CN111118093A - 一种非变性牦牛皮胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其包括如下步骤：(1)预处理；(2)脱脂去杂；(3)酸化匀浆；(4)酶解；(5)盐析纯化：于步骤(4)得到的上清液中加入饱和食盐水，并不断搅拌至无白色絮状物继续析出，之后静置、离心，收集沉淀物；(6)等电点纯化：用醋酸溶液溶解步骤(5)获得的沉淀物，之后使用NaOH调节pH至6.5～7.0，静置，离心，收集沉淀物；(7)脱盐；(8)干燥。本发明方法克服了胶原蛋白的传统制备工艺对胶原蛋白三螺旋结构造成破坏的弊端，采用全程低温制备工艺，利用醋酸，酶解，冷冻干燥等工艺获取非变性牦牛皮胶原蛋白，工艺过程操作简单，可实现工业规模化生产，制备的非变性牦牛皮胶原蛋白在生物敷料、给药载体等医用生物领域具有较好的开发利用前景。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种非变性牦牛皮胶原蛋白及其制备方法。
背景技术
牦牛是中国乃至世界都稀有的半野生地方类特有种群，主要生长在碧水蓝天和牧草茂盛的青藏高原、青海等地区，这些地区高寒缺氧且冰封期长达半年左右，且牦牛在夏天啃食的牧草中还夹杂着各类名贵中草药，这样环境下的牦牛不仅肉质鲜美而且浑身是宝，其中牦牛皮就是世上绝无仅有的优质胶原提取宝库，然而目前牦牛皮却主要用于制革，严重降低了牦牛皮的利用价值。
胶原蛋白作为一种天然的生物大分子物质，因其具有良好的生物相容性、可降解性以及创伤修复、止血、抗辐射、抗衰老等生物活性，已广泛应用于食品、生物医药和化妆品等领域。随着医疗和科学水平的不断进步，Ⅰ型胶原蛋白在细胞培养及医用三维支架材料等方面的应用需求不断增加。目前市场上所售的胶原蛋白，绝大部分都是通过高温水解结合酶解制备的胶原蛋白肽，此时的胶原蛋白已被破坏了原有的三螺旋结构，降低了其生物功能性。此外市场上也有少量的鼠尾胶原蛋白，但因其原料的限制，难以规模化生产。因此，发明牦牛皮胶原蛋白的提取纯化工艺是十分必要的。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种非变性牦牛皮胶原蛋白及其制备方法，本发明选用优质的天然新鲜牦牛皮为原材料，既保证了胶原蛋白的源头品质，同时在国家对牦牛的政策支持下也保障了牦牛皮的资源充足，本发明克服了胶原蛋白的传统制备工艺对胶原蛋白三螺旋结构造成破坏的弊端，采用全程低温制备工艺，利用醋酸，酶解，冷冻干燥等工艺获取非变性牦牛皮胶原蛋白，工艺过程操作简单，可实现工业规模化生产，制备的非变性牦牛皮胶原蛋白在生物敷料、给药载体等医用生物领域具有较好的开发利用前景。
本发明通过下述技术方案实现。
一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)预处理：将新鲜牦牛皮脱毛，剔除皮下脂肪，洗净沥干后切成小碎块，备用；
(2)脱脂去杂：于步骤(1)得到的牦牛皮碎块中加入碱性溶液并不断搅拌脱脂，然后使用蒸馏水洗涤至pH为中性，之后加入氯化钠溶液不断搅拌去杂，最后使用蒸馏水洗至pH为中性；
(3)酸化匀浆：于步骤(2)处理后的牦牛皮碎块中按料液比1:5～10kg/L加入醋酸溶液，浸泡8～15h后进行匀浆；
(4)酶解：于步骤(3)所得的浆液中按料液比1:10～20kg/L加入醋酸溶液，之后加入胃蛋白酶，酶解提取12～24h后离心，收集上清液；
(5)盐析纯化：于步骤(4)得到的上清液中加入饱和食盐水，并不断搅拌至无白色絮状物继续析出，之后静置、离心，收集沉淀物；
(6)等电点纯化：用醋酸溶液溶解步骤(5)获得的沉淀物，之后使用NaOH调节pH至6.5～7.0，静置，离心，收集沉淀物；
(7)脱盐：用醋酸溶液溶解步骤(6)获得的沉淀物，之后调节pH，依次通过强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂进行脱盐处理；
(8)干燥：将脱盐后的胶原蛋白溶液真空冷冻干燥，灭菌，即得到成品非变性牦牛皮胶原蛋白。
作为具体技术方案，所述步骤(2)至步骤(7)均在4～10℃的低温条件下进行。
作为具体技术方案，所述步骤(2)中，搅拌脱脂的时间控制为12～24h，搅拌去杂的时间控制为5～10h。
作为具体技术方案，所述步骤(2)中，碱性溶液为质量浓度3％～5％的碳酸钠溶液，氯化钠溶液的质量浓度为2％～7％。
作为具体技术方案，所述步骤(2)中，控制牦牛皮碎块与碱性溶液的料液比为1:5～10kg/L，控制牦牛皮碎块与氯化钠溶液的料液比为1:3～8kg/L。
作为具体技术方案，所述步骤(6)、步骤(7)中，醋酸溶液的浓度为0.05～0.1mol/L。
作为具体技术方案，所述步骤(3)、步骤(4)中，醋酸溶液的浓度为0.05～0.2mol/L。
作为具体技术方案，所述步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)中，离心速率为8000～10000rpm，离心时间为15～30min。
采用上述方法制备的非变性牦牛皮胶原蛋白。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1)本发明制备胶原蛋白所选用的原材料为纯天然牦牛的新鲜皮肤，从源头提高胶原蛋白的质量品质。
2)本发明选用了牦牛皮为原材料提取胶原蛋白，而非骨骼或者跟腱等，其优势在于牦牛皮预处理简单，杂质含量低，只需简单的脱毛脱脂洗净即可，无需任何高温加热处理。
3)本发明采用了盐析法结合等电点沉降法对胶原蛋白粗提液进行纯化，相比传统单一的纯化方法，更有效的提高了胶原蛋白的纯度。
4)本发明全程未采用任何高温处理，低温条件下较好的保持了牦牛皮胶原蛋白原有的生物功能性，使其更好的适用于医用生物材料和科学研究需要。
5)本发明所提供的非变性牦牛皮胶原蛋白可作为生物敷料应用于皮肤烧伤、烫伤的修补治疗，可作为胶原止血材料应用于组织出血的治疗中，可作为眼睛给药的载体应用于眼科疾病的治疗，可进一步开发用于种子细胞的培育，可作为组织工程支架材料及器官构建等临床应用。
附图说明
图1为采用实施例1方法制备的非变性毛牛皮胶原蛋白的冻干样品实物图；
图2为采用实施例1方法制备的非变性毛牛皮胶原蛋白的紫外光光谱分析图；
图3为采用实施例1方法制备的非变性毛牛皮胶原蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图，图3中各标识的含义a-蛋白marker；b-成品非变性牦牛皮胶原蛋白(1mg/mL)；c-只经过一次盐析沉淀处理得到的胶原蛋白(1mg/mL)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
(1)预处理：将约500g新鲜牦牛皮进行机械脱毛，剔除皮下脂肪，然后使用清水洗净后，沥干表面水分，切成大小约为0.5cm×0.5cm的小碎块，放入-20℃冰箱保存备用；
(2)脱脂去杂：将切好的牦牛皮碎块加入2.5L浓度为5％的纯碱溶液中浸泡，4℃低温低速搅拌，脱脂12h后，用蒸馏水洗涤至pH为中性；再向脱脂牦牛皮中加入4L质量浓度为5％氯化钠溶液继续浸泡，4℃低温低速搅拌，5h后，使用蒸馏水洗至pH为中性；
(3)酸化匀浆：将上述所得脱脂去杂后的牦牛皮碎块加入2.5L浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中，浸泡8h后，在低温环境下使用匀浆机将其充分匀浆；
(4)酶解：向上述所得匀浆液中再加入7.5L浓度为0.2mol/L的醋酸溶液，并加入5g酶活力为10万U/g的胃蛋白酶，在10℃温度下使用摇床摇晃提取24h后，提取液于10000rpm高速冷冻离心15min，弃去沉淀物，收集上清液；
(5)盐析纯化：向上述收集上清液中加入饱和食盐水，并不断搅拌至无白色絮状物继续析出，加入饱和食盐水体积约为1.5L，静置2h，10000rpm高速冷冻离心15min，收集沉淀物；
(6)等电点纯化：于步骤(5)所得的沉淀物加入5L浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中重新溶解，充分溶解后，使用NaOH调节pH至6.5，静置2h，10000rpm高速冷冻离心15min，收集沉淀物；
(7)脱盐：于步骤(6)所得的沉淀物加入0.05mol/L的醋酸溶液中再次溶解，充分溶解后，使用1mol/L的NaOH调节pH至4.3，溶液依次通过001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，D311大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂进行脱盐处理；
(8)干燥：将脱盐后的胶原蛋白溶液，-20℃预冻8h，真空冷冻干燥，紫外辐射灭菌、包装，得到成品非变性牦牛皮胶原蛋白，纯度达到98％以上。
实施例2
一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
(1)预处理：将约1kg新鲜牦牛皮进行机械脱毛，剔除皮下脂肪，然后使用清水洗净后，沥干表面水分，切成大小约为0.5cm×0.5cm的小碎块，放入-20℃冰箱保存备用；
(2)脱脂去杂：将切好的牦牛皮碎块加入10L浓度为3％的纯碱溶液中浸泡，4℃低温低速搅拌，脱脂8h后，用纯化水洗涤至pH为中性；再向脱脂牦牛皮中加入10L质量浓度为3％氯化钠溶液继续浸泡，4℃低温低速搅拌，10h后，使用蒸馏水洗至pH为中性；
(3)酸化匀浆：将上述所得脱脂去杂后的牦牛皮碎块加入10L浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中，浸泡4h后，在低温环境下使用匀浆机将其充分匀浆；
(4)酶解：向上述所得匀浆液中再加入10L浓度为0.2mol/L的醋酸溶液，并加入15g酶活力为10万U/g的胃蛋白酶，在10℃温度下使用摇床摇晃提取18h后，提取液于8000rpm高速冷冻离心20min，弃去沉淀物，收集上清液；
(5)盐析纯化：向上述收集上清液中加入饱和食盐水，并不断搅拌至无白色絮状物继续析出，加入饱和食盐水体积约为3.2L，静置4h，8000rpm高速冷冻离心30min，收集沉淀物；
(6)等电点纯化：于步骤(5)所得的沉淀物加入10L浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中重新溶解，充分溶解后，使用NaOH调节pH至7.0，静置2h，8000rpm高速冷冻离心30min，收集沉淀物；
(7)脱盐：于步骤(6)所得的沉淀物加入0.05mol/L的醋酸溶液中再次溶解，充分溶解后，使用0.5mol/L的NaOH调节pH至4.2，溶液依次通过001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，D311大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂进行脱盐处理；
(8)干燥：将脱盐后的胶原蛋白溶液，-80℃预冻2h，真空冷冻干燥，紫外辐射灭菌、包装，得到成品非变性牦牛皮胶原蛋白，纯度达到98％以上。
实施例3
一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
(1)预处理：将约1.5kg新鲜牦牛皮进行机械脱毛，剔除皮下脂肪，然后使用清水洗净后，沥干表面水分，切成大小约为0.5cm×0.5cm的小碎块，放入-20℃冰箱保存备用；
(2)脱脂去杂：将切好的牦牛皮碎块加入10L浓度为5％的纯碱溶液(W/V)中浸泡，4℃低温低速搅拌，脱脂8h后，用纯化水洗涤至pH为中性。再向脱脂牦牛皮中加入10L质量浓度为3％氯化钠溶液继续浸泡，4℃低温低速搅拌，8h后，使用蒸馏水洗至pH为中性；
(3)酸化匀浆：将上述所得脱脂去杂后的牦牛皮碎块加入15L浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中，浸泡4h后，在低温环境下使用匀浆机将其充分匀浆；
(4)酶解：向上述所得匀浆液中再加入15L浓度为0.2mol/L的醋酸溶液，并加入30g酶活力为15万U/g的胃蛋白酶，在10℃温度下使用摇床摇晃提取12h后，提取液于9000rpm高速冷冻离心20min，弃去沉淀物，收集上清液；
(5)盐析纯化：向上述收集上清液中加入饱和食盐水，并不断搅拌至无白色絮状物继续析出，加入饱和食盐水体积约为5L，静置3h，9000rpm高速冷冻离心20min，收集沉淀物；
(6)等电点纯化：于步骤(5)所得的沉淀物加入15L浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中重新溶解，充分溶解后，使用NaoH调节pH至6.8，静置4h，8000rpm高速冷冻离心30min，收集沉淀物；
(7)脱盐：于步骤(6)所得的沉淀物加入0.05mol/L的醋酸溶液中再次溶解，充分溶解后，使用0.5mol/L的NaOH调节pH至4.3，溶液依次通过001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，D311大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂进行脱盐处理；
(8)干燥：将脱盐后的胶原蛋白溶液，-20℃预冻4h，真空冷冻干燥，紫外辐射灭菌、包装，得到成品非变性牦牛皮胶原蛋白，纯度达到98％以上。
实施例4
采用本发明实施例1所述方法制备的非变性牦牛皮胶原蛋白进行蛋白特性分析。
1)冻干样品的外观性状分析
由图1可知，冻干样品呈白色多孔海绵状状态，而非粉末或紧密固体状态，主要原因是因为胶原蛋白本身的三螺旋结构而导致具有成纤维能力并形成多孔网络状结构，由此可见，牦牛皮胶原蛋白的三螺旋结构保持完整，具有良好的生物功能性。
2)紫外光光谱分析
通常采用紫外光谱吸收的方式检测蛋白质时选用280nm的波长，这是因为蛋白质中的部分芳香族残基所引起的，此外由于某些氢键的吸收以及空间构象的影响，导致蛋白质一般在210nm～250nm也有明显吸收峰。对实施例1所得的冻干牦牛皮胶原蛋白进行紫外光谱分析，结果如图2所示，结果显示在280nm处没有明显吸收峰，这与胶原蛋白中几乎不含酪氨酸和色氨酸等具有共轭双键的氨基酸的特性相符。
3)紫外光光谱分析
采用SDS-PAGE凝胶电泳(配胶浓度为5％浓缩胶和8％分离胶)鉴定实施例1获得的胶原蛋白，结果如图3所示。由图可知，该胶原蛋白有三条明显的谱带，表明该胶原蛋白的纯度高，其中两条分布在100kDa附近(胶原蛋白α链)，另外一条谱带位于205kDa左右(α链的二聚体)，这与文献报道的胶原蛋白分子量约为300kDa相符。
Claims (9)
1.一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)预处理：将新鲜牦牛皮脱毛，剔除皮下脂肪，洗净沥干后切成小碎块，备用；
(2)脱脂去杂：于步骤(1)得到的牦牛皮碎块中加入碱性溶液并不断搅拌脱脂，然后使用蒸馏水洗涤至pH为中性，之后加入氯化钠溶液不断搅拌去杂，最后使用蒸馏水洗至pH为中性；
(3)酸化匀浆：于步骤(2)处理后的牦牛皮碎块中按料液比1:5～10kg/L加入醋酸溶液，浸泡8～15h后进行匀浆；
(4)酶解：于步骤(3)所得的浆液中按料液比1:10～20kg/L加入醋酸溶液，之后加入胃蛋白酶，酶解提取12～24h后离心，收集上清液；
(5)盐析纯化：于步骤(4)得到的上清液中加入饱和食盐水，并不断搅拌至无白色絮状物继续析出，之后静置、离心，收集沉淀物；
(6)等电点纯化：用醋酸溶液溶解步骤(5)获得的沉淀物，之后使用NaOH调节pH至6.5～7.0，静置，离心，收集沉淀物；
(7)脱盐：用醋酸溶液溶解步骤(6)获得的沉淀物，之后调节pH，依次通过强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂进行脱盐处理；
(8)干燥：将脱盐后的胶原蛋白溶液真空冷冻干燥，灭菌，即得到成品非变性牦牛皮胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(2)至步骤(7)均在4～10℃的低温条件下进行。
3.如权利要求1所述的一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，搅拌脱脂的时间控制为12～24h，搅拌去杂的时间控制为5～10h。
4.如权利要求1所述的一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，碱性溶液为质量浓度3％～5％的碳酸钠溶液，氯化钠溶液的质量浓度为2％～7％。
5.如权利要求1所述的一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，控制牦牛皮碎块与碱性溶液的料液比为1:5～10kg/L，控制牦牛皮碎块与氯化钠溶液的料液比为1:3～8kg/L。
6.如权利要求2所述的一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(6)、步骤(7)中，醋酸溶液的浓度为0.05～0.1mol/L。
7.如权利要求2～6任一所述的一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(3)、步骤(4)中，醋酸溶液的浓度为0.05～0.2mol/L。
8.如权利要求2～6任一所述的一种非变性牦牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)中，离心速率为8000～10000rpm，离心时间为15～30min。
9.采用权利要求1～6任一所述方法制备的非变性牦牛皮胶原蛋白。
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