KR100577075B1 - 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산정제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산의 정제방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 히아루론산을 포함하는 추출물 또는 배양액 등을 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하므로써 지질 및 핵산과 단백질을 효과적으로 제거하는 것을 특징으로 하는 히아루론산 정제방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 유독한 유기물질의 사용을 배제하고, 부수적인 공정을 단축하므로써, 보다 효과적으로 히아루론산을 정제할 수 있다.
칼슘염, 인산염, 인산칼슘염, 히아루론산, 정제

Description

칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산 정제방법{METHOD FOR PURIFYING HYALURONIC ACID USING CALCIUM SALT AND PHOSPHATE SALT, OR CALCIUM PHOSPHATE SALT}
본 발명은 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산의 정제방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 히아루론산을 포함하는 추출물 또는 배양액 등을 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하므로써 지질 및 핵산과 단백질을 효과적으로 제거하는 것을 특징으로 하는 히아루론산 정제방법에 관한 것이다.
히아루론산(hyaluronic acid)은 생체 내 존재하는 글리코스아미노글리칸의 일종인 산성 뮤코다당류로서, D-글루콘산과 N-아세틸글루코스아민의 동일 반복 분자구조를 가지는 분자량 1,000Da~10kDa의 범위의 다당류이고, 매우 높은 점성과 탄성을 지닌다.
이러한 히아루론산은 신체의 모든 부위에 존재하며, 신체의 각 부위에서 여러 가지 특성을 보여주는 물질이다. 몸의 움직임을 원활하게 하는 윤활작용, 생리 활성 물질들의 이동을 주관하며 세포와의 특이한 작용에 의해 세포의 분화 및 성장 을 유도하는 중개자 역할, 세포외 기질에서는 콜라겐, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 등의 조직을 지탱하게 하는 단백질과 당 단백질들의 지지체 역할을 하며, 수분함유능력이 뛰어나고 점성과 탄성이 좋은 생체 고분자이다. 이러한 특성들로 인해, 히아루론산은 노령화에 따른 퇴행성 관절염의 치료 및 통증완화 치료제로서 사용되고, 안과 수술시 수술 보조재 및 안구 건조증 약물의 주성분으로 사용되기도 하며, 또한 주름 및 함몰된 피부조직의 보완에도 사용되는 등 성형보조재료로서도 각광을 받고 있다.
현재 의료용으로, 특히 안과용으로 사용되는 히아루론산은, 환산한 건조물에 대하여 90% 이상이 정량적으로 함유되고, 그 평균분자량은 1.9×106~3.9×106g/몰이며, 평균중합도(n)는 4,700~9,600이다. 관절염 주사제의 용도로는 현재 여러가지 분자량 분포를 가지는 제품들이 시판되고 있다. 의료용 히아루론산은 주사제용 약품으로 사용되고 있으므로, 단백질 및 다른 산성뮤코다당류(예를 들면, 콘드로이틴 황산, 헤파란 황산, 더마탄 황산 등)의 포함이 허용되지 않을 정도의 정제도가 요구되는 등 안전성의 규제가 상당히 엄격하다.
표 1은 식약청 고시에 따른 의료용(안과용) 히아루론산의 기준을 나타낸다.
[표 1] 의료용 히아루론산 기준(안과용) - 식약청 고시
항목 시험법 기준
함량 카르바졸 시험법 (Anal. Biochem. 4, 330 (1962)) > 90%
단백질 로우리법(Lowry's method) < 0.02%
핵산 260nm 파장에서의 흡광도 불검출(N.D.)
다른 산성 뮤코다당류 전기영동법 (일본 생화학회지38, 479 (1966)) 불검출(N.D.)
점도 극한점도 30~55dL/g
의료용 히아루론산은 동물성 조직에서 추출하거나, 미생물을 발효시켜 그 산 물을 회수하는 방법으로 얻을 수 있으며, 동물성 조직으로부터 추출한 히아루론산의 효과가 보다 우수한 것으로 알려져 있다(Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 13, 183-192, (1999)). 따라서, 동물성 조직, 특히 닭 벼슬로부터 히아루론산을 분리 및 정제하는 방법이 다수 개시되어 있다.
미국특허 제4,141,973호에는 클로로포름을 사용하여 수차례 이상의 추출을 통한 닭 벼슬로부터의 히아루론산의 분리 및 정제방법이 개시되어 있다.
또한, 유럽특허 제 01238572호에는 한외 여과막을 사용하여 닭 벼슬로부터 분자량 크기에 의해 저분자의 히아루론산을 분리 및 정제하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 국제특허 WO9200861호에는, 닭 벼슬로부터의 추출물을 단백질 분해효소로 처리하고, 이를 사급 암모늄염 내로 전환시키고, 유기용매를 사용하여 암모늄염을 제거한 다음 이온교환수지(Dowex)를 사용하여 분급물을 획득하고, 그 후 염화세틸피리디늄(cetylpyridinium chloride)으로 침전시켜 얻어진 히아루론산 분급물에 수용성 유기용매를 첨가하여 침전시키므로써 히아루론산을 얻는 방법이 개시되어 있다.
또한, 대한민국공개특허 제1987-0008904호에는, 닭 벼슬로부터의 추출물을 단백질 분해효소로 처리하고, 부탄올등의 유기용매를 사용하여 지질 및 단백질을 제거한 다음, 염화세틸피리디늄으로 살균 및 침전을 병행하여 분급물을 획득하고, 수용성 유기용매를 첨가하여 침전시키므로써 히아루론산을 얻는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 상기에 열거한 종래의 방법들은, 공정이 매우 복잡하고 수율이 낮아 대량생산에는 적합하지 않고, 유기용매의 사용으로 인한 정제 및 폐수처리 비용이 막대하며, 또한, 다단계 공정으로 이루어짐에 따라 공정시간이 길어져서 공정중 히아루론산의 자가분해가 발생할 수 있는 문제점이 있다. 또한, 유독성 유기용매를 사용하는 것은 의료용 물질의 생산에는 적합하지 않다는 문제점도 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 유독한 유기물질의 사용을 배제하고, 부수적인 공정을 단축하므로써, 보다 효과적으로 히아루론산을 정제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, (1) 히아루론산 함유 천연물을 단백질 분해효소로 처리하여 얻어지거나 또는 미생물로부터 유래된 히아루론산 함유 배양액으로부터 얻어지는 히아루론산 조추출물을 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하는 단계, 및 (2) 상기 (1)단계의 처리 결과물을 여과한 후, 이로부터 히아루론산을 침전시켜 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 히아루론산의 정제방법이 제공된다.
본 발명의 히아루론산의 정제방법에 있어서, 상기 (1)단계에서 얻어지는 히아루론산 조추출물은, 히아루론산 함유 천연물을 단백질 분해효소로 처리하여 얻거나, 또는 히아루론산을 생산할 수 있는 미생물로부터 생산된 히아루론산을 함유하는 해당 미생물의 배양액으로부터 얻는다. 상기 히아루론산 함유 천연물로는 본 발명에 의해 히아루론산을 정제하여 얻을 수 있는 천연물이라면 특별한 제한이 없으 며, 주로 닭의 벼슬이 사용된다. 또한, 처리조건에 있어서, 단백질 분해효소로의 처리가 가능한 조건이라면 특별한 제한이 없으며, 공지의 단백질 분해효소 처리 방법이 사용 가능하다. 또한, 상기 히아루론산을 생산할 수 있는 미생물로는, 공지의 히아루론산 생산용 미생물이 사용가능하며, 이로부터 공지의 방법을 통해 얻어지는 히아루론산 함유 미생물 배양액이라면 본 발명의 정제방법에서 제한없이 사용가능하다. 이하에서 바람직한 일 구체예를 통하여 상기 히아루론산 함유 천연물을 단백질 분해효소로 처리하여 히아루론산 조추출물을 얻는 과정을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, 히아루론산 함유 천연물을 단백질 분해효소로 처리하여 히아루론산 조추출물을 얻기 위해서는, 먼저 히아루론산 함유 천연물로서 닭벼슬을 잘게 분쇄하고, 에탄올로 깨끗하게 세척한다. 다음으로, 세척된 닭벼슬에 적정량의 증류수를 첨가하고, 단백질 분해효소를 넣어 교반한 후 30~60℃의 온도에서 3~72시간 방치한다. 방치의 결과로 층분리가 일어나는데, 분리되는 상층의 지질층은 버리고, 하층의 추출액만 취하여 여과한다. 여과 후 얻어진 추출액은 30~60℃의 온도로 가열하고, 단백질 분해효소를 첨가하여 3~24시간동안 2차로 처리한다. 2차 처리한 추출액을 여과하므로써 히아루론산 추출액을 얻는다. 이 추출액은 그대로 상기 (1)단계에서의 히아루론산 조추출물로서 사용 가능하나, 바람직하게는, 염화나트륨(NaCl)의 농도가 0.3~1M이 되도록 염화나트륨(NaCl)을 정량하여 얻어진 히아루론산 추출액에 첨가하고, 95% 에탄올 중에서 침전시킨 후, 이를 여과하여 얻어진 히아루론산 침전물을 동결건조 또는 감압하므로써 얻어지는 히 아루론산 분말을 히아루론산 조추출물로서 사용한다. 이렇게 하여 얻어진 히아루론산 분말은 증류수에 용해하여 적정 농도의 히아루론산 수용액으로 제조되어 사용된다.
본 발명의 히아루론산의 정제방법에 있어서, 상기 (1)단계에서는 히아루론산 조추출물을 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하므로써 조추출물 내에 포함된 지질 및 핵산과 단백질을 제거한다. 또한, 상기 (1)단계에서는 4~90℃의 온도 범위에서 히아루론산 조추출물을 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하는 것이 바람직하다.
상기 (1)단계에 있어서, 칼슘염으로는 Ca(OH)2, CaCO3, Ca(NO3)2·4H 2O, Ca(CH3COO)2·H2O, CaCl2 및 CaSO4·2H2O로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 칼슘염 화합물이 사용가능하고, 인산염으로는 H3PO4, (NH4)2HPO 4, H4P2O7, NaH2PO4 및 KH2PO4로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 인산염 화합물이 사용가능하나, 상기의 물질들로 제한되는 것은 아니다. 이 때 상기 칼슘염 화합물과 인산염 화합물의 사용비는 Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 사용하는 것이 히아루론산의 정제효율 측면에서 바람직하다.
또한, 상기 (1)단계에 있어서, 인산칼슘염으로는 하기의 표 2에 나타낸 화합물들로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 인산칼슘염 화합물이 사용가능하다.
[표 2]
화학식 명칭 약칭
Ca4(PO4)2 테트라칼슘 포스페이트(힐겐스토카이트) TeCP(TTCP)
Ca10(PO4)6(OH)2 히드록시아파타이트 HA(HAp)
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x·nH2O[0<x≤1, 0<n≤2] 비화학양론적 히드록시아파타이트 HA(HAp)
Ca3(PO4)2·nH2O [n=3~4.5] 비정형 칼슘 포스페이트 ACP
Ca3(PO4)2 트리칼슘 포스페이트(α,β 휘트로카이트) TCP
Ca8H2(PO4)6·5H2O 옥타칼슘 포스페이트 OCP
CaHPO4·2H2O 디칼슘 포스페이트 이수화물(부르사이트) DCPD
CaHPO4 디칼슘 포스페이트 무수화물(모네타이트) DCPA
Ca2P2O7 칼슘 피로포스페이트 CPP
Ca2P2O7·2H2O 칼슘 피로포스페이트 이수화물 CPPD
Ca7(P5O16)2 헵타칼슘 포스페이트(트로멜라이트) HCP
Ca4H2P6O20 테트라칼슘 이수소 포스페이트 TDCP
Ca(H2PO4)2·H2O 모노칼슘 포스페이트 일수화물 MCPM
Ca(PO3)2 칼슘 메타포스페이트 CMP
상기 (1)단계에 있어서, 히아루론산 조추출물은 수용액의 형태로 처리되고, 상기 인산염 및 칼슘염, 또는 인산칼슘염은 수용액으로서 상기 히아루론산 조추출물의 수용액과 혼합되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 염들의 수용액들에 의한 히아루론산 조추출물 수용액의 처리는 pH 5~14, 바람직하게는 pH 8~10의 조건에서 행해진다. 처리시 pH 조건이 pH 5 미만이면, 불순물의 침전이 효과적으로 이루어지지 않아, 결과적으로 히아루론산의 정제가 불충분해지는 문제점이 있다. 상기 히아루론산 조추출물 수용액은 혼합과 동시에 또는 혼합 이후에 pH 5~14의 조건에서 처리된다. "혼합과 동시에"라는 의미는, 칼슘염 수용액, 인산염 수용액 또는 인산칼슘염 수용액의 pH 조건을 pH 5~14로 미리 조절한 후에 이들 수용액과 히아루론산 조추출물 수용액을 혼합하므로써, 히아루론산 조추출물 수용액이 이들 수용액과 혼합됨과 동시에 pH 5~14의 조건 하에 놓여지는 것을 의미하며, "혼합 이후에"라는 의미는, 칼슘염 수용액, 인산염 수용액 또는 인산칼슘염 수용액과 히아루론산 조추출물 수용액을 혼합한 이후에, 그 혼합 수용액의 pH 조건을 pH 5~14로 조절하므로써, 히아루론산 조추출물 수용액이 이들 수용액과 혼합된 이후에 pH 5~14의 조건 하에 놓여지는 것을 의미한다.
상기와 같이 처리시의 pH 조건을 pH 5~14로 하기 위하여 염기성 화합물이 사용될 수 있다. 이 경우, NaOH, KOH, LiOH, NH4OH, Mg(OH)2, 트리스히드록시메틸-아미노메탄, 비스-2-히드록시에틸-아미노트리스-히드록시메틸-메탄 및 1,3-비스-[트리스-히드록시메틸]-메틸-아미노프로판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기성 화합물을 사용하는 것이 바람직하나, 상기의 물질에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 염들의 수용액들에 의한 히아루론산 조추출물 수용액의 처리시, 무기산, 유기산 또는 무기산과 유기산이 혼합된 산성의 수용액이 사용될 수 있다. 이 경우, HCl, HNO3, HF, H2SO4, HClO4, HClO, H2CO 3, CH3COOH, C2H2(COOH)2, HOOCCH2CH2COOH, CHCOCOOH 및 CH3(CH2)14COOH로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 산성 화합물을 사용하여 제조된 산성 수용액을 사용하는 것이 바람직하나, 무기산 및 유기산은 상기의 물질에 제한되는 것은 아니다.
상기 (1)단계의 처리방법에 있어서, 인산염, 칼슘염 및 인산칼슘염 수용액의 농도, 이들과 히아루론산 조추출물 수용액과의 혼합비 및 혼합 순서, pH 조절을 위한 염기성 화합물 수용액의 농도, 무기산, 유기산 또는 무기산과 유기산이 혼합된 산성의 수용액의 농도 등은 구체적인 처리과정에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 이하에서 바람직한 구체예들을 통하여 상기 (1)단계의 처리방법을 보다 상세히 설명한다.
상기 (1)단계의 처리방법의 바람직한 구체예에 있어서, 히아루론산 조추출물을 처리하는 방법은, 크게 칼슘염 및 인산염을 각각 사용하는 방법과 인산칼슘염을 사용하는 방법의 두가지로 분류될 수 있다.
먼저, 칼슘염 및 인산염을 각각 사용하는 방법에 있어서, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(NO3)2·4H2O, Ca(CH3COO)2·H2O, CaCl2, CaSO4·2H2O 등을 사용하여, 칼슘이온을 함유하고 인산이온을 함유하지 않는 수용액(제1수용액)을 제조하고, 또한, H3PO4, (NH4)2HPO4, H4P2O7, NaH2PO 4, KH2PO4 등을 사용하여, 인산이온을 함유하고 칼슘이온을 함유하지 않는 수용액(제2수용액)을 각각 제조한다. 제1수용액의 칼슘이온 농도 및 제2수용액의 인산이온 농도는 공히 0.001~10M인 것이 적당하고, 공히 0.01~2M인 것이 바람직하며, 제1수용액 및 제2수용액은 Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 사용하는 것이 바람직하고, 1.0~2.0이 되도록 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
상기와 같이 하여 제조된 제1수용액 및 제2수용액을 사용하여 히아루론산 조추출물을 처리하는 방법은, 그 처리순서에 따라 다음과 같이 다양한 방법이 적용가능하다.
첫번째 방법에서는, 상기 제1수용액에 0.05~1% 농도의 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 제1수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.001~100이 되도록, 바람직하게는 0.1~2가 되도록 하는 양으로 첨가하고, 약 10분~3시간, 바람직하게는 30분~1시간 동안 교반하여 충분히 혼합시킨다. 이어서, 상기 제1수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액과 상기 제2수용액을, 제1수용액과 제2수용액의 Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 하는 양으로 혼합한다. 이렇게 하여 제조된 제1수용액-제2수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액에, NaOH, KOH, LiOH, NH4OH, Mg(OH)2, 트리스히드록시메틸-아미노메탄, 비스-2-히드록시에틸-아미노트리스-히드록시메틸-메탄 및 1,3-비스-[트리스-히드록시메틸]-메틸-아미노프로판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기성 화합물의 수용액을, pH가 5~14, 바람직하게는 8~10이 되도록 하는 양으로 첨가하고, 약 30분~24시간, 바람직하게는 1시간~3시간 동안 교반시킨다.
두번째 방법에서는, 상기 제2수용액에 상기 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 제2수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.001~100이 되도록, 바람직하게는 0.1~2가 되도록 하는 양으로 첨가하고, 약 10분~3시간, 바람직하게는 30분~1시간 동안 교반하여 충분히 혼합시킨다. 이어서, 상기 제2수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액과 상기 제1수용액을, 농도에 따라 다소 차이가 있으나, 제1수용액과 제2수용액의 Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 하는 양으로 혼합한다. 이렇게 하여 제조된 제1수용액-제2수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액에, 상기한 바와 같은 염기성 화합물의 수용액을, pH가 5~14, 바람직하게는 8~10이 되도록 하는 양으로 첨가하고, 약 30분~24시간, 바람직하게는 1시간~3시간 동안 교반시킨다.
세번째 방법에서는, 상기 제1수용액과 제2수용액에 상기 염기성 화합물 수용액을 각각 첨가하여 pH를 공히 5~14, 바람직하게는 8~10이 되도록 조절한다. 상기와 같이 하여 pH가 조절된 제1수용액과 상기 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 제1수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.001~100이 되도록, 바람직하게는 0.1~2가 되도록 하는 양으로 혼합하고, 이어서 상기 제2수용액을, 제1수용액과 제2수용액의 Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 하는 양으로 혼합하거나, 또는, 상기와 같이 하여 pH가 조절된 제2수용액과 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 제2수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.001~100이 되도록, 바람직하게는 0.1~2가 되도록 하는 양으로 혼합하고, 이어서 상기 제1수용액을, 제1수용액과 제2수용액의 Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 하는 양으로 혼합한다. 이렇게 하여 제조된 제1수용액-제2수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액을 약 30분~24시간, 바람직하게는 1시간~3시간 동안 교반시킨다.
또는, 제1수용액과 제2수용액에 상기 히아루론산 조추출물 수용액을 각각 첨가한 후, 상기 염기성 화합물 수용액을 이용하여 pH를 공히 5~14, 바람직하게는 8~10이 되도록 조절하고, 제1수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액과 제2수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액을 혼합하는 방법도 가능하다.
네번째 방법에서는, 상기 제1수용액과 제2수용액을 Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 하는 양으로 혼합한 수용액에 상기 염기성 화합물 수용액을 첨가하여 pH를 5~14, 바람직하게는 8~10이 되도록 조절한 후에 10분~24시간 동안 혼합 한다. 이렇게 하여 준비된 제1수용액-제2수용액의 혼합 수용액에 상기 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 제1수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.001~100이 되도록, 바람직하게는 0.1~2가 되도록 하는 양으로 첨가, 혼합하고, 이를 약 30분~24시간, 바람직하게는 1시간~3시간 동안 교반시킨다.
또한, 칼슘염 및 인산염을 각각 사용하는 방법에 있어서, 무기산, 유기산 또는 무기산과 유기산이 혼합된 산성의 수용액이 다음과 같이 사용가능하다.
무기산, 유기산 또는 무기산과 유기산이 혼합된 산성의 수용액을 사용하는 방법 중 첫번째 방법에서는, HCl, HNO3, HF, H2SO4, HClO4, HClO, H2CO3, CH3COOH, C2H2(COOH)2, HOOCCH2CH2COOH, CHCOCOOH 및 CH3 (CH2)14COOH로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 산성 화합물로 제조된 농도 0.01~10M, 바람직하게는 0.1~2M의 산성 수용액에 칼슘이온을 첨가시킨다. 산성 수용액 중의 칼슘이온의 농도는 0.001~10M인 것이 적당하고, 0.01~2M인 것이 바람직하다. 칼슘이온의 첨가는, 상기 제1수용액을 제조하여 첨가하거나, 또는 제1수용액을 제조하기 위한 칼슘염을 직접 산성 수용액에 용해시키므로써 가능하다.
이렇게 하여 준비된 칼슘이온 함유 산성 수용액에 상기 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 칼슘이온 함유 산성 수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.001~100이 되도록, 바람직하게는 0.1~2가 되도록 하는 양으로 혼합하고, 약 10분~5시간, 바람직하게는 30분~1시간 동안 교반시킨다. 이렇게 하여 준비된 칼슘이온 함유 산성 수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액에 상기 제2수용액을, Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 하는 양으로 혼합하고 충분히 교반시킨다. 또는, 히아루론산 조추출물 수용액을 제2수용액에 혼합한 후에, 이를 상기 칼슘이온 함유 산성 수용액과 혼합하여도 무방하다.
상기와 같이 하여 준비된 칼슘이온 함유 산성 수용액-제2수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액의 pH를, 상기 염기성 화합물 수용액을 이용하여 5~14, 바람직하게는 8~10으로 조절하고, 30분~24시간, 바람직하게는 1~3시간 동안 교반한다.
또는, 칼슘이온 함유 산성 수용액과 제2수용액을 혼합하기 이전에 염기성 화합물의 수용액을 이용하여 각각의 pH를 5~14로 조절한 이후에 혼합하거나, 칼슘이온 함유 산성 수용액과 제2수용액을 혼합하고 염기성 화합물의 수용액을 이용하여 pH를 5~14로 조절한 이후에, 그 혼합 수용액에 히아루론산 조추출물 수용액을 첨가하여도 무방하다.
무기산, 유기산 또는 무기산과 유기산이 혼합된 산성의 수용액을 사용하는 방법 중 두번째 방법에서는, 상기한 바와 같이 제조된 산성 수용액에 인산이온을 첨가시킨다. 산성 수용액 중의 인산이온의 농도는 0.001~10M인 것이 적당하고, 0.01~2M인 것이 바람직하다. 인산이온의 첨가는, 상기 제2수용액을 제조하여 첨가하거나, 또는 제2수용액을 제조하기 위한 인산염을 직접 산성 수용액에 용해시키므로써 가능하다.
이렇게 하여 준비된 인산이온 함유 산성 수용액에 상기 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 인산이온 함유 산성 수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.001~100이 되도록, 바람직하게는 0.1~2가 되도록 하는 양으로 혼합하고, 약 10분~5시간, 바람직하게는 30분~1시간 동안 교반시킨다. 이렇게 하여 준비된 인산이온 함유 산성 수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액에 상기 제1수용액을, Ca/P 몰(mole) 비가 0.5~3.0이 되도록 하는 양으로 혼합하고 충분히 교반시킨다. 또는, 히아루론산 조추출물 수용액을 제1수용액에 혼합한 후에, 이를 상기 인산이온 함유 산성 수용액과 혼합하여도 무방하다.
상기와 같이 하여 준비된 인산이온 함유 산성 수용액-제1수용액-히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액의 pH를, 상기 염기성 화합물 수용액을 이용하여 5~14, 바람직하게는 8~10으로 조절하고, 30분~24시간, 바람직하게는 1~3시간 동안 교반한다.
또는, 인산이온 함유 산성 수용액과 제1수용액을 혼합하기 이전에 염기성 화합물의 수용액을 이용하여 각각의 pH를 5~14로 조절한 이후에 혼합하거나, 인산이온 함유 산성 수용액과 제1수용액을 혼합하고 염기성 화합물의 수용액을 이용하여 pH를 5~14로 조절한 이후에, 그 혼합 수용액에 히아루론산 조추출물 수용액을 첨가하여도 무방하다.
다음으로, 인산칼슘염을 사용하여 처리하는 방법에 있어서, 구체적인 처리방법은 다음과 같다.
첫번째 방법에서는, 상기 [표 2]에 나타낸 바와 같은 인산칼슘 화합물 중 하나 또는 둘이상을 상기 산성 수용액에 용해시킨다. 산성 수용액의 농도는 0.01~10M이 적당하며, 0.1~2M이 바람직하다.
이렇게 하여 제조된 칼슘이온-인산이온 함유 산성 수용액과 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 칼슘이온-인산이온 함유 산성 수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.1~20이 되도록, 바람직하게는 0.5~2가 되도록 하는 혼합비로 혼합하고, 10분~3시간, 바람직하게는 30분~1시간 동안 충분히 교반한다. 교반이 충분히 된 이후에, 교반을 계속하면서 상기 염기성 화합물 수용액을, pH가 5~14, 바람직하게는 8~10이 되도록 첨가하고, 30분~24시간, 바람직하게는 1~3시간 동안 교반하여 침전을 형성시킨다.
인산칼슘염을 사용하는 방법에 있어서, 두번째 방법에서는, 칼슘이온-인산이온 함유 산성 수용액에 상기 염기성 화합물 수용액을, pH가 5~14, 바람직하게는 8~10이 되도록 첨가하고, 상기 히아루론산 조추출물 수용액을, 부피비로 칼슘이온-인산이온 함유 산성 수용액/히아루론산 조추출물 수용액이 0.1~20이 되도록, 바람직하게는 0.5~2가 되도록 하는 혼합비로 혼합한 후, 30분~24시간, 바람직하게는 1~3시간 동안 교반시킨다.
본 발명의 히아루론산의 정제방법에 있어서, 상기 (2)단계에서는, 상기 (1)단계의 결과 얻어진 침전물 함유 수용액을 여과하고, 여과액으로부터 히아루론산을 침전시켜 정제된 히아루론산을 얻는다. 여과의 방법에는 특별한 제한이 없으며, 맑은 용액이 될 때까지 여과한다. 원심분리기를 사용하여 원심분리를 행한 후, 맑은 용액이 될 때까지 여과하는 방법도 사용가능하다. 맑게 여과된 용액 내에 존재할 수 있는 이온들을 제거하기 위하여, 한외여과나 투석을 행하는 것이 바람직하다.
상기 (1)단계의 결과 얻어진 침전물 함유 수용액은 염기성 수용액인 바, 이 어지는 (2)단계에서 히아루론산이 효과적으로 침전되게 하기 위해서는 수용액이 산성 내지 약염기성인 것이 바람직하다. 따라서 상기와 같은 여과를 통해 얻은 맑은 용액에, 예를 들면, 상기한 바와 같은 산성의 수용액을 가하여 산성 내지 약염기성이 되도록 그 pH를 조절한다.
또한, 여과액으로부터 히아루론산을 침전시키기 위해서는, 물에 비하여 히아루론산의 용해도가 현저히 낮은 용매를 사용하며, 에탄올이 적당하다. 또한, 히아루론산의 침전 시에 공통이온 효과에 의해 침전이 효과적으로 일어날 수 있도록 수용성 중성염을 첨가할 수도 있다.
이하에서 바람직한 구체예를 통하여 상기 (2)단계를 보다 상세히 설명한다.
상기 (2)단계의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 (1)단계의 결과 얻어진 침전물 함유 수용액을 원심분리한 후 여과하여 얻은 맑은 용액에, 상기 산성의 수용액을 가하여 그 pH를 2~10, 바람직하게는 4.0~7.0으로 조절하고, 한외여과나 투석을 행한다. 한외 여과나 투석을 하여 얻어진 용액에, 0.3~1M, 바람직하게는 0.5~1M 농도가 되도록 NaCl을 정량하여 용해시키고, NaCl을 용해시킨 용액에 95% 에탄올을 부피비로 1~2배 정도 첨가하므로써 히아루론산을 침전시킨다. 침전시킨 히아루론산을 여과한 다음, 여과된 히아루론산을 95% 에탄올로 세척하고, 무기산, 유기산 또는 무기산과 유기산을 혼합하여 pH를 1~5로 조절한 70~90% 에탄올에서 30분~5시간, 바람직하게는 30분~1시간 동안 서서히 교반시키므로써 세척한다. 교반이 완료된 후, 침전물을 여과 및 수거한 후, 동결건조 또는 감압건조를 행하므로써, 정제된 히아루론산을 얻을 수 있다.
본 발명의 히아루론산의 정제방법은, 보다 고순도의 히아루론산을 얻기 위하여, 상기 (2)단계의 결과 얻어진 히아루론산을, 상기 (1)단계의 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하는 단계 및 그 처리 결과물을 여과한 후, 이로부터 히아루론산을 침전시켜 정제하는 단계로 이루어진 추가정제단계를, 상기 (2)단계 이후에 1회 이상 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 (2)단계에서 여과 및 수거된 히아루론산에 대하여 상기 추가정제단계를 1회 이상 반복한 후에, 수거된 침전물의 동결건조 또는 감압건조를 통해 보다 고순도로 정제된 히아루론산을 얻을 수 있다
본 발명의 히아루론산의 정제방법은, 닭벼슬 이외의 천연물 및 미생물로부터 유래된 히아루론산의 정제에 적용가능하며, 단백질, 핵산 또는 지질의 정제에도 또한 적용가능하다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하나, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하의 실시예에서와 같이 닭벼슬에서 히아루론산을 추출하는 경우에는, 사용되는 닭벼슬의 크기에 따라 히아루론산의 수율이 크게 차이를 보일 수 있다.
실시예 1
전처리: 히아루론산 함유 천연물인 닭벼슬을 단백질 분해효소로 처리하여 히아루론산 조추출물을 얻는 단계
평균 면적[=(가로 평균×세로 평균)÷2]이 약 5㎠인 닭벼슬 1kg을 50℃에서 해동하고, 해동한 후에 분쇄하였다. 분쇄한 닭벼슬을 70% 에탄올로 깨끗이 세척한 후에 재분쇄하였다. 재분쇄한 닭벼슬을 95% 에탄올로 수차례 세척하였다. 세척이 완료된 후, 3000mL의 증류수를 50℃의 온도로 유지시킨 후, 분쇄한 닭벼슬을 넣고, 단백질 분해 효소를 첨가한 후에, 24시간 동안 처리하였다. 처리가 끝난 후, 분리되는 상층의 지질층은 버리고, 하부의 추출액만을 취하여 여과하였다. 여과된 하부의 추출액을 37℃의 온도로 가열하고, 이어서 단백질 분해 효소를 첨가한 후에, 12시간 동안 2차 처리하였다. 2차 처리가 끝난 후, 맑은 용액을 얻을 때까지 여과하여, 히아루론산 추출액을 얻었다. 이 추출액에 0.5M 농도가 되도록 NaCl을 정량하여 첨가하고, 95% 에탄올 중에서 히아루론산을 침전시켰다. 침전된 히아루론산을 여과하여 분리한 후, 동결건조 또는 감압건조를 실시하여, 백색 분말의 히아루론산 조추출물을 얻었다.
(1) 히아루론산 조추출물 분말을 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하는 단계
상기 전처리 단계에서 얻어진 히아루론산 조추출물 분말 1g을 증류수 1000mL에 용해시켜 0.1% 히아루론산 조추출물 수용액을 제조하였다. Ca(NO3)2·4H2O 수용액을 0.167M 농도로 제조하고, (NH4)2HPO4 수용액을 0.1M 농도로 제조하였다. 0.1% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL에 0.167M 농도의 Ca(NO3)2·4H2O 수용액을 500mL 첨가하고 혼합하였다. 충분하게 혼합된 수용액에 0.1M 농도의 (NH4)2HPO4 수용액을 Ca(NO3)2·4H2O 수용액의 첨가량과 동일하게 500mL 첨가하고 혼합하였다. 혼합된 0.1% 히아루론산 조추출물-Ca(NO3)2·4H2O-(NH4)2 HPO4 수용액을 교반하면서 NaOH 를 첨가하여 pH가 10이 되도록 조절하였다. pH를 조절한 후에 3시간 동안 교반하였다.
(2) 상기 (1)단계의 결과물을 여과한 후, 이로부터 히아루론산을 침전시켜 정제하는 단계
상기 (1)단계에서 얻어진 혼합 수용액을, 맑은 용액이 될 때까지 원심분리하고, 여과하였다. 얻어진 맑은 용액에 HCl을 가하여 pH가 5가 되도록 조절하고, 한외여과 또는 투석을 행하여 다시 맑은 용액을 얻어내었다. 여기에 NaCl을 0.5M 농도가 되도록 용해시킨 후, 95% 에탄올 중에서 히아루론산을 침전시켰다. 침전된 히아루론산을 여과하여 분리하고, 이를 pH가 4로 조절된 70% 에탄올에 가하여 30분 동안 서서히 교반시킨 후, 이를 여과하여 분리하고 동결건조 또는 감압건조하여, 1차 정제된 히아루론산을 얻었다.
얻어진 1차 정제 히아루론산을 증류수에 재용해하고, 상기 (1) 및 (2)단계를 1회 반복하므로써 2차 정제된 히아루론산을 얻었다.
실시예 2
(1)단계에 있어서, 0.1% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL에, 0.1M 농도의 (NH4)2HPO4 수용액을 250mL 첨가하여 충분히 혼합하고, 여기에 0.167M의 Ca(NO3)2·4H2O 수용액을 0.1M 농도의 (NH4)2HPO4 수용액의 첨가량과 동일하게 첨가 혼합한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 히아루론산을 정제하였다.
실시예 3
하기의 (1)단계를 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 히아루론산을 정제하였다.
(1)단계에 있어서, 실시예 1의 전처리 단계에서 얻어진 히아루론산 조추출물 분말을 증류수에 용해하여 0.2% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL를 제조하였다. 0.85M 농도의 Ca(OH)2 수용액을 제조하고, 0.5M 농도의 H3PO4 수용액을 제조하였다. 제조된 Ca(OH)2 및 H3PO4 수용액에 NH4OH 수용액을 가하여, pH가 11이 되도록 조절하였다. 0.2% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL에 상기 pH가 조절된 Ca(OH)2 수용액을 300mL 첨가하여 혼합하고, Ca(OH)2 수용액의 첨가량과 동일한 양의 0.5M H3PO4 수용액을 첨가하고 혼합하였다. 혼합된 0.2% 히아루론산 조추출물-Ca(OH)2-H3PO4 수용액을 1시간 동안 교반하였다.
실시예 4
(1)단계에 있어서, 0.2% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL에, 상기 pH가 조절된 0.5M 농도의 H3PO4 수용액을 500mL 첨가하여 혼합하고, 여기에 0.875M 농도의 Ca(OH)2 수용액을 0.5M 농도의 H3PO4 수용액의 첨가량과 동일하게 첨가 혼합한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 히아루론산을 정제하였다.
실시예 5
하기의 (1)단계를 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 히아루론산을 정제하였다.
(1)단계에 있어서, 실시예 1의 전처리 단계에서 얻어진 히아루론산 조추출물 분말을 증류수에 용해하여 0.2% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL를 제조하였다. 0.3M 농도의 HCl 수용액에, CaCO3를 17mM 농도가 되도록 용해시켜 칼슘이온 함유 HCl 수용액을 제조하고, 10mM의 H3PO4 수용액과 10mM의 (NH4)2HPO 4 수용액을 각각 제조하였다. 0.2% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL에, 상기 칼슘이온 함유 HCl 수용액을 1000mL 첨가하여 혼합하고, 10mM의 H3PO4 수용액과 10mM의 (NH4) 2HPO4 수용액을 각각 1000mL 첨가하고 혼합하였다. 충분하게 혼합된 결과 수용액에 NH4OH를 첨가하여 pH가 10이 되도록 조절하였다. pH를 조절한 후에, 3시간 동안 교반하였다.
실시예 6
하기의 (1)단계를 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 히아루론산을 정제하였다.
(1)단계에 있어서, 실시예 1의 전처리 단계에서 얻어진 히아루론산 조추출물 분말을 증류수에 용해하여 0.2% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL를 제조하였다. 0.2M 농도의 HCl 수용액을 제조하고, 여기에 인산칼슘 화합물로서 옥타칼슘 포스페이트(octacalcium phosphate)를 2g 첨가하여 용해시켰다. 제조된 인산칼슘-HCl 수용액 1000mL에 0.2% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL를 첨가하고, 충분히 혼합되도록 교반하면서 여기에 NaOH를 첨가하여 pH가 9가 되도록 조절하였다. pH를 조절한 후에, 3시간 동안 교반하였다.
실시예 7
하기의 (1)단계를 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 히아루론산을 정제하였다.
(1)단계에 있어서, 실시예 1의 전처리 단계에서 얻어진 히아루론산 조추출물 분말을 증류수에 용해하여 0.3% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL를 제조하였다. 0.2M 농도의 HCl 및 1M 농도의 CH3COOH 수용액을 각각 제조하고, 각각의 농도의 HCl 수용액과 CH3COOH 수용액을, 0.2M HCl:1M CH3COOH의 부피비가 1:4가 되도록 하는 양으로 혼합하여 유기산-무기산 혼합 산성 수용액을 제조하였다. 제조된 혼합 산성 수용액에, 인산칼슘 화합물로서 디칼슘 포스페이트 무수물(Dicalcium Phosphate Anhydrate, DCPA)을 4g 첨가하여 용해시켰다. 0.3% 히아루론산 조추출물 수용액 1000mL에, 제조된 인산칼슘-산성 수용액을 1000mL 첨가하고, 충분히 혼합되도록 교반하면서 여기에 NH4OH를 첨가하여 pH가 10이 되도록 조절하였다. pH를 조절한 후에, 1시간 동안 교반하였다.
실시예 8
히아루론산 조추출물 수용액으로서 미생물에서 얻어진 히아루론산 함유 배양액을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1의 (1) 및 (2)단계와 동일한 방법으로 히아루론산을 정제하였다.
하기의 [표 3] 및 [표 4]는, 본 발명의 실시예 1~8에 의해 정제된 히아루론산의, 식약청 고시 히아루론산(안과용)시험 방법 및 그에 따른 분석결과를 각각 나타낸 표이다.
[표 3] 식약청 고시 히아루론산(안과용)시험 방법
항목 시험법
함량 카르바졸 시험법 (Anal. Biochem. 4, 330 (1962))
단백질 로우리법(Lowry's method)
다른 산성 뮤코다당류 전기영동법 (일본 생화학회지38, 479 (1966))
점도 브룩필드 III + 스핀 LV3, 12rpm, 25℃
[표 4] 실시예 1~8에 의해 정제된 히아루론산 분석결과
함량 단백질 다른 산성 뮤코다당류 점도 (0.5% 수용액)
실시예 1 90% 이상 0.02% 미만 불검출 2400cp 이상
실시예 2 90% 이상 0.02% 미만 불검출 2400cp 이상
실시예 3 90% 이상 0.02% 미만 불검출 2400cp 이상
실시예 4 90% 이상 0.02% 미만 불검출 2400cp 이상
실시예 5 90% 이상 0.02% 미만 불검출 2400cp 이상
실시예 6 90% 이상 0.02% 미만 불검출 2400cp 이상
실시예 7 90% 이상 0.02% 미만 불검출 2400cp 이상
실시예 8 90% 이상 0.02% 미만 불검출 2400cp 이상
본 발명에 따른 히아루론산 정제방법은 히아루론산 함유 추출액 및 배양액으로부터 히아루론산을 고순도로 신속하게 정제할 수 있는 특성을 가지며, 단백질, 핵산, 지질 등을 매우 효율적으로 제거할 수 있다. 또한, 기존의 유기용매를 사용한 정제방법의 단점을 극복하고, 공정을 단순화하여 대량생산에 적합한 공정의 설계가 가능하도록 하며, 또한 높은 수율을 보장한다. 본 발명에 따른 정제방법에 의해 정제된 히아루론산은 순도 99.9% 이상의 높은 순도를 가지게 되며, 의료용 히아루론산으로 사용되기에 적합하다.

Claims (31)

  1. (1) 히아루론산 함유 천연물을 단백질 분해효소로 처리하여 얻어지거나 또는 미생물로부터 유래된 히아루론산 함유 배양액으로부터 얻어지는 히아루론산 조추출물을 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하는 단계, 및
    (2) 상기 (1)단계의 처리 결과물을 여과한 후, 이로부터 히아루론산을 침전시켜 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 히아루론산의 정제방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1)단계에서 히아루론산 함유 천연물로서 닭벼슬을 30~60℃의 온도에서 3~72시간 동안 단백질 분해효소로 처리하고 정치하여 지질층을 분리, 제거하므로써 히아루론산 조추출물을 얻는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 칼슘염은 Ca(OH)2, CaCO3, Ca(NO3)2·4H 2O, Ca(CH3COO)2·H2O, CaCl2 및 CaSO4·2H2O로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인산염은 H3PO4, (NH4)2HPO4, H4P2O7, NaH2PO4 및 KH2PO4로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정 제방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 칼슘염과 인산염의 사용비는 Ca/P가 몰비로 0.5~3.0인 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인산칼슘염은 테트라칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 비화학양론적 히드록시아파타이트, 비정형 칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트, 옥타칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 이수화물, 디칼슘 포스페이트 무수화물, 칼슘 피로포스페이트, 칼슘 피로포스페이트 이수화물, 헵타칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 이수소 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트 일수화물 및 칼슘 메타포스페이트로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (1)단계에서 상기 히아루론산 조추출물은 수용액의 형태로 처리되고, 상기 인산염 및 칼슘염, 또는 인산칼슘염은 수용액으로서 상기 히아루론산 조추출물 수용액과 혼합되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 인산염 수용액, 칼슘염 수용액 및 인산칼슘염 수용액 중의 적어도 하나는 산성 수용액으로서 상기 히아루론산 조추출물 수용액과 혼합되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 산성 수용액은 HCl, HNO3, HF, H2SO4, HClO4 , HClO, H2CO3, CH3COOH, C2H2(COOH)2, HOOCCH 2CH2COOH, CHCOCOOH 및 CH3(CH2)14COOH로부터 하나 이상 선택되는 산을 포함하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 히아루론산 조추출물 수용액은 혼합과 동시에 또는 혼합 이후에 pH 5~14의 조건에서 처리되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 pH 5~14의 조건을 만들기 위하여 염기성 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 염기성 화합물은 NaOH, KOH, LiOH, NH4OH, Mg(OH)2, 트리스히드록시메틸-아미노메탄, 비스-2-히드록시에틸-아미노트리스-히드록시메틸-메탄 및 1,3-비스-[트리스-히드록시메틸]-메틸-아미노프로판으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (1)단계에서 칼슘염의 공급원으로는 칼슘이온을 함유하고 인산이온을 함유하지 않는 수용액(제1수용액)을 사용하고, 인산염의 공급원으 로는 인산이온을 함유하고 칼슘이온을 함유하지 않는 수용액(제2수용액)을 사용하여 상기 히아루론산 조추출물의 수용액을 처리하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1수용액의 칼슘이온 농도와 제2수용액의 인산이온 농도는 각각 0.001~10M이고, 상기 칼슘염과 인산염의 사용비는 Ca/P가 몰비로 0.5~3.0인 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제1수용액과 상기 제2수용액 중 적어도 하나는 HCl, HNO3, HF, H2SO4, HClO4, HClO, H2CO3, CH3COOH, C2H2(COOH)2, HOOCCH2CH2COOH, CHCOCOOH 및 CH3(CH2)14COOH로부터 하나 이상 선택되는 산을 포함하는 산성 수용액인 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 제1수용액과 상기 히아루론산 조추출물 수용액을 혼합한 수용액에 상기 제2수용액을 첨가(제1혼합방법)하거나, 또는
    상기 제2수용액과 상기 히아루론산 조추출물 수용액을 혼합한 수용액에 상기 제1수용액을 첨가(제2혼합방법)하거나, 또는
    상기 제1수용액과 상기 제2수용액에 상기 히아루론산 조추출물 수용액을 각각 첨가한 수용액들을 혼합(제3혼합방법)하거나, 또는
    상기 제1수용액과 상기 제2수용액의 혼합 수용액에 상기 히아루론산 조추출물 수용액을 첨가(제4혼합방법)하므로써, 제1수용액과 제2수용액과 히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액을 만들어서 상기 히아루론산 조추출물의 수용액을 처리하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1수용액, 제2수용액, 제1수용액과 히아루론산 조추출물 수용액을 혼합한 수용액, 제2수용액과 히아루론산 조추출물 수용액을 혼합한 수용액, 제1수용액과 제2수용액의 혼합 수용액 및 제1수용액과 제2수용액과 히아루론산 조추출물 수용액의 혼합 수용액 중에서 적어도 하나는 pH가 5~14로 조절되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 pH 5~14의 조건을 만들기 위하여 NaOH, KOH, LiOH, NH4OH, Mg(OH)2, 트리스히드록시메틸-아미노메탄, 비스-2-히드록시에틸-아미노트리스-히드록시메틸-메탄 및 1,3-비스-[트리스-히드록시메틸]-메틸-아미노프로판으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 염기성 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 제1혼합방법 또는 제3혼합방법에서의 상기 제1수용액과 히아루론산 조추출물 수용액의 혼합비(제1수용액 부피/히아루론산 조추출물 수용액 부피) 또는
    상기 제2혼합방법 또는 제3혼합방법에서의 상기 제2수용액과 히아루론산 조추출물 수용액의 혼합비(제2수용액 부피/히아루론산 조추출물 수용액 부피) 또는
    상기 제4혼합방법에서의 상기 제1수용액과 제2수용액의 혼합 수용액과 히아루론산 조추출물 수용액의 혼합비(제1수용액과 제2수용액의 혼합 수용액 부피/히아루론산 조추출물 수용액 부피)는 모두 0.001~100인 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 (1)단계에서 테트라칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 비화학양론적 히드록시아파타이트, 비정형 칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트, 옥타칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 이수화물, 디칼슘 포스페이트 무수화물, 칼슘 피로포스페이트, 칼슘 피로포스페이트 이수화물, 헵타칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 이수소 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트 일수화물 및 칼슘 메타포스페이트로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 인산칼슘염의 수용액을 상기 히아루론산 조추출물의 수용액과 혼합하여 처리하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 인산칼슘염의 수용액은 HCl, HNO3, HF, H2SO4, HClO 4, HClO, H2CO3, CH3COOH, C2H2(COOH)2, HOOCCH2CH2COOH, CHCOCOOH 및 CH3(CH2)14COOH로부터 하나 이상 선택되는 산을 포함하는 산성 수용액인 것을 특징으로 하는 히아루론 산의 정제방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 히아루론산 조추출물 수용액은 상기 인산칼슘염의 수용액과의 혼합과 동시에 또는 혼합 이후에 pH 5~14의 조건에서 처리되는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 pH 5~14의 조건을 만들기 위하여 NaOH, KOH, LiOH, NH4OH, Mg(OH)2, 트리스히드록시메틸-아미노메탄, 비스-2-히드록시에틸-아미노트리스-히드록시메틸-메탄 및 1,3-비스-[트리스-히드록시메틸]-메틸-아미노프로판으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 염기성 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 인산칼슘염의 수용액과 상기 히아루론산 조추출물 수용액의 혼합비(인산칼슘염 수용액 부피/히아루론산 조추출물 수용액 부피)는 0.1~20인 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 (2)단계에서, 상기 (1)단계의 처리 결과물을 맑은 용액을 얻을 때까지 원심분리하고, 여과하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 원심분리 및 여과로 얻어진 맑은 용액에 무기산이나 유기산 또는 무기산과 유기산을 혼합한 산성 수용액을 첨가하여 pH를 2~10으로 조절하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 (2)단계에서 상기 (1)단계의 처리 결과물을 여과한 후, 이로부터 히아루론산을 에탄올을 사용하여 침전시키는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 히아루론산의 침전시 침전이 일어나는 용액에 수용성 중성염을 첨가하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 (2)단계에서 상기 (1)단계의 처리 결과물을 여과한 후, 이로부터 침전된 히아루론산을 에탄올로 세척하고, 이어서 pH가 1~5로 조절된 70~90% 에탄올에서 다시 세척하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 (2)단계의 결과 얻어진 히아루론산을, 상기 (1)단계의 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하는 단계 및 그 처리 결과물을 여과한 후, 이로부터 히아루론산을 침전시켜 정제하는 단계로 이루어진 추가정제단계를, 상기 (2)단계 이후에 1회 이상 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 (1)단계에서 4~90℃의 온도 범위에서 히아루론산 조추출물을 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염으로 처리하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제방법.
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