固体胶原蛋白的水溶性较差，溶于水后溶液易产生沉淀。
因此，需要研制一种分子量较小且分布集中的牛骨胶原肽，能够更利于人体对吸收，有效提高并且稳定性高，水溶性好。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种牛骨胶原肽的生产工艺。采用本发明提供的牛骨胶原肽的生产工艺工序合理、可操作性强，易于工业化生产，制得的牛骨胶原肽粉分子量较小且分布集中，人体生物利用度高，水溶性好，长期服用能有效提高人体免疫力，减缓身体疲劳。
本发明的技术方案是：
一种牛骨胶原肽的生产工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量10～20倍的氢氧化钠溶液浸泡3～6h，然后用碎骨机粉碎至1～2cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量8～12倍的水，在120～135℃下蒸煮1.5～3h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行一次酶解，然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6～6.5后，加入木瓜蛋白酶进行二次酶解，并辅助超声处理；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至0～4℃；
S5、纯化：在0～4℃下，向步骤S4所得的处理液中，加入有机溶剂，在冰浴上持续温和地搅拌10～20min后，低温离心除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
进一步地，所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比6～11:4～10:1～5组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:(0.9～1.3)。
更进一步地，所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比8:7:2组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:1.2。
进一步地，所述步骤S1中添加的氢氧化钠溶液的浓度为0.05～0.15mol/L。
进一步地，所述步骤S3中一次酶解的温度为55℃～60℃，一次酶解时间为1h～2h，所述的复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物；所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的0.8～1.6％。
进一步地，所述步骤S3中二次酶解时间为2h-4h，温度为55℃～60℃，所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.1％～0.3％；
进一步地，所述步骤S3中的超声功率为30～60kHz。
进一步地，所述步骤S4中的微波功率为450～700W，微波灭酶温度为80～100℃，微波灭酶时间为2～3min。
本发明提供的牛骨胶原肽的生产工艺，工序合理、可操作性强，易于工业化生产，先将牛骨原料进行清洗和蒸煮处理能够去除牛骨中的杂蛋白，使其中的胶原蛋白充分溶于水，然后进行酶解、微波灭酶、纯化和干燥制粉等步骤，得到的牛骨胶原蛋白粉质量稳定，水溶性好，溶解时不易出现沉淀现象，长期服用能有效果提高人体的免疫力，减缓疲劳的产生。
本发明的生产工艺，在纯化步骤中，采用了低温有机溶剂沉淀法纯化酶解后的胶原蛋白肽。由于不同类型的胶原在生物体组织中的分布存在较大差异，而且胶原常与多糖等成分结合在一起，而且酶解过后的牛骨胶原蛋白肽中含有分子量大小不一的杂蛋白，如果不进行去除，会影响最终制得的牛骨胶原肽粉的品质，本发明在纯化时通过添加由异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按一定比例组成的有机溶剂，在低温条件下(0～4℃)，有效降低了溶液介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；同时，添加的有机溶剂本身的水合作用也降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致牛骨胶原蛋白肽脱水凝集沉淀，分辨能力比普通的盐析法要高，且不用脱盐，过滤比较容易。制得的牛骨胶原肽粉的分子量主要集中在500～1000Da，分子量为1000Da以下的胶原蛋白肽比例达到了90％以上，有效提高了牛骨胶原肽有效成分的提取率，有利于人体的吸收。
与现有技术相比，本发明提供的牛骨胶原肽的生产工艺具有以下优势：
(1)采用本发明提供的牛骨胶原肽的生产工艺制得的牛骨胶原肽粉具有分子量小且分布集中，吸收快、脂肪含量低等优点，能广泛应用于保健食品、配方食品和化妆品等领域。
(2)采用本发明提供的牛骨胶原肽的生产工艺制得的牛骨胶原肽粉，水溶性好，溶于水不易产生沉淀，人体生物利用度高，长期服用能有效提高人体免疫力，减缓身体疲劳。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
其中，本发明所用试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。
实施例1一种牛骨胶原肽的生产工艺
所述的牛骨胶原肽的生产工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量10倍的浓度为0.05mol/L的氢氧化钠溶液浸泡3h，然后用碎骨机粉碎至1cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量8倍的水，在120℃下蒸煮1.5h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶在温度为55℃下进行一次酶解，酶解时间为1h，所述的复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胃蛋白酶按重量比1:1组成，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的0.8％；然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6后，加入木瓜蛋白酶在温度为55℃下进行二次酶解，酶解时间为2h，并辅助超声处理，超声功率为30kHz；所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.1％；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至0℃；所述的微波功率为450W，微波灭酶温度为80℃，微波灭酶时间为2min；
S5、纯化：在0℃下，向步骤S4所得的处理液中，加入有机溶剂，在冰浴上持续温和地搅拌10min后，低温离心除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比6:10:5组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:1.3。
实施例2一种牛骨胶原肽的生产工艺
所述的牛骨胶原肽的生产工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量15倍的浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液浸泡4h，然后用碎骨机粉碎至1.5cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量10倍的水，在130℃下蒸煮2.5h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶在温度为58℃下进行一次酶解，酶解时间为1.5h，所述的复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按重量比1:1:1组成，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.2％；然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6.2后，加入木瓜蛋白酶在温度为58℃下进行二次酶解，酶解时间为3h，并辅助超声处理，超声功率为45kHz；所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.2％；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至2℃；所述的微波功率为600W，微波灭酶温度为90℃，微波灭酶时间为2.5min；
S5、纯化：在2℃下，向步骤S4所得的处理液中，加入有机溶剂，在冰浴上持续温和地搅拌15min后，低温离心除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比8:7:2组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:1.2。
实施例3一种牛骨胶原肽的生产工艺
所述的牛骨胶原肽的生产工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量20倍的浓度为0.15mol/L的氢氧化钠溶液浸泡6h，然后用碎骨机粉碎至2cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量12倍的水，在135℃下蒸煮3h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶在温度为60℃下进行一次酶解，酶解时间为2h，所述的复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.6％；然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6.5后，加入木瓜蛋白酶在温度为60℃下进行二次酶解，酶解时间为4h，并辅助超声处理，超声功率为60kHz；所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.3％；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至4℃；所述的微波功率为700W，微波灭酶温度为100℃，微波灭酶时间为3min；
S5、纯化：在4℃下，向步骤S4所得的处理液中，加入有机溶剂，在冰浴上持续温和地搅拌20min后，低温离心除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比11:4:1组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:0.9。
对比例1一种牛骨胶原肽的生产工艺
所述的牛骨胶原肽的生产工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量15倍的浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液浸泡4h，然后用碎骨机粉碎至1.5cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量10倍的水，在130℃下蒸煮2.5h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶在温度为58℃下进行一次酶解，酶解时间为1.5h，所述的复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按重量比1:1:1组成，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.2％；然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6.2后，加入木瓜蛋白酶在温度为58℃下进行二次酶解，酶解时间为3h，并辅助超声处理，超声功率为45kHz；所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.2％；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至2℃；所述的微波功率为600W，微波灭酶温度为90℃，微波灭酶时间为2.5min；
S5、纯化：在2℃下，向步骤S4所得的处理液中，加入有机溶剂，在冰浴上持续温和地搅拌15min后，低温离心除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮按重量比8:7组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:1.2。
与实施例2的区别在于，所述步骤S5中的有机溶剂中未添加为乙酸乙酯。
对比例2一种牛骨胶原肽的生产工艺
所述的牛骨胶原肽的生产工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量15倍的浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液浸泡4h，然后用碎骨机粉碎至1.5cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量10倍的水，在130℃下蒸煮2.5h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶在温度为58℃下进行一次酶解，酶解时间为1.5h，所述的复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按重量比1:1:1组成，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.2％；然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6.2后，加入木瓜蛋白酶在温度为58℃下进行二次酶解，酶解时间为3h，并辅助超声处理，超声功率为45kHz；所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.2％；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至2℃；所述的微波功率为600W，微波灭酶温度为90℃，微波灭酶时间为2.5min；
S5、纯化：在2℃下，向步骤S4所得的处理液中，加入有机溶剂，在冰浴上持续温和地搅拌15min后，低温离心除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比1:1:1组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:1.2。
与实施例2的区别在于，所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比1:1:1组成。
对比例3一种牛骨胶原肽的生产工艺
所述的牛骨胶原肽的生产工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量15倍的浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液浸泡4h，然后用碎骨机粉碎至1.5cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量10倍的水，在130℃下蒸煮2.5h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶在温度为58℃下进行一次酶解，酶解时间为1.5h，所述的复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按重量比1:1:1组成，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.2％；然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6.2后，加入木瓜蛋白酶在温度为58℃下进行二次酶解，酶解时间为3h，并辅助超声处理，超声功率为45kHz；所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.2％；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至2℃；所述的微波功率为600W，微波灭酶温度为90℃，微波灭酶时间为2.5min；
S5、纯化：在2℃下，向步骤S4所得的处理液中，加入有机溶剂，在冰浴上持续温和地搅拌15min后，低温离心除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙醇按重量比8:7:2组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:1.2。
与实施例2的区别在于，所述步骤S5中的有机溶剂用乙醇代替乙酸乙酯。
对比例4一种牛骨胶原肽的生产工艺
所述的牛骨胶原肽的生产工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量15倍的浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液浸泡4h，然后用碎骨机粉碎至1.5cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量10倍的水，在130℃下蒸煮2.5h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶在温度为58℃下进行一次酶解，酶解时间为1.5h，所述的复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按重量比1:1:1组成，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.2％；然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6.2后，加入木瓜蛋白酶在温度为58℃下进行二次酶解，酶解时间为3h，并辅助超声处理，超声功率为45kHz；所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.2％；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至2℃；所述的微波功率为600W，微波灭酶温度为90℃，微波灭酶时间为2.5min；
S5、纯化：向将步骤S4中的处理液中加入氯化钠溶液至溶液最终浓度为0.9mol/L，同时析出絮状沉淀，于4℃，12000r/min离心15min，除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比8:7:2组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:1.2。
与实施例2的区别在于，所述步骤S5纯化过程与实施例2不同，采用盐析沉淀。
试验例一、分子量分布情况
1.试验材料：实施例1～3，对比例1～4制备的牛骨胶原肽。
2.试验方法：采用GB/T 22729-2008对本发明实施例1～3，对比例1～4制得的牛骨胶原肽的分子量分布进行检测。
3.试验结果
试验结果如表1所示。
表1牛骨胶原肽分子量分布占比
由表1可知，采用本发明实施例1～3所述的方法制得的牛骨胶原肽的平均分子量主要分布在500～1000Da之间，其中实施例2中500～1000Da区间的分子量占比达到84.4％，小于1000Da区间的分子量占比达到92.7％，为本发明的最佳实施例，人体对小于1000Da分子量区间的牛骨胶原肽的吸收利用率高，服用效果好。而对比例1～3中改变了所述牛骨胶原肽生产工艺纯化步骤中的有机溶剂的组分及配比以后，得到的牛骨胶原肽500～1000Da区间的分子量占比仅为50％左右，而对比例4采用盐析的方式对牛骨胶原肽进行纯化，得到的牛骨胶原肽分子量不集中。说明了本发明采用的牛骨胶原肽的生产工艺能有效去除牛骨胶原肽中的杂质及杂蛋白，将牛骨胶原蛋白肽分子量集中在500～1000Da区间内，提高人体的生物利用度。
试验例二、小白鼠负重游泳实验
1.试验材料：实施例1～3，对比例1～4制备的牛骨胶原肽。
2.试验方法：选取七周龄雄性ICR小白鼠90只，小白鼠质量为(20±1)g，将小白鼠随机分配为空白组、阳性对照组以及实施例1～3组，对比例1～4组，，每组10只其中空白组所用药物为生理盐水、阳性对照组选用普通市售牛骨胶原肽，每日一次灌胃给予小白鼠受试药物，剂量为0.15g/Kg，灌胃15天。
末次给药30分钟后，将小白鼠尾部负上相应体重的3％的铅皮，各组随机抽取1只小白鼠，放入水中开始计时，到小白鼠力竭结束计时，记录小白鼠首次下沉时间和力竭结束时间，两者时间之差表现小白鼠耐力。
检测标准：首次下沉标准为小白鼠鼻尖首次没入水面以下，力竭标准为小白鼠沉入水下10s步上浮。
3.试验结果
试验结果如表2所示。
表2小鼠耐力时间
由表2可知，采用本发明实施例1～3组所述的方法制得的牛骨胶原肽灌胃的小白鼠耐力时间显著高于空白组，且优于阳性对照组(普通市售牛骨胶原肽)，其中实施例2组的小白鼠的平均耐力时间达到44.6min，为本发明的最佳实施例。而采用对比例1～3组(改变了所述牛骨胶原肽生产工艺纯化步骤中的有机溶剂的组分及配比)以及对比例4(采用盐析的方式对牛骨胶原肽进行纯化)制得的牛骨胶原肽灌胃后的小白鼠，平均耐力时间较实施例组明显降低，由此可以说明，采用本发明的生产工艺制得的牛骨胶原肽更有利于人体的吸收，能有效提高人体的生物利用度，延缓小白鼠体力疲劳。
试验例三、牛骨胶原肽溶解性测试
1.试验材料：实施例1～3，对比例1～4制备的牛骨胶原肽。
2.试验方法：取实施例1～3，对比例1～4制备的牛骨胶原肽各0.3g溶于20mL蒸馏水中，在25℃室温下放置30min，用0.1mol/L HCl溶液调节至pH值至7，定容至25mL，将溶液以4000r/min的转速离心15min，分别测定上清液及沉淀中的蛋白质含量，以上清液中蛋白质含量/总蛋白质含量表示蛋白质的溶解度(S)，公式为：S(％)＝(上清液中蛋白质含量/样品中总蛋白质含量)×100％。
3.试验结果
试验结果如表3所示。
表3牛骨胶原肽溶解度
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 |
| 溶解度S(％) | 99.3 | 99.6 | 99.2 | 81.4 | 84.1 | 79.3 | 67.5 |
由表3可知：采用本发明实施例1～3的生产方法制备的牛骨胶原肽溶于水后，溶解度均大于99％，其中实施例2效果最好，为本发明的最佳实施例，为本发明的最佳实施例。而采用对比例1～3组(改变了所述牛骨胶原肽生产工艺纯化步骤中的有机溶剂的组分及配比)以及对比例4(采用盐析的方式对牛骨胶原肽进行纯化)制得的牛骨胶原肽粉的溶解度远低于实施例中的溶解度，说明本发明的生产工艺能有效去除不易溶解的物质和杂质，进一步提高成品的溶解性能，使得获得的牛骨胶原蛋白肽成品极易溶于水、水复溶性极佳，溶于水后的溶解液澄清透明、无沉淀。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种牛骨胶原肽的生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1、原料预处理：选取新鲜洗净后的牛骨，加入其质量10～20倍的氢氧化钠溶液浸泡3～6h，然后用碎骨机粉碎至1～2cm的骨块，放入蒸煮罐中加入牛骨质量8～12倍的水，在120～135℃下蒸煮1.5～3h，得到蒸煮液；
S2、油水分离：将步骤S1所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到粗胶原蛋白溶液；
S3、酶解：向步骤S2所得粗胶原蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行一次酶解，然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6～6.5后，加入木瓜蛋白酶进行二次酶解，并辅助超声处理；
S4、微波灭酶：将所述步骤S3所得的二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到处理液，静置冷却至0～4℃；
S5、纯化：在0～4℃下，向步骤S4所得的处理液中，加入有机溶剂，在冰浴上持续温和地搅拌10～20min后，低温离心除去上清液，得到牛骨胶原蛋白沉淀；
S6、干燥制粉：将步骤所述S5所得的牛骨胶原蛋白沉淀进行喷雾干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉末。
2.如权利要求1所述的牛骨胶原肽的生产工艺，其特征在于，所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比6～11:4～10:1～5组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:(0.9～1.3)。
3.如权利要求2所述的牛骨胶原肽的生产工艺，其特征在于，所述步骤S5中加入的有机溶剂为异丙醇、丙酮、乙酸乙酯按重量比8:7:2组成，所述有机溶剂的添加量与处理液的体积比为1:1.2。
4.如权利要求1所述的牛骨胶原肽的生产工艺，其特征在于，所述步骤S1中添加的氢氧化钠溶液的浓度为0.05～0.15mol/L。
5.如权利要求1所述的牛骨胶原肽的生产工艺，其特征在于，所述步骤S3中一次酶解的温度为55℃～60℃，一次酶解时间为1h～2h，所述的复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物；所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的0.8～1.6％。
6.如权利要求1所述的牛骨胶原肽的生产工艺，其特征在于，所述步骤S3中二次酶解时间为2h-4h，温度为55℃～60℃，所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.1％～0.3％。
7.如权利要求1所述的牛骨胶原肽的生产工艺，其特征在于，所述步骤S3中的超声功率为30～60kHz。
8.如权利要求1所述的牛骨胶原肽的生产工艺，其特征在于，所述步骤S4中的微波功率为450～700W，微波灭酶温度为80～100℃，微波灭酶时间为2～3min。
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