WO2021112333A1 - 이취가 제거된 고수율 콜라겐의 제조 방법 - Google Patents

이취가 제거된 고수율 콜라겐의 제조 방법 Download PDF

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WO2021112333A1
WO2021112333A1 PCT/KR2020/002808 KR2020002808W WO2021112333A1 WO 2021112333 A1 WO2021112333 A1 WO 2021112333A1 KR 2020002808 W KR2020002808 W KR 2020002808W WO 2021112333 A1 WO2021112333 A1 WO 2021112333A1
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WO
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collagen
acetic acid
acid
solution
recovering
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Application number
PCT/KR2020/002808
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English (en)
French (fr)
Inventor
이종혁
이동혁
육일수
Original Assignee
주식회사 메디카코리아
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing high-yield collagen from which off-flavor has been removed, and more particularly, to a method for producing high-yield collagen from which off-flavor is removed by using a buffer exchange method.
  • Collagen is a fibrous structural protein derived from animal materials and is abundantly present in animal skin, bone, cartilage, tendon, ligament, blood vessel and other connective tissues, and accounts for about 30% or more of body protein. Unlike myofibrillar proteins that have a double helix structure, collagen exists in the form of a triple helix structure, and tropocollagen is the basic unit. The composition of the constituent amino acids is slightly different depending on the form, but in general, glycerin, proline and hydroxyproline are predominant.
  • the composition ratio of collagen changes according to the age of the living body, and the content of collagen decreases as the age increases.
  • the decrease in collagen according to aging affects the regulation of water metabolism, which is the metabolism of cells, and accelerates the aging process, and reduces the moisture content in each tissue, thereby reducing the smoothness of the connective tissue and the loss of skin elasticity. Accordingly, in modern times, various products are being released that supplement collagen to the human body to prevent skin aging and prevent wrinkles.
  • collagen is recognized as important as a functional food material because it has functional properties such as gel formation, water retention and emulsion stability.
  • Korean Patent Laid-Open No. 10-2009-0105984 discloses a method for extracting collagen by treating bigeye tuna with acetic acid.
  • the conventional collagen extraction method has a low yield, making it difficult to utilize in industries producing medical devices and cosmetics, and the cost for raw material supply can be extremely expensive. There is a problem in that the off-odor is severe.
  • the present invention uses a buffer exchange method of exchanging acetic acid with another organic acid solvent in an intermediate process compared to the existing method for producing collagen using a single solvent such as acetic acid or citric acid. High yield. The present invention was completed by confirming that collagen was produced while maintaining silver and odor removed.
  • an object of the present invention is to recover the collagen layer from which fat has been removed by (a) swelling the pig skin after immersing it in an acetic acid solution; (b) extracting collagen by stirring the recovered collagen layer in an aqueous acetic acid solution to which a proteolytic enzyme is added, and pulverizing to recover a homogenized collagen extract; (c) recovering the collagen extract obtained by inactivating the enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract; (d) adding acetic acid to the collagen extract in which the enzyme has been inactivated, titrating the pH to 2.0 to 3.0, making collagen in a solution state, removing the precipitate (foreign matter) through centrifugation, and removing the supernatant containing collagen recovering; (e) filtration of the supernatant containing the collagen in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 ⁇ m, a second step with a pore size of 0.44 to 0.46 ⁇ m, and three steps with a pore
  • Another object of the present invention is to provide a collagen prepared by the above production method.
  • the present invention comprises the steps of: (a) recovering the collagen layer from which fat has been removed by swelling the pig skin after soaking it in an acetic acid solution; (b) extracting collagen by stirring the recovered collagen layer in an aqueous acetic acid solution to which a proteolytic enzyme is added, and pulverizing to recover a homogenized collagen extract; (c) recovering the collagen extract obtained by inactivating the enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract; (d) adding acetic acid to the collagen extract in which the enzyme has been inactivated, titrating the pH to 2.0 to 3.0, making collagen in a solution state, removing the precipitate through centrifugation, and recovering the supernatant containing collagen ; (e) filtration of the supernatant containing the collagen in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 ⁇ m, a second step with a pore size of 0.44 to 0.46 ⁇ m, and three steps with a pore size of
  • the buffer exchange in step (f) may be using a TFF system.
  • the buffer exchange in step (f) may be to exchange the acetic acid solvent with the citric acid solvent.
  • the enzyme of step (c) may be pepsin.
  • the strong acid in step (h) may be hydrochloric acid (HCl).
  • the present invention provides a collagen produced by the above production method.
  • the present invention uses acetic acid, which is a solvent that extracts the highest collagen yield, in contrast to the existing production method that uses a single solvent such as acetic acid or citric acid in the production method of collagen, and replaces it with citric acid with relatively little odor in the concentration step.
  • acetic acid which is a solvent that extracts the highest collagen yield
  • a high yield of collagen from which odors were removed was prepared by using a buffer exchange method, and the collagen produced by the method of the present invention improved chemical problems such as protein denaturation and purity degradation occurring in acid-treated collagen, As it has the effect of remarkably reducing the odor of the manufactured collagen, it is expected to be highly useful in various fields such as 3D printer raw materials, regenerative medical raw materials, and xeno-organ-related medical devices.
  • FIG. 1 shows a production process diagram of the collagen production process of the present invention.
  • 2 is a result showing the yield of collagen when different solvents were used in the first concentration process according to the manufacturing process of the present invention
  • M means a marker
  • 1 is when acetic acid is used as a solvent
  • 2 is acetic acid to citric acid
  • 3 shows the result when ascorbic acid is used as a solvent
  • 4 when hydrochloric acid is used as a solvent
  • 5 when phosphate is used as a solvent
  • 6 when citric acid is used as a solvent.
  • FIG 3 shows the collagen production yield results when different solvents are used in the first concentration process according to the production process of the present invention.
  • the buffer exchange method is better than extracting collagen using an organic acid such as acetic acid or citric acid as a single solvent.
  • the present invention was completed by confirming that when collagen was produced by exchanging the solvent by the method, it was possible to produce collagen having no off-flavor and remarkably high collagen yield compared to the existing collagen production method.
  • the present invention comprises the steps of: (a) recovering the collagen layer from which fat has been removed by swelling the pig skin after immersing it in an acetic acid solution; (b) extracting collagen by stirring the recovered collagen layer in an aqueous acetic acid solution to which a proteolytic enzyme is added, and pulverizing to recover a homogenized collagen extract; (c) recovering the collagen extract obtained by inactivating the enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract; (d) adding acetic acid to the collagen extract in which the enzyme has been inactivated, titrating the pH to 2.0 to 3.0, making collagen in a solution state, removing the precipitate through centrifugation, and recovering the supernatant containing collagen ; (e) filtration of the supernatant containing the collagen in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 ⁇ m, a second step with a pore size of 0.44 to 0.46 ⁇ m, and three steps with a pore size of 0.1 to 0.3
  • the sirloin pork skin is divided into a collagen layer, a pore layer and a fat layer from the outer skin, and this step is a process of recovering the collagen layer from which the pore layer and the fat layer have been removed by soaking the pig skin in an organic acid solution and then swelling it.
  • the organic acid solution used in the present invention may be any one selected from acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, phosphate, citric acid, and a mixture thereof, but is not limited thereto, and acetic acid is preferable.
  • the execution time is preferably 12 to 36 hours, and it is most preferable to leave it standing for 24 hours.
  • the collagen layer recovered in this step may be dried (denatured) if left at room temperature, it is preferable to put it in an organic acid aqueous solution and refrigerate it. can be completely removed by
  • This step is a process of extracting collagen by stirring the collagen layer in an organic acid aqueous solution to which a proteolytic enzyme is added, pulverizing and homogenizing to recover the homogenized collagen extract.
  • the proteolytic enzyme may be any one selected from conventionally protein-degrading enzymes, but pepsin is preferable.
  • the ratio of the organic acid aqueous solution and the collagen layer be about 100: 3, because homogenization may be difficult when the ratio of the collagen layer is increased.
  • the organic acid solution used may be any one selected from acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, phosphate, citric acid, and a mixture thereof, but is not limited thereto, and acetic acid is preferable.
  • This step is a process of recovering the collagen extract in which the enzyme is inactivated by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract.
  • this step it is preferable to titrate the pH to 5.5 to 8.5 using sodium hydroxide, and by inactivating the protease, the protease is not affected in the next step.
  • an organic acid is added to the collagen extract in which the enzyme has been inactivated, pH is titrated to 2.0 to 3.0, collagen in solution is made, and the precipitate is removed through centrifugation and the supernatant containing collagen is recovered. to be.
  • the precipitate means foreign substances, and the supernatant is a solution containing collagen.
  • the organic acid solution used may be any one selected from acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, phosphate, citric acid, and a mixture thereof, but is not limited thereto, and acetic acid is preferable.
  • the filtration of the supernatant is sequentially performed in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 ⁇ m, a second step with a pore size of 0.44 to 0.46 ⁇ m, and three steps of filtration with a pore size of 0.1 to 0.3 ⁇ m. It is a process of recovering the filtered collagen solution by performing filtration.
  • This step is a process of performing primary concentration with buffer exchange by applying negative pressure to the filtered collagen solution.
  • the first concentration process in this step can be performed using the TFF system, and the buffer exchange is a process of replacing the solvent extracted from the existing collagen with a new solvent in the concentration process.
  • Acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, phosphate, citric acid, and these It is possible to replace any one solvent selected from the mixed solution of the other solvent, but it is preferable to exchange acetic acid with citric acid.
  • the high yield of the existing solvent is maintained through the buffer exchange, and the new solvent has a significant effect on removing odors due to the replacement of the solvent.
  • This step is a process of secondary concentration by stirring the first concentrated concentrate using sodium hydroxide under pH 2-7 conditions to adjust the pH to 6.5-8.5, and gelatinization (gel).
  • this step a difference appears in the degree of gelatinization depending on the pH conditions.
  • the second concentrated solution by the step (g) is dehydrated through centrifugation and homogenized by putting it in a strong acid.
  • centrifugation is preferably performed three times to minimize moisture, and the supernatant separated through centrifugation is discarded and only the collagen pellet is placed in strong acid for homogenization.
  • the strong acid may be an acid having a pH of 3 or less, preferably hydrochloric acid.
  • Example 1 Collagen production method using buffer exchange method
  • This step is a step of recovering the collagen layer from which fat has been removed by swelling the pig skin.
  • the sirloin pork skin was cut to 3 cm in width and 20 cm in length, washed, and immersed in an acetic acid solution at pH 2.5 at 4° C. and allowed to react by standing at 4° C. refrigeration conditions for 24 hours. At this time, since the amount of acetic acid is absorbed and decreased as time passes, acetic acid was additionally added about every 8 hours. After 24 hours of reaction, the swelling of the sirloin pig skin was checked, and when the swelling was 2-3 times, it was determined that the swelling did not proceed any more, and the swelling process was stopped. After freezing the swollen pig skin, it was thawed at 15 to 25 ° C. for 10 minutes at room temperature, and pores and fat were removed using a knife and a cutting board to obtain a collagen layer pig skin. The completed collagen layer pig skin was stored in a cryogenic freezer.
  • This step is a step of extracting collagen from the collagen layer and recovering the homogenized collagen extract by pulverization.
  • Acetic acid was added to purified water to adjust the pH to 2.5, and refrigerated at 4°C.
  • 15 g of pepsin was put into a glass beaker containing 400 ml of aqueous acetic acid solution and completely dissolved.
  • 200 g of collagen layer pork skin stored in a cryogenic freezer was homogenized using a mixer while mixing with acetic acid stored in a refrigerator. At this time, 20L of acetic acid aqueous solution was used for 200 g of pig skin.
  • This step is a step of recovering the collagen extract obtained by inactivating the enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract.
  • the pH was adjusted to 7.0 ⁇ 1.5 by adding 10M sodium hydroxide to the refrigerated collagen extract, and after pH adjustment was completed, the enzyme was inactivated by stirring at 4° C. refrigeration conditions for 3 hours, and then the collagen extract was recovered.
  • This step is a step of recovering a supernatant containing collagen through centrifugation after adding acetic acid to the enzyme-inactivated collagen extract to adjust the pH to make collagen in a solution state.
  • acetic acid was added to adjust the pH to 2.5 ⁇ 0.5, and then, from the time when the pH adjustment was completed, stirring was performed under refrigeration conditions at 4° C. for complete dissolution.
  • the completely dissolved collagen solution was centrifuged for 1 hour at 15,000 RPM, pump speed 12 using a tubular centrifuge. Foreign substances coming out through the discharge pipe were removed, and the supernatant containing collagen was recovered.
  • the supernatant containing the collagen is filtered three times for each pore size to recover the filtered collagen solution.
  • a pore size 1.0 ⁇ m filter was coupled to the housing and then sterilized.
  • a T-pipe was connected to the solution inlet of the housing filter, and a sterilized Flex tube and a pressure gauge were connected.
  • a capsule filter with a pore size of 0.45 ⁇ m and a pressure gauge were connected to the T-pipe connected to the outlet.
  • the housing and the 0.2 ⁇ m pore size filter were combined and then sterilized. Connect the pore size 0.2 ⁇ m filter and pressure gauge to the T-pipe connected to the outlet.
  • the solution on which the secondary filtration process is completed is put into the flex tube, and the RPM value is input to the U.F pump and operated.
  • Filtration is carried out step by step in the order of 1.0 ⁇ m, 0.45 ⁇ m, and 0.2 ⁇ m, and after filtration is completed, an aqueous acetic acid solution corresponding to the amount contained in the housing is added to perform additional filtration to recover the filtered collagen solution.
  • This step is a step of performing primary concentration with buffer exchange by applying negative pressure to the filtered collagen solution.
  • the hose connected to the 0.2 ⁇ m housing filter outlet of step (e) was connected to the TFF system reservoir.
  • a vent filter is installed to prevent air pressure from being generated in the water tank.
  • the TFF system is operated to discard molecular weights below 100 kDa to the outlet, and molecular weights above 100 kDa are collected again into the water tank to perform circulation and concentration processes.
  • the acetic acid escapes through the vent and the liquid collagen is collected again in the water tank.
  • the citric acid supply line was connected to the water bath in the TFF system using a flex tube.
  • the pH is adjusted using sodium hydroxide in the first concentrate, and the second concentrate is recovered through a concentration process of gelatinization.
  • the solution after the first concentration was titrated to pH 7.5 ⁇ 1 using 10M NaOH on a clean bench.
  • the pH was divided into 2 to 7 sections and stirred for 10 minutes.
  • a pH reaction was induced in such a way that the reaction (gelation) was performed after titration stepwise and reacted after titration again.
  • stirring was performed for 1 hour.
  • the pH titration was completed, it was confirmed that the collagen was gelatinized, and the second concentrated solution was recovered by standing overnight at 4°C under refrigeration conditions.
  • This step is a step of dehydrating the second concentrate through centrifugation and homogenizing it by putting it in strong acid.
  • the concentrated solution was divided into equal weights in a sterilized centrifuge bottle on a clean bench.
  • the centrifuge was set to 6,000 RPM, 30 Min, and 4°C, and centrifugation was performed when the temperature reached 4°C. Centrifugation was performed a total of 3 times to minimize moisture.
  • Collagen pellets were separated using a centrifuge. The supernatant except for the separated pellet was discarded, and 1M HCl was added to 4% of the pellet obtained on a clean bench and dissolved with spatula. Dissolution proceeded while visually confirming that the pellet was completely dissolved, and then sealed and refrigerated at 4°C. The content of the final product was checked, and the finished product was subdivided and packaged under aseptic conditions.
  • Comparative Example 1 Collagen production method using acetic acid
  • the collagen content of the obtained products recovered from Example 1 and Comparative Examples 1 to 5 was measured and compared.
  • the collagen according to the present invention had almost no odor, but it was confirmed that the odor intensity was severe when acetic acid or hydrochloric acid was used. From the above results, when the buffer exchange method of the present invention is used, the odor reduction effect is remarkable, so it is directly used in the 3D printer raw material, regenerative medical raw material, xeno-organ-related medical device, food or cosmetic field without an additional process to remove the odor. availability has been confirmed.
  • the collagen produced by the production method of the present invention has the effect of improving the chemical problems of protein denaturation and lowering of purity that occur in acid-treated collagen, and has the effect of significantly reducing the odor of the produced collagen. It is expected to have high utility in various fields such as heterogeneous organ-related medical devices.

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Abstract

본 발명은 이취가 제거된 고수율의 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 버퍼 교환 방식을 이용하여 이취가 제거된 고수율의 콜라겐을 제조할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명은 콜라겐의 제조방법에 있어 초산 또는 구연산 등의 단일 용매를 사용하는 제조방법에 비해 제조방법의 중간과정에서 초산을 다른 유기산 용매로 교환하는 버퍼 교환 방식을 사용하여 이취가 제거된 높은 수율의 콜라겐을 제조하였으며, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 콜라겐은 산을 처리한 콜라겐에 발생되는 단백질 변성 및 순도 저하의 화학적 문제점을 개선하고, 제조된 콜라겐의 이취가 현저히 줄어드는 효능이 있어 3D 프린터 원료, 재생의료 원료, 이종장기 관련 의료기기 등 다양한 분야에서 활용도가 높을 것으로 기대된다.

Description

이취가 제거된 고수율 콜라겐의 제조 방법
본 발명은 이취가 제거된 고수율의 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 버퍼 교환 방식을 이용하여 이취가 제거된 고수율의 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이다.
콜라겐은 동물성 소재에서 유래된 섬유상의 구조 단백질로서 동물의 피부, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 혈관 기타 결합 조직에 풍부하게 존재하며, 체 단백질의 약 30% 이상을 차지한다. 콜라겐은 2중 나선구조를 하고 있는 근원 섬유 단백질과 달리 3중 나선구조의 형태로 존재하며, 트로포콜라겐(tropocollagen)을 기본단위로 한다. 구성 아미노산의 조성은 형태에 따라 다소 차이가 있으나, 일반적으로 글리세린, 프롤린 및 하이드록시프롤린이 주를 이룬다.
콜라겐의 구성비는 생체의 연령 변화에 따라 변화하는데, 연령이 증가함에 따라 콜라겐의 함량이 감소한다. 고령화에 따른 콜라겐 감소는 세포의 신진대사인 수분대사 조절에 영향을 주어 노화의 진행이 빨라지고, 각 조직 중의 수분함량을 감소시켜 결합조직의 원활함과 피부의 탄력도 없어진다. 그에 따라, 현대에는 콜라겐을 인체에 보충하여 피부 노화를 방지하고 주름을 방지하는 다양한 제품들이 출시되고 있다.
특히, 콜라겐은 겔 형성, 보수성 및 유화 안정성 등의 기능적 특성을 지니고 있어 기능성 식품소재로서도 중요하게 인식되고 있다.
위와 같은 배경하에, 대량으로 산업적으로 적합한 콜라겐을 생산하고자 다양한 콜라겐 추출방법이 연구 중에 있지만, 그 연구 결과가 미비한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2009-0105984호에서는, 눈다랑어 껍질에 아세트산을 처리하여 콜라겐을 추출하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 기존의 콜라겐 추출 방법은 수율이 낮아 의료기기, 화장품 등을 생산하는 산업에서 활용이 어렵고 원료수급을 위한 비용이 극단적으로 지출될 수 있으며, 콜라겐을 고수율로 제조하기 위한 용매로서 약산을 사용할 경우 이취가 심하게 발생하는 문제점이 있다.
예컨대, 용매로 약산을 사용하여 제조된 콜라겐을 의료용 실 제품 등의 의료기기로 제조하는 경우, 제조업체에서 이취로 인한 리스크가 지속적으로 발생하는 단점이 있으며, 해당 의료기기를 병원에서 사용함에 있어 의사가 환자들에게 일일이 강한 취의 발생에 대해 설명해야 하는 어려움이 있다.
특히 초산을 용매로 콜라겐을 제조하는 경우 높은 콜라겐 수율을 나타내지만 악취로 인해 제품화하는데 어려움이 많아 이를 해결하기 위한 연구가 필요한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 초산 또는 구연산 등의 단일 용매를 사용하여 콜라겐을 제조하는 기존방법에 비해 중간과정에서 초산을 다른 유기산 용매로 교환하는 버퍼 교환 방식을 사용하는 경우 높은 수율은 유지하면서 이취는 제거된 콜라겐이 제조됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 (a) 돈피를 초산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계; (b) 상기 회수된 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 초산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (c) 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (d) 상기 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액 상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물(이물)을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계; (e) 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별로 단계적으로 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계; (f) 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼 교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계; (g) 상기 1차 농축한 농축액을 수산화나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축액을 회수하는 단계; 및 (h) 상기 2차 농축액을 원심분리하여 탈수(농축)시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공하여 이취를 제거하고, 기존의 콜라겐 소재가 가지고 있는 문제점을 개선해 의료기기의 적용 폭을 넓히는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 콜라겐을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 돈피를 초산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계; (b) 상기 회수된 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 초산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (c) 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (d) 상기 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액 상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계; (e) 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계; (f) 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼 교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계; (g) 상기 1차 농축한 농축액을 수산화나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축액을 회수하는 단계; 및 (h) 상기 2차 농축액을 원심분리하여 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 단계 (f)에서 버퍼 교환은 TFF 시스템을 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (f)에서 버퍼 교환은 초산 용매를 구연산 용매로 교환하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (c)의 효소는 펩신일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (h)의 강산은 염산(HCl)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 콜라겐을 제공한다.
본 발명은 콜라겐의 제조방법에 있어 초산 또는 구연산 등의 단일 용매를 사용하는 기존 제조방법과 달리, 콜라겐 수율이 가장 높게 추출되는 용매인 초산을 사용하면서 농축단계에서 상대적으로 이취가 적은 구연산으로 대체하는 버퍼 교환 방식을 사용하여 이취가 제거된 높은 수율의 콜라겐을 제조하였고, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 콜라겐은 산을 처리한 콜라겐에 발생되는 단백질 변성 및 순도 저하 등의 화학적 문제점을 개선하였으며, 제조된 콜라겐의 이취가 현저히 줄어드는 효능이 있어 3D 프린터 원료, 재생의료 원료, 이종장기 관련 의료기기 등 다양한 분야에서 활용도가 높을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 콜라겐 제조공정의 생산공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 제조공정에 따른 제 1 농축과정에서 용매를 각기 다르게 하였을 때 콜라겐의 수율을 나타낸 결과로써, M은 마커를 의미하며, 1은 초산을 용매로 사용한 경우, 2는 초산에서 구연산으로 버퍼를 교환한 경우, 3은 아스코르브산을 용매로 사용한 경우, 4는 염산을 용매로 사용한 경우, 5는 인산염을 용매로 사용한 경우, 6은 구연산을 용매로 사용한 경우의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 제조공정에 따른 제 1 농축과정에서 각기 다른 용매를 사용했을 때의 콜라겐 제조 수율 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 초산의 이취를 제거하면서 고수율로 콜라겐을 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력하였고, 그 결과 초산 또는 구연산 등의 유기산을 단일 용매로 사용하여 콜라겐을 추출하는 것보다 버퍼 교환 방식에 의해 용매를 교환하여 콜라겐을 제조하는 경우에 기존 콜라겐 제조방법에 비해 이취가 없고 콜라겐 수득율이 현저히 높은 콜라겐을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 본 발명은 (a) 돈피를 초산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계; (b) 상기 회수된 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 초산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (c) 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (d) 상기 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액 상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계; (e) 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계; (f) 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계; (g) 상기 1차 농축한 농축액을 수산화나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축액을 회수하는 단계; 및 (h) 상기 2차 농축액을 원심분리하여 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 콜라겐 제조방법에 대해 각 단계별로 세분화해서 구체적으로 설명하기로 한다.
<(a) 단계 : 콜라겐 층 회수 단계>
등심돈피는 외피로부터 콜라겐층, 모공층 및 지방층으로 구분되며, 본 단계는 돈피를 유기산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 콜라겐 층을 제외한 모공층 및 지방층이 제거된 콜라겐층을 회수하는 과정이다.
본 발명에서 사용하는 유기산 용액은 초산, 아스코르브산, 염산, 인산염, 구연산 및 이들의 혼합용액 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 초산인 것이 바람직하다.
본 단계의 수행조건은 단백질(콜라겐)의 변성을 막기 위해 4℃의 냉장조건으로 수행하는 것이 바람직하며, 수행시간은 12~36시간인 것이 바람직하며, 24시간 정치시키는 것이 가장 바람직하다.
본 단계에서 회수된 콜라겐 층은 상온에 방치하면 건조(변성)될 수 있으므로, 유기산 수용액에 넣어 냉장보관하는 것이 바람직하며, 유기산 수용액에 넣어 보관하는 중에 관찰되는 제거되지 않은 지방층 및 모공층은 추가적인 작업을 통해 완전히 제거 할 수 있다.
< (b) 단계 : 추출 및 균질화 단계 >
본 단계는 상기 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 유기산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화시켜 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 과정이다.
본 단계에서 단백질 분해 효소는 통상적으로 단백질을 분해하는 효소에서 선택된 어떤 것도 사용할 수 있으나 펩신인 것이 바람직하다.
본 단계에서 추출된 콜라겐을 분쇄 및 균질화하는 과정은 콜라겐 층의 비율이 높아질 경우 균질화에 어려움이 발생 할 수 있기 때문에, 유기산 수용액과 콜라겐 층의 비율은 100 : 3 정도인 것이 바람직하다.
이때, 사용하는 유기산 용액은 초산, 아스코르브산, 염산, 인산염, 구연산 및 이들의 혼합용액 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 초산인 것이 바람직하다.
< (c) 단계 : 단백질 분해효소 불활성화 단계 >
본 단계는 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 과정이다.
본 단계에서 수산화나트륨을 이용하여 pH를 5.5~8.5로 적정하는 것이 바람직하며, 단백질 분해효소를 불활성화시킴으로써 다음 단계에서 단백질 분해효소가 영향을 미치지 않도록 한 것이다.
< (d) 단계 : 콜라겐 함유 상등액 제조 단계 >
본 단계는 상기 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액에 유기산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액 상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 과정이다. 이때, 침전물을 이물질을 의미하고, 상등액은 콜라겐이 함유된 용액이다.
이때, 사용하는 유기산 용액은 초산, 아스코르브산, 염산, 인산염, 구연산 및 이들의 혼합용액 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 초산인 것이 바람직하다.
본 단계에서는 콜라겐이 용액 상태로 회수되는데, 원심분리를 통해 침전물을 버리고 상등액을 회수함으로써, 콜라겐이 함유된 용액을 수득할 수 있다. 본 단계를 통해 여과 및 정제과정의 효율을 상승시킬 수 있다.
< (e) 단계 : 여과 단계 >
본 단계는 상기 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별 세 번의 여과를 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 과정이다.
이때, 포어사이즈별 3단계의 여과 과정을 통해, 콜라겐의 보이지 않는 이물과 병원체를 제거하고, 안정성을 높일 수 있다.
< (f) 단계 : 1차 농축 단계 >
본 단계는 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼 교환과 함께 1차 농축을 수행하는 과정이다.
본 단계의 1차 농축 과정은 TFF 시스템을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 버퍼 교환은 농축과정에서 기존 콜라겐을 추출한 용매를 새로운 용매로 치환하는 과정으로 초산, 아스코르브산, 염산, 인산염, 구연산 및 이들의 혼합용액 중 선택되는 어느 하나의 용매를 다른 하나의 용매로 치환 할 수 있으나, 초산을 구연산으로 교환하는 것이 바람직하다.
본 단계에서 버퍼 교환을 통해 기존 용매가 갖는 고수율은 유지하고, 새로운 용매의 치환으로 인한 이취 제거에 현저한 효과를 나타낸다.
< (g) 단계 : 2차 농축 단계 >
본 단계는 상기 1차 농축한 농축액을 수산화나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축하는 과정이다.
본 단계에서 pH 조건에 의해 젤라틴화 정도에 차이가 나타나며, 본 단계에서 수행시간은 30~2시간 동안 교반하는 것이 바람직하나, 젤라틴화(반응)를 최대한으로 유도하기 위해 2시간 이상으로 장시간 교반을 진행할 수 있다.
< (h) 단계 : 탈수 및 균질화 단계 >
본 단계는 상기 단계 (g) 후, 상기 단계 (g)에 의해 2차 농축된 농축액을 원심분리를 통해 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 과정이다.
본 단계에서 원심분리는 수분을 최소화하기 위해 3회 진행하는 것이 바람직하며 원심분리를 통해 분리된 상층액은 폐기하고 콜라겐 펠렛만을 강산에 넣어 균질화를 진행한다.
본 단계에서 강산은 pH 3 이하인 산을 이용할 수 있으며, 염산인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1 : 버퍼 교환 방식을 이용한 콜라겐 제조방법
<(a) 단계 : 콜라겐 층 회수 단계>
본 단계는 돈피를 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계이다. 등심돈피를 가로 3cm, 세로 20cm로 재단하여 세척한 후 pH 2.5의 4℃ 초산 용액에 침적시켜 4℃ 냉장조건으로 24시간 정치하여 반응시켰다. 이때, 시간이 경과할수록 초산의 양은 등심돈피로 흡수되어 감소하므로 약 8시간마다 초산을 추가로 첨가하였다. 24시간 반응을 진행 후, 등심돈피의 팽윤여부를 확인하고, 2~3배 팽윤이 되었을 경우 더 이상 팽윤이 진행되지 않는다고 판단하여, 팽윤 과정을 중단하였다. 팽윤된 돈피를 동결보관 한 후, 15~25℃ 상온에서 10분간 해동시키고 칼과 도마를 이용하여 모공 및 지방을 제거하고 콜라겐층의 돈피를 수득하였다. 작업이 완료된 콜라겐 층 돈피는 초저온 냉동고에 보관하였다.
< (b) 단계 : 추출 및 균질화 단계 >
본 단계는 상기 콜라겐층에서 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계이다. 정제수에 초산을 첨가하여 pH를 2.5로 조절하고, 4℃에서 냉장보관 하였다. 분쇄 전, 초산 수용액 400ml를 담은 유리 비커에 펩신 15g을 넣고 완전히 용해하였다. 초저온 냉동고에 보관중인 콜라겐 층 돈피 200g을 냉장 보관하였던 초산과 혼합하면서 믹서를 이용해 균질화시켰다. 이때, 돈피 200g에 초산 수용액 20L를 사용하였다. 균질화 과정 이후, 상기 돈피 25~30g당 500ml의 초산 수용액을 이용하여 분쇄를 진행하였다. 육안으로 분쇄되지 않은 돈피가 없을 때까지 분쇄하고 분쇄액을 수득하였다. 미리 용해한 펩신을 수득한 분쇄액에 넣고, 교반기에서 4℃, 250 RPM으로 24시간동안 추출(반응)시켜 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하였다.
< (c) 단계 : 단백질 분해효소 불활성화 단계 >
본 단계는 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계이다. 상기 냉장보관된 콜라겐 추출액에 10M 수산화나트륨을 첨가를 통해 pH를 7.0±1.5로 조정하고, pH 조정이 완료된 후 3시간 동안 4℃ 냉장조건으로 교반을 진행하여 효소를 불활성화시킨 후, 콜라겐 추출액을 회수하였다.
< (d) 단계 : 콜라겐 함유 상등액 제조 단계 >
본 단계는 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 조절하여 용액 상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계이다. 효소 불활성화 완료 후, 초산을 첨가하여 pH를 2.5±0.5로 조정한 후 pH 조정이 완료된 시점으로부터 3시간 동안 4℃의 냉장조건으로 교반을 진행하여 완전 용해 시켰다. 완전히 용해된 콜라겐 용액을 Tubular 원심분리기를 이용하여 15,000 RPM, 펌프 스피드 12에서 1시간 동안 원심분리하였다. 배출관을 통해 나오는 이물을 제거하고, 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하였다.
< (e) 단계 : 여과 단계 >
본 단계는 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈별로 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계이다. 1차 여과를 위해 하우징(Housing)에 포어 사이즈 1.0㎛ 필터를 결합 후 멸균하였다. 하우징 필터의 용액 투입구에 T자 배관을 연결하고 멸균된 플렉스 튜브(Flex tube)와 압력 게이지를 연결하였다. 2차 여과를 위해 배출구에 연결된 T자 배관에 포어사이즈 0.45㎛ 캡슐 필터(Capsule Filter)와 압력게이지를 결합하였다. 3차 제균 여과를 위해 하우징과 포어 사이즈 0.2㎛ 필터를 결합 후 멸균하였다. 배출구에 연결된 T자 배관에 포어사이즈 0.2㎛ 필터와 압력게이지를 연결한다. 2차 여과 공정이 완료된 용액은 플렉스 튜브에 투입하고 U.F 펌프에 RPM 값을 입력하고 가동시킨다. 1.0㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 순으로 단계적으로 여과가 진행되며 여과가 완료된 후 하우징안에 들어있는 양 만큼의 초산 수용액을 투입하여 여과를 추가로 진행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하였다.
< (f) 단계 : 1차 농축 단계 >
본 단계는 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼 교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계이다.
상기 단계 (e)의 0.2㎛ 하우징 필터 배출구에 연결되어 있는 호스를 TFF 시스템 수조(Reservior)에 연결하였다. 이때 수조에 공기압이 생기지 않도록 벤트 필터(vent filter)를 장착한다. 제균 여과가 완료된 용액이 수조에 투입되는지 확인하고, 수조에 4~5L가 채워지면 TFF 시스템을 가동하여 100kDa 이하인 분자량은 배출구로 버리고, 100kDa 이상인 분자량은 다시 수조로 모아서 순환 및 농축 공정을 진행한다. 1차 농축과정에서 초산은 벤트를 통해 빠져나가고 액상콜라겐은 수조에 다시 모아진다. 이때, 플렉스 튜브를 이용해 TFF 시스템에 구연산 공급라인을 수조와 연결하였다. 상기 연결을 통해TFF 시스템이 음압일 경우 구연산에서 수조에서 용매를 가져오도록 하였다. 농축이 진행되는 동안 벤트로 빠져나간 초산만큼 구연산을 공급라인을 통해 빨아들여 버퍼 교환이 발생하였다. 이때 초산이 감소되는 비율은 50%, 25%, 12.5%, 6.2%, 3.1%, 1.55%, 0.77%, 0.4%, 0.2%, 0.1%이며, 초산의 감소를 염두해 500ml로 10회 총 5L의 초산과 5L 동량의 구연산의 버퍼 교환을 진행하였다.
TFF 수조에서 구연산으로 버퍼 교환이 이루어지며 이취가 상당히 제거된 것을 확인하였다. 이취를 더 제거하기 위해서는 동량의 버퍼 교환 작업을 추가하여 2회 연속(총 10L)으로 농축단계를 진행하는 방식을 수행할 수 있다. 6배 농축을 통해 최종 농축량이 3~3.3L가 될 때까지 농축을 진행하여 1차 농축액을 회수하였다.
< (g) 단계 : 2차 농축 단계 >
본 단계는 상기 1차 농축액에 수산화나트륨을 이용하여 pH를 적정하고, 젤라틴화시키는 농축과정을 통해 2차 농축액을 회수하는 단계이다. 1차 농축이 완료된 용액을 클린벤치에서 10M의 NaOH를 사용하여 pH 7.5±1로 적정하였다. 이때, 적정을 위해서 pH를 2 내지 7의 구간으로 나눠 10분간 교반을 진행하였다. pH 구간별로 젤라틴화되는 정도에 차이가 발생하며 콜라겐에 특성상 pH 4 내지 7에서 응집이 발생되나, 세부적인 조정이 어렵기 때문에 pH 4, pH 5, pH 6 및 pH 7 등의 4개 구간으로 나눠 단계적으로 적정 후 반응(겔화)시키고 다시 적정 후 반응시키는 방식으로 pH 반응을 유도하였다. pH 적정이 완료된 후 1시간 동안 교반을 진행하였다. pH 적정이 완료된 후, 콜라겐이 젤라틴화 된 것을 확인한 후 4℃ 냉장조건에서 밤새도록 정치시켜 2차 농축액을 회수하였다.
< (h) 단계 : 탈수 및 균질화 단계 >
본 단계는 상기 2차 농축액을 원심분리를 통해 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계이다. 클린벤치에서 멸균된 원심분리기 병에 농축공정이 완료된 용액을 같은무게로 소분하였다. 원심분리기를 6,000 RPM, 30 Min, 4℃로 설정하고 온도가 4℃가 되면 원심분리를 진행하였다. 수분을 최소화하기 위해 원심분리를 총 3회 진행하였다. 원심분리기를 이용하여 콜라겐 펠렛(collagen pellet)을 분리하였다. 분리된 펠렛을 제외한 상층액은 폐기하고, 클린벤치에서 수득된 펠렛 4%의 양에 1M의 HCl을 넣고 spatula로 용해하였다. 펠렛이 완전 용해될 때까지 육안으로 확인하면서 용해를 진행하였고, 이후 밀봉하여 4℃에서 냉장보관하였다. 최종 제품의 함량을 확인하고, 완제품을 무균상태에서 소분하여 포장하였다.
비교예 1 : 초산을 이용한 콜라겐 제조방법
상기 실시예 1과 동일하게 하되, 상기 <(f) 단계 : 1차 농축 단계>에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다.
비교예 2 : 아스코르브산을 이용한 콜라겐 제조방법
상기 실시예 1과 동일하게 하되, (a) 단계 내지 (h) 단계에 사용된 유기산을 초산에 비해 이취가 적은 아스코르브산으로 하고 상기 <(f) 단계 : 1차 농축 단계>에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다.
비교예 3 : 염산을 이용한 콜라겐 제조방법
상기 실시예 1과 동일하게 하되, (a) 단계 내지 (h) 단계에 사용된 유기산을 초산이 아닌 염산으로 하고 상기 <(f) 단계 : 1차 농축 단계>에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다.
비교예 4 : 인산염을 이용한 콜라겐 제조방법
상기 실시예 1과 동일하게 하되, (a) 단계 내지 (h) 단계에 사용된 유기산을 초산에 비해 이취가 적은 인산염으로 하고 상기 <(f) 단계 : 1차 농축 단계>에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다.
비교예 5 : 구연산을 이용한 콜라겐 제조방법
상기 실시예 1과 동일하게 하되, (a) 단계 및 (h) 단계에 사용된 유기산을 초산에 비해 이취가 적은 구연산으로 하고 상기 <(f) 단계 : 1차 농축 단계>에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다.
실험예 1 : 콜라겐 수율 측정
상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 비교예 5로부터 회수한 수득물의 콜라겐 함량을 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 초산을 용매로 사용한 경우에 가장 높은 콜라겐 수율을 나타냈으며, 초산을 100%로 가정하였을 때, 초산에서 구연산으로 버퍼를 교환한 경우에 97.8%의 수율을, 아스코르브산을 용매로 사용한 경우 87.4%의 수율을 구연산을 용매로 사용한 경우 81.8%의 수율을, 인산염을 용매로 사용한 경우 79.1% 수율을, 염산을 용매로 사용한 경우 44.4%의 상대적인 수율을 확인하였다.
상기 결과로부터 구연산, 아스코르브산 등 단일 용매를 이용하여 콜라겐을 제조한 경우에 비해 초산에서 구연산으로 버퍼를 교환하는 방식을 이용하여 콜라겐을 제조하였을 때, 우수한 제조 수율을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 2 : 악취평가
상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 비교예 5로부터 제조된 콜라겐에서 발생하는 냄새를 평가하기 위하여 1L 용량의 봉지에 각 실시예 또는 비교예에서 제조된 콜라겐을 10ml 넣고, 패널 10명을 대상으로 하기 [표 1]에 나타난 바와 같은 기준으로 악취를 평가하고, 이의 평균값을 나타냈다.
구분 악취강도
1 무취
2 겨우 감지 가능한 냄새
3 어떤 냄새인지 알 수 있는 가벼운 냄새
4 가볍게 감지할 수 있는 냄새
5 강한 냄새
6 강렬한 냄새
상기와 같은 기준으로 악취를 평가한 결과를 하기 [표 2]에 나타냈다.
구분 초산 버퍼교환(초산->구연산) 아스코르브산 염산 인산염 구연산
악취강도 5 2 3 6 2 2
상기 실험예 2에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 콜라겐의 경우 악취가 거의 없었지만, 초산 또는 염산을 사용한 경우 악취 강도가 심한 것이 확인되었다. 상기 결과로부터 본 발명의 버퍼 교환 방식을 사용하는 경우에 악취 감소 효과가 현저하여 추가적인 공정으로 냄새를 제거하는 과정 없이 3D 프린터 원료, 재생의료 원료, 이종장기 관련 의료기기, 식품 또는 화장품 분야에서 직접적으로 사용 가능함이 확인되었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 콜라겐은 산을 처리한 콜라겐에 발생되는 단백질 변성 및 순도 저하의 화학적 문제점을 개선하고, 제조된 콜라겐의 이취가 현저히 줄어드는 효능이 있어 3D 프린터 원료, 재생의료 원료, 이종장기 관련 의료기기 등 다양한 분야에서 활용도가 높을 것으로 기대된다.

Claims (6)

  1. (a) 돈피를 초산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계;
    (b) 상기 회수된 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 초산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계;
    (c) 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계;
    (d) 상기 효소를 불활성화시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액 상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계;
    (e) 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계;
    (f) 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계;
    (g) 상기 1차 농축한 농축액을 수산화나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축액을 회수하는 단계; 및
    (h) 상기 2차 농축액을 원심분리하여 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (f)에서 버퍼 교환은 TFF 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하는, 콜라겐의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (f)에서 버퍼 교환은 초산 용매를 구연산 용매로 교환하는 것을 특징으로 하는, 콜라겐의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 효소는 펩신인 것을 특징으로 하는, 콜라겐의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (h)의 강산은 염산(HCl)인 것을 특징으로 하는, 콜라겐의 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 콜라겐.
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