KR101760890B1 - 콜라겐 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 혼합 용액을 사용하여 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 고순도의 콜라겐을 고수율로 추출하면서도, 불쾌한 냄새가 제거된 콜라겐을 제조할 수 있어, 추가적인 가공 과정 없이도 화장료 및 식품 등과 같이 냄새에 민감한 제품에 적용가능하다.
Description
본 발명은 신규 콜라겐 제조방법에 관한 것이다.
콜라겐은 동물성 소재에서 유래된 섬유상의 구조단백질로서 동물의 피부, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 혈관 기타 결합 조직에 풍부하게 존재하며, 체단백질의 약 30% 이상을 차지한다. 콜라겐은 2중 나선구조를 하고 있는 근원섬유단밸질과 달리 3중 나선구조의 형태로 존재하며, 트로포콜라겐(tropocollagen)을 기본단위로 한다. 구성 아미노산의 조성은 형태에 따라 다소 차이가 있으나, 일반적으로 글리세린, 프롤린 및 하이드록시프롤린이 주를 이룬다(Kim et al., 2010, Extraction and bleaching of acid- and pepsin-soluble collagens from shark skin and muscle, Korean J. Food Preserv., 17, 91-99).
콜라겐의 구성비는 생체의 연령 변화에 따라 변화하는데, 연령이 증가함에 따라 결국 그 함량이 감소한다. 고령화에 따른 콜라겐 감소는 세포의 신진대사인 수분대사 조절에 영향을 주어 노화의 진행이 빨라지고, 각 조직 중의 수분함량을 감소시켜 결합조직의 원활함과 피부의 탄력도 없어진다. 그에 따라, 현대에는 콜라겐을 인체에 보충하여 피부노화를 방지하고 주름을 방지하는 다양한 제품들이 출시되고 있다.
특히, 콜라겐이 화장료로 사용되는 경우 주름개선 뿐만 아니라 보습성이 좋아지며 텍스쳐 또한 개선되어 사용감이 향상되는 효과가 있어, 화장료로서의 가치가 크게 증가하고 있는 추세이다. 또한 콜라겐은 겔 형성, 보수성 및 유화안정성 등의 기능적 특성을 지니고 있어 기능성 식품소재로서도 중요하게 인식되고 있다(Gomez-Guillen et al., 2011, Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources: A review, Food Hydrocolloids, 25, 1813-1827).
위와 같은 배경 하에, 대량으로 산업적으로 적합한 콜라겐을 생산하고자 다양한 콜라겐 추출방법이 연구 중에 있지만, 그 연구 결과가 미비한 실정이다. 예컨대, 대한민국 공개특허 제2009-0105984호에서는, 눈다랑어 껍질에 아세트산을 처리하여 콜라겐을 추출하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 추출에 아세트산을 사용하는 경우 콜라겐에 산 고유의 불쾌한 냄새가 잔존하여, 추출된 콜라겐을 화장료 또는 식품의 원료로 곧바로 사용하기에는 어려움이 있다. 이에 따라, 화장료 및 식품 원료로 사용하기 위해서 추가적인 공정으로 냄새를 제거하는 과정이 필수적으로 수반되어야 한다.
따라서, 간단한 제조 공정을 이용하면서 불쾌한 냄새 등이 발생하지 않고 고순도로 콜라겐을 제조할 수 있는 신규한 콜라겐 제조 방법에 대한 연구 개발이 필요한 실정이다.
Kim et al., 2010, Extraction and bleaching of acid- and pepsin-soluble collagens from shark skin and muscle, Korean J. Food Preserv., 17, 91-99
Gomez-Guillen et al., 2011, Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources: A review, Food Hydrocolloids, 25, 1813-1827
대한민국 공개특허 10-2009-0105984
대한민국 공개특허 10-2012-0024110
본 발명의 목적은 동물의 결합조직을 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 혼합 용액을 이용하여 추출하는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 불쾌한 냄새로 인해 추가적으로 정제 공정이 필요한 콜라겐의 제조 공정을 단축하면서 고순도로 콜라겐을 제조하고자 콜라겐 추출 방법에 대하여 연구하던 중, 아스코르브산 및/또는 시트르산을 이용하여 콜라겐을 제조하는 경우 제조된 콜라겐에서 불쾌한 냄새가 나지 않으면서도 고순도의 콜라겐을 고수율로 수득 가능한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은
ⅰ) 동물의 결합조직을 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 혼합 용액 중에서 선택된 유기산 용액으로 팽윤시켜 불순물을 제거하는 단계;
ⅱ) 단계 ⅰ)의 팽윤된 결합조직을 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 혼합 용액 중에서 선택된 유기산 용액에 넣고 분쇄하는 단계; 및
ⅲ) 단계 ⅱ)의 분쇄물에 아스코르브산, 시트르산, 또는 이들의 혼합 용액 중에서 선택된 유기산 용액에 용해시킨 단백분해효소를 첨가하여 콜라겐을 추출하는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 콜라겐의 제조방법은 ⅰ) 동물의 결합조직을 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 혼합 용액 중에서 선택된 유기산 용액으로 팽윤시켜 불순물을 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명의 단계 ⅰ)은 결합조직에 부착되어있는 지방 등의 불순물을 제거하는 전처리 과정이다.
본 발명에 있어서, 동물은 밝혀진 방법에 의해 콜라겐을 추출할 수 있는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 포유류, 조류 및 어류일 수 있으며, 바람직하게는 돼지, 소, 말, 염소, 닭, 오리, 거위, 고래, 또는 상어일 수 있고, 더욱 바람직하게는 돼지일 수 있다.
본 발명에서“결합조직”이란, 다세포 생물의 몸을 구성하는 조직의 일종으로, 각 세포, 조직, 장기 등을 결합, 보호, 충진하는 역할을 하는 신체조직을 의미한다. 본 발명에 있어서, 결합조직은 콜라겐이 존재한다고 알려진 동물의 모든 장기를 포함하며, 예를 들어, 동물의 피부, 힘줄, 인대, 건막, 연골, 뼈 조직 또는 탯줄일 수 있고, 바람직하게는 피부 일 수 있다. 결합조직은 동물로부터 수득 가능한 임의의 크기일 수 있으며, 바람직하게는 150mm2 내지 1000 m2의 더 바람직하게는 200mm2 내지 750mm2 범위의 크기로 사용할 수 있다.
본 발명에서 유기산 용액은 아스코르브산 용액, 시트르산 용액 또는 이들의 혼합 용액일 수 있으며, 바람직하게는 아스코르브산 용액, 또는 아스코르브산 및 시트르산의 혼합용액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 아스코르브산 용액일 수 있다. 특히, 본 발명은 유기산으로 상기 아스코르브산 용액, 시트르산 용액 또는 이들의 혼합 용액을 사용함으로써 콜라겐의 불쾌한 냄새 제거에 현저한 효과를 보인다.
본 발명의 아스코르브산 용액, 시트르산 용액 또는 이들의 혼합 용액은 0.05 M 내지 2 M의 농도일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 M 내지 1.0 M 일 수 있다.
본 발명의 단계 ⅰ)의 수행시간은 실시 온도에 따라서 상이해 질 수 있으나, 일반적으로는 5시간 내지 72시간, 바람직하게는 12시간 내지 60시간, 가장 바람직하게는 24시간 내지 48시간 일 수 있다.
본 발명은 단계 ⅰ)을 수행할 때, 결합 조직에 유기산 용액 침투를 용이하게 하는 추가 공정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 액체 스트림을 형성하거나, 초음파 또는 고주파수의 수파 생성시킬 수 있다.
본 발명은 단계 ⅰ) 이후에 추가적인 불순물의 제거과정을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 칼이나 끌 등의 도구를 이용한 물리적 제거 또는 세제 등의 화학물질을 이용한 화학적 제거를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 단계 ⅰ)의 팽윤된 동물 결합조직을 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척에는 정제수, 증류수, 식염수 기타 완충용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 돈피를 0.5 M 아스코르브산 용액에 담가 팽윤시켜 상피층 및 지방을 제거하고, 칼로 남아있는 지방층을 제거한 후, 정제수로 3회 세척하여 진피층을 수득하였다.
본 발명의 콜라겐 제조 방법은 ⅱ) 단계 ⅰ)의 팽윤된 결합조직을 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 혼합 용액 중에서 선택된 유기산 용액에 넣고 분쇄하는 단계를 포함한다.
본 발명의 단계 ⅱ)는 전처리된 동물의 결합조직으로부터 콜라겐을 추출하는 과정이다.
본 발명에서 단계 ⅱ)의 분쇄는 다지기, 찢기, 절단, 갈기, 전단가공(shearing) 또는 이들의 혼합에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 믹서등의 장치로 갈아서 수행된다.
본 발명에서 유기산 용액은 아스코르브산 용액, 시트르산 용액 또는 이들의 혼합 용액일 수 있으며, 바람직하게는 아스코르브산 용액, 또는 아스코르브산 및 시트르산의 혼합 용액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 아스코르브산 용액일 수 있다. 유기산으로 아스코르브산 또는 시트르산을 사용하는 경우, 추출된 콜라겐에 산 특유의 냄새가 잔존하지 않아, 추가적인 냄새의 제거공정 없이도 화장료 및 식품에 사용할 수 있으며, 고순도로 콜라겐을 수득할 수 있다.
본 발명의 아스코르브산 용액, 시트르산 용액 또는 이들의 혼합 용액은 0.05 M 내지 5 M의 농도일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 M 내지 2.0 M 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예 따르면, 진피와 0.5 M 아스코르브산 용액을 믹서기에 넣고 분쇄하였다.
본 발명의 콜라겐 제조 방법은 ⅲ) 단계 ⅱ)의 분쇄물에 아스코르브산, 시트르산, 또는 이들의 혼합 용액 중에서 선택된 유기산 용액에 용해시킨 단백분해효소를 첨가하여 콜라겐을 추출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 “단백분해효소”란, 단백질의 펩티드 결합을 가수분해하는 효소를 의미한다.
본 발명에서 단백분해효소는 콜라게나아제를 제외한 당업계에 공지된 임의의 효소일 수 있으며, 바람직하게는 펩신, 브로멜라인, 키모파파인, 키모트립신, 콜라게나제, 피신, 파파인, 펩티다제, 트립신, 미생물 유래 단백 분해효소 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있고, 가장 바람직하게는 펩신일 수 있다.
본 발명의 단백분해효소는 동물의 결합조직의 총량을 기준으로 0.1 중량% 내지 20 중량% 범위로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 1 중량% 내지 10 중량%, 가장 바람직하게는 2 중량% 내지 8 중량% 범위로 사용될 수 있다.
상기 콜라겐의 추출은 12시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 18시간 내지 36시간 동안 수행할 수 있으며, 가장 바람직하게는 20시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예 따르면, 상기 단계 ⅱ)의 분쇄물을 펩신이 용해되어 있는 아스코르브산 용액을 첨가하여 진피로부터 콜라겐을 추출하였다.
본 발명의 콜라겐 제조 방법은 추가적인 정제를 위하여, 본 발명의 단계 ⅲ)의 추출 후에 염을 가하여 응집물을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 염으로는 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 염의 농도는 0.1 M 내지 10.0 M 일 수 있으며, 바람직하게는 1.0 M 내지 8.0 M일 수 있고, 가장 바람직하게는 3.0 M 내지 6.0 M 일 수 있다.
또한, 본 발명은 단계 ⅲ)의 추출 후에 염을 가하여 수득한 응집물을 투석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 투석은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 진행 가능하나, 바람직하게는 투석 튜브에 응집물을 넣어 진행할 수 있다.
상기 투석 단계에 있어서, 투석액은 증류수, 유기산 용액 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 유기산 용액일 수 있다. 상기 유기산 용액에서 산은 예를 들어, 아스코르브산, 시트르산 또는 이의 혼합물 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 유기산 용액의 농도는 0.02 M 내지 0.08 M 일 수 있으며, 바람직하게는 0.04 M 내지 0.06 M 일 수 있다. 또한 투석은 12시간 내지 4일 동안 진행하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 18시간 내지 3일 동안 진행하고, 가장 바람직하게는 24시간 내지 48시간 동안 진행한다.
본 발명의 일 구현예에서, 추출된 콜라겐을 여과한 후, 5 M 염화나트륨 용액을 첨가하고 정치시켜 응집물을 수득하였다. 상기 응집물을 24시간 동안 투석하여 정제된 콜라겐을 획득하였다.
본 발명은 또한 상기 단계 ⅲ)의 추출 후 또는 상기 투석 단계 이후 콜라겐 용액을 농축하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 농축은 당업계에 알려진 일반적인 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예컨대 TFF(Tangential Flow Filtration) 시스템 등을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 TFF 시스템을 이용하여 농축을 수행하는 경우, 여과막의 공극의 크기는 50kDa 내지 150kDa 일 수 있으며, 바람직하게는 80kDa 내지 120kDa일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 투석을 완료한 콜라겐을 100kDa 공극의 여과막으로 TFF 장치를 사용하여 농축하였다. 그 결과, 높은 수율로 콜라겐을 획득할 수 있었으며, 콜라겐에서 불쾌한 냄새가 나지 않았다.
본 발명 제조 방법에 따른 제조 공정을 도 1에 도시하였다. 도 1에서 붉은 색 선 필수적 공정을 나타내며, 파란색 선은 각 필수적 공정 단계에 포함되는 필수적 공정의 구체 공정을 나타내며, 점선은 각 공정 단계에 추가로 포함될 수 있는 선택적 공정을 나타낸다.
구체적으로, 동물의 결합조직을 채취한 후, 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 혼합 용액 하에 팽윤시켜 불순물을 제거하는 전처리 과정을 거치며, 이때 선택적으로 세척과정을 더 포함할 수 있다.
그 후, 전처리된 결합조직을 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 혼합용액에 넣어 분쇄하고, 단백분해효소를 첨가하여 콜라겐을 추출한다.
추출된 콜라겐은 선택적으로 여과, 정제 또는 농축 공정을 더 거칠 수 있으며, 상기 정제과정은 염을 첨가한 후, 투석하는 과정을 포함할 수 있다.
본 발명은 아스코르브산 또는 시트르산을 사용하여 콜라겐을 추출함으로써, 산 특유의 불쾌한 냄새가 나지 않는 콜라겐을 제조할 수 있으며, 높은 수율 및 순도로 콜라겐을 수득할 수 있다. 따라서 본 발명의 제조방법으로 수득한 콜라겐은 추가적인 가공과정 없이도 화장료 및 식품 등과 같이 냄새에 민감한 제품에 용이하게 적용가능하다.
도 1은 본 발명의 콜라겐 제조방법의 제조 단계를 나타내는 모식도이다.
도 2는 실시예 1의 방법으로 제조한 콜라겐 용액을 나타낸다.
도 3은 콜라겐 용액의 농도를 측정한 것을 나타낸 그래프로, □는 실시예 1의 방법으로 제조한 콜라겐 용액, ○는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되 아스코르브산을 아세트산으로 교체한 방법에 의해 제조한 콜라겐 용액에 해당한다.
도 4는 실시예 1의 방법으로 제조한 콜라겐 및 아세트산을 사용하여 제조한 콜라겐의 순도를 SDS-PAGE로 확인한 것을 나타낸 것으로, M은 protein marker, C1 및 C2는 콜라겐 표준물질, 1은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되 아스코르브산을 아세트산으로 교체한 방법에 의해 수득된 콜라겐, 2는 실시예 1로 제조한 콜라겐에 해당한다.
도 2는 실시예 1의 방법으로 제조한 콜라겐 용액을 나타낸다.
도 3은 콜라겐 용액의 농도를 측정한 것을 나타낸 그래프로, □는 실시예 1의 방법으로 제조한 콜라겐 용액, ○는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되 아스코르브산을 아세트산으로 교체한 방법에 의해 제조한 콜라겐 용액에 해당한다.
도 4는 실시예 1의 방법으로 제조한 콜라겐 및 아세트산을 사용하여 제조한 콜라겐의 순도를 SDS-PAGE로 확인한 것을 나타낸 것으로, M은 protein marker, C1 및 C2는 콜라겐 표준물질, 1은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되 아스코르브산을 아세트산으로 교체한 방법에 의해 수득된 콜라겐, 2는 실시예 1로 제조한 콜라겐에 해당한다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예 1> 콜라겐의 제조
1. 돈피의 채취 및 전처리
제주도 양돈업체로부터 구입한 돼지의 등심부위 피부를 수술용 칼을 이용하여 50g 채취하였다. 채취한 피부 조직을 대략 폭 2-5 cm, 길이 10-15 cm의 크기로 절단 한 후, 작업한 진피 전량을 0.5 M 아스코르브산 용액에 충분히 잠기도록 담그고, 4℃에서, 24시간 동안 팽윤시켜 상피층 및 피하 지방을 제거하였다. 남아있는 지방을 칼로 제거하여 진피 부분을 획득하였다.
분리된 진피를 정제수로 3회 세척한 후, 추출에 사용하기 전까지 냉동 보관하였다.
2. 콜라겐의 추출
냉동 보관된 진피를 해동켰다. 그 후, 50 g의 진피와 0.5 M 아스코르브산 용액 0.5 L를 준비하고, 믹서기로 진피 조각과 0.5 M 아스코르브산 용액을 혼합하여 분쇄하였다. 0.5 M 아스코르브산 용액에 펩신 2.5 g(250 units/mg)을 용해시켜 분쇄물에 첨가하고, 4 ℃에서, 24시간동안 교반하였다.
3. 콜라겐의 여과 및 정제
Filter press 기기를 사용하여 0.8 ㎛ filter pad (af-st-100)로 1차 여과, 0.5 ㎛ filter pad (af-st-130)로 2차 여과, 0.3 ㎛ filter pad (af-st-140)로 3차 여과를 진행하여 불순물을 제거하고, 여과액을 수득하였다.
여과액 5000 ml에 5 M NaCl 용액 810 ml 를 첨가하고 4℃에서 10-30분간 정치시켜 응집물을 획득하였다. 응집물을 6000 rpm, 4℃에서 15분에서 20분간 원심분리하여 Crude 콜라겐을 수득하였다.
원심분리하여 얻은 Crude 콜라겐을 채반으로 20분간 탈수시켰다. 그 후, 탈수된 Crude 콜라겐을 투석막에 튜빙하여 투석액 7 L로 4 ℃에서 24시간 동안 투석하였다.
4. 농축
접선유동여과장치(Centarmate 500S TFF system, PALL)를 사용하여 최종 여액을 농축하였다. 접선유동여과장치에 300kDa 필터 5장을 직렬로 장착하고, 투석된 최종 여액을 로딩하고 3회 여과하였다. 3.5bar까지 농축하여 콜라겐 농축액을 수득하였다.
<실시예 2> 악취 평가
제조된 콜라겐에서 발생하는 냄새를 평가하기 위하여, 1 L 용량의 봉지에 상기 실시예 1에서 제조된 콜라겐을 10 ml 넣고, 패널 10명을 대상으로 하기 표 1에 나타난 바와 같은 기준에 의거 악취를 평가하고, 이의 평균 값을 구하였다. 대조군으로 유기산을 아세트산으로 변경하여 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 제조된 콜라겐을 사용하였다.
[표 1] 악취 평가 척도
상기 악취 평가 결과를 표 2에 나타내었다.
상기 실험 결과에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 콜라겐의 경우 겨우 감지 가능한 냄새가 인지될 정도로 악취를 패널들이 거의 인지하지 못하였지만, 아세트산을 사용한 대조군의 경우 악취 강도가 패널들에게 강하게 느껴진 것이 확인되었다.
<실시예 3> 콜라겐 수율 확인
BioColor사의 Circol TM soluble collagen assay kit를 사용하여 실시예 1에서 수득한 콜라겐의 수율를 확인하였다.
키트에 포함되어 있는 표준물질을 희석하여 5 μg, 10 μg, 15 μg 으로 만들었다. 실시예 1에서 수득한 콜라겐 및 아세트산을 사용하여 수득한 콜라겐을 50배 희석하여 콜라겐 샘플을 만들었다. Sircol Dye를 표준물질과 콜라겐 샘플에 넣고 30분 동안 혼합하였다. 혼합물을 12000rpm 에서 10분간 원심분리한 후에 상등액을 제거하였다. 세척용액을 넣고 1200rpm에서 10분간 원심분리한 후에 상등액을 제거하였다. 알카리 용액을 250 μl 씩 각각의 튜브에 넣고 1시간 30분 동안 교반하였다. ELISA reader (Infinite M200, Tecan)로 555nm 흡광도를 측정하였다.
한편, 비교예로 위 실시예 1의 방법과 동일하게 아세트산을 사용하여 콜라겐을 제조한 것을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 것과 같이, 아세트산을 사용한 경우 콜라겐 용액의 농도가 3.92 mg/ml이었으나, 아스코르브산을 사용한 경우 농도가 5.02 mg/ml이었다. 따라서 아스코르브산을 사용하여 콜라겐을 제조할 경우 종래에 아세트산을 사용하여 콜라겐을 제조한 경우보다 수율이 우수함을 알 수 있다.
<
실시예
4> 순도 확인
콜라겐 표준물질, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되 아스코르브산을 아세트산으로 교체한 방법에 의해 수득된 콜라겐 및 실시예 1에서 수득한 콜라겐을 샘플로 하여 콜라겐 순도확인 실험을 수행하였다.
각각의 샘플을 교반한 뒤 증류수로 10배 희석하였다. 5x protein dye를 샘플량의 20% 양으로 첨가하고, 100 ℃에서 5분간 끓였다. 10% SDS-PAGE 겔에 끓인 샘플을 로딩하였다. 60v 0.06A로 30분간 전개한 후 120v 0.06A 로 전개하였다. Coomassie d 염색을 실시하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 있어서, M은 protein marker, C1 및 C2는 콜라겐 표준물질, 1은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되 아스코르브산을 아세트산으로 교체한 방법에 의해 수득된 콜라겐, 2는 실시예 1로 제조한 콜라겐을 나타낸다. 도 4에 나타낸 것과 같이, 실시예 1로 제조한 콜라겐 샘플이 콜라겐 표준 물질과 동일한 사이즈 및 양상의 밴드를 나타내었으며, 또한 비특이 밴드가 존재하지 않았으며, 특히 본 발명에 따라 수득된 콜라겐은 아세트산을 이용한 방법과 대비하여 훨씬 더 많은 양으로 콜라겐을 생성하였다. 즉, 본 발명의 제조방법으로 수득한 콜라겐이 고순도임을 알 수 있다.
Claims (15)
- ⅰ) 동물의 결합조직을 유기산 용액으로 팽윤시켜 불순물을 제거하는 단계;
ⅱ) 단계 ⅰ)의 팽윤된 결합조직을 유기산 용액에 넣고 분쇄하는 단계; 및
ⅲ) 단계 ⅱ)의 분쇄물에 유기산 용액에 용해시킨 단백분해효소를 첨가하여 콜라겐을 추출하는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법으로서,
상기 유기산 용액은 아스코르브산인 콜라겐의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 단계 ⅰ)의 동물은 돼지, 소, 말, 염소, 닭, 오리, 거위, 고래, 또는 상어 중 선택된 어느 하나 이상인 콜라겐의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 ⅰ)의 결합조직은 동물의 피부, 힘줄, 인대, 건막, 연골, 뼈 조직 또는 탯줄로부터 유래된 것인 콜라겐의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 결합조직은 동물의 피부인 콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 ⅰ)의 동물의 결합조직은 200 mm2 내지 750 m2의 범위의 크기를 갖는 콜라겐의 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 단계 ⅰ) 및 단계 ⅱ) 단계의 유기산 용액의 농도는 0.1 M 내지 2.0 M인 콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 단계 ⅰ)의 팽윤된 동물 결합조직을 정제수, 증류수, 식염수 또는 이들의 혼합물로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 ⅲ)의 단백분해효소는 펩신, 브로멜라인, 키모파파인, 키모트립신, 콜라게나제, 피신, 파파인, 펩티다제, 트립신, 미생물 유래 단백 분해효소 및 이들의 혼합물 중 어느 하나인 콜라겐의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 단백분해효소는 펩신인 콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 단계 ⅲ)의 추출 후에 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 염을 첨가하여 응집물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 콜라겐의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 염의 농도는 3.0 M 내지 6.0 M인 콜라겐의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 수득한 응집물을 투석하는 단계를 추가로 포함하는 콜라겐의 제조방법.
- 제14항에 있어서, 상기 투석은 2일 내지 3일 동안 이루어지는 콜라겐의 제조방법.
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